GB/T 47145-2026 重组蛋白试剂 亲和力测定方法

　　ICS 07. 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 47145—2026

　　重组蛋白试剂 亲和力测定方法

　　Recombinantprotein reagents—Determination method ofaffinity

　　2026-01-28发布 2026-05-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 47145—2026

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国计量大学 、华大工程生物学长荡湖研究所 、北京百普赛斯生物科技股份有限公司 、中国测试技术研究院 、中国食品药品检定研究院 、上海市计量测试技术研究院有限公司 、浙江康佰裕生物科技有限公司 、江苏百英生物科技有限公司 、中国食品发酵工业研究院有限公司 、常州新一产生命科技有限公司 、杭州华大赛迪斯逆熵科技有限责任公司 、北京华放天实生物制药有限责任公司 、北京泰德制药股份有限公司 、北京索莱宝科技有限公司 、国健药业(深圳)集团有限公司 、云南师范大学 、中国计量测试学会 、中国测试技术研究院生物研究所 。

　　本文件主 要 起 草 人 : 张 雅 芬 、王 媚 娘 、陈 宜 顶 、叶 子 弘 、周 李 华 、苗 景 赟 、李 俊 芳 、郭 世 富 、李 兰 英 、杨文君 、项鲁 、高波 、葛平菊 、石晓娟 、姜万龙 、费琦 、郑越 、熊思驰 、刘茜 、朱艳泽 、王然 、吴骏成 、陈怡晨 、杨芸芸 、孙丽芹 、孔雪 、李维 、马玉岭 、戴继海 、李富昌 、杨扬仲夫 、王彧婕 、刘和春 。

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　　重组蛋白试剂 亲和力测定方法

　　1 范围

　　本文件描述了重组蛋白试剂亲和力的酶联免疫吸附测定方法 。

　　本文件适用于细胞因子 、抗体和抗原等重组蛋白试剂的亲和力测定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 40265 酶免疫检测抗体检测通则

　　3 术语和定义、缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1. 1

　　重组蛋白试剂 recombinantprotein reagent

　　通过重组 DNA等技术在宿主表达系统中表达的蛋白质经纯化后制备的试剂 。

　　注 : 重组蛋白试剂 ,如细胞因子 、抗体和抗原等 ,广 泛 用 于 科 研 、诊 断 或 工 业 用 途 。 宿 主 表 达 系 统 包 括 大 肠 杆 菌 、酵母 、昆虫细胞 、哺乳动物细胞或其他细胞 。

　　3. 1.2

　　亲和力 affinity

　　在特定条件下 ,重组蛋白与其靶标之间单一结合位点的相互作用强度 。

　　注 : 亲和力通常以平衡解离常数(KD )表示 ,单位为摩尔每升(mol/L) 。

　　3. 1.3

　　靶标 target

　　在特定条件下 ,能被重组蛋白特异性识别并结合的分子 。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　BSA:牛血清白蛋白(bovine serum albumin)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　ELISA:酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay)

　　KD:平衡解离常数(equilibrium dissociation constant)

　　OPD:邻苯二胺二盐酸盐(o-phenylenediamine dihydrochloride)

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　　PBS:磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline)

　　RP-HPLC:反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography)

　　SDS-PAGE:十二烷 基 硫 酸 钠 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

　　SPR:表面等离子体共振(surface plasmon resonance)

　　TMB:3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)

　　4 一般要求

　　4. 1 除非另有说明 ,测试中试剂均为分析纯以上 ,水应符合 GB/T 6682的规定 。

　　4.2 试剂应根据说明书要求保存及配制 ,测定前应根据试剂说明书或产品质量报告验证试剂质量 , 以避免试剂性能改变影响试验结果 。

　　4.3 应采用标准品/参考品或文献等资料记载具有量值的样品作为阳性样品 。检测时应包含阴性对照(无结合活性的蛋白) 。

　　4.4 含蛋白的样品及废液处理应符合 GB 19489的规定 。

　　5 原理

　　酶联免疫吸附法通过将靶标固定于固相载体表面 ,与待测样品在溶液中结合形成免疫复合物 ,并用酶标抗体进行检测 。通过测定不同浓度样品平衡结合下的吸光度值 ,绘制结合曲线 ,采用非线性回归法拟合计算得到平衡解离常数(KD )来表示亲和力大小 。

　　6 试剂与材料

　　6. 1 靶标

　　根据应用 需 求 选 择 待 测 样 品的 靶 标 , 需 经 过 理 化 分 析 (SDS-PAGE 或 RP-HPLC) 和 活 性 验 证(ELISA或 SPR) ,确保其纯度及结合活性 。

　　6.2 包被液

　　根据待包被靶标特性选择适宜的包被液 。

　　注 : 包被液如 pH 为 9. 6 的 0. 05 mol/L碳酸盐缓冲液 。

　　6.3 稀释液

　　根据待测样品特性选择适宜 pH 的 PBS或其他等效缓冲溶液 ,可加入少量蛋白和少量表面活性剂以保护待测样品中 目标物的活性并减少背景干扰 。

　　注 : 蛋白如 0. 01 g/mL 的 BSA;表面活性剂如体积分数为 0. 05%的吐温-20(Tween-20) 。

　　6.4 洗涤缓冲液

　　选择含有适量表面活性剂的 PBS或其他等效缓冲溶液 。

　　注 : 表面活性剂如体积分数为 0. 05%的吐温-20(Tween-20) 。

　　6.5 封闭液

　　选择含有较高浓度蛋白的 PBS或其他等效缓冲溶液 。

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　　注 : 较高浓度蛋白如 0. 02 g/mL~ 0. 05 g/mL 的 BSA。

　　6.6 显色工作液

　　根据不同的显色系统以及不同指标(动态范围 、动力学速率和检测时间等)选择适宜的显色底物 ,配制或购买相应的显色工作液 。

　　注 : 显色底物如 TMB和 OPD。

　　6.7 终止液

　　根据测定范围的需求选择合适的终止液 。

　　注 : 终止液如 1 mol/L硫酸 。

　　6. 8 酶标抗体

　　酶标抗体应按 GB/T 40265的规定进行检测 ,应选择与所检测样品种属来源相匹配的特异性抗体 ,并通过预实验确定最佳稀释倍数 。

　　7 仪器与设备

　　7. 1 天平 :分度值为 0. 01 g、0. 001 g 和 0. 000 1 g。

　　7.2 pH 计 :0. 01级 。

　　7.3 恒温孵育器 :温度范围应覆盖 37 ℃ ,控温最大允许误差 ±1 ℃ 。

　　7.4 微孔板自动洗板机 :具备自动化清洗功能 。

　　7.5 酶标板 :选择高结合力的 ELISA板(96孔或其他规格) ,根据实验需要进行涂层 。

　　7.6 酶标仪 :具备吸光度 、化学发光或荧光强度等光学信号的检测功能 。

　　7.7 各种规格的离心管 。

　　7. 8 各种规格的微量移液器 。

　　7.9 数据处理软件 :如 GraphPad Prism。

　　8 测定步骤

　　8. 1 靶标包被

　　8. 1. 1 包被固定靶标

　　用适量包被液稀释靶标至合适浓度(通常为 1 μg/mL~ 10 μg/mL,可经 8. 2 验证) , 以每孔 100 μL的量将稀释好的靶标溶液加至酶标板中 ,37 ℃恒温孵育 2 h~ 3 h 或者 4 ℃恒温孵育 12 h~ 16 h(可经8. 2 验证) 。

　　8. 1.2 清洗

　　弃去酶标板中的液体 ,使用微孔板自动洗板机对酶标板进行清洗 ,清洗过程重复 3 次 ~ 5 次 。 清洗结束后 ,将酶标板倒置于吸水纸上轻拍 ,确保孔内无残留液体 。

　　8. 1.3 封闭

　　加入足量的封闭液至酶标板中 ,37 ℃恒温孵育 1. 0 h~ 1. 5 h。

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　　8. 1.4 清洗

　　重复步骤 8. 1. 2。

　　8.2 包被的靶标浓度和时间验证(可选)

　　将梯度稀释的待测样品溶液以每孔 100 μL的量分别加至不同浓度靶标的包被板中 ,按 8. 4 和 8. 5进行亲和力测定和结果分析 ,计算信噪比(阳性孔均值与阴性孔均值的比值) 和变异系数 。若信噪比大于或等于 10,变异系数小于或等于 10% ,则说明该包被的靶标浓度符合要求 。必要时 ,绘制 “包被浓度-吸光度值 ”曲线 ,优先选择进入平台期(两个包被浓度的吸光度值变化率小于或等于 5%)的最低浓度作为推荐包被浓度 。

　　注 1: 不同包被浓度如 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL等 。

　　采用相同包被浓度 ,设置 4 ℃或 37 ℃两个温度条件下的梯度时间进行孵育 ,按 8. 1完成靶标包被 ,按 8. 4 和 8. 5进行亲和力测定和结果分析 ,计算信噪比(阳性孔均值与阴性孔均值的比值) 和变异系数 。若信噪比大于或等于 10,变异系数小于或等于 10% ,则说明该孵育时间符合要求 。必要时 ,绘制 “包被时间-吸光度值 ”曲线 ,优先选择进入平台期(两个包被时间的吸光度值变化率小于或等于 5%) 的最短时间作为推进孵育时间 。

　　注 2: 4 ℃温度条件下的梯度时间如 12 h、18h、24h等 ;37 ℃温度条件下的梯度时间如 1 h、2 h、3 h等 。

　　8.3 待测样品准备

　　需明确待测样品中含有的重组蛋白的质量或浓度 。

　　固体样品 :取适量样品用稀释液溶解配制母液 。

　　液体样品 :取适量待测样品用稀释液稀释配制母液 。

　　根据需要将母液用稀释液以 2倍 ~ 5倍进行梯度稀释 ,获得系列梯度浓度待测样品溶液 ,记录其中重组蛋白的物质的量浓度 ,宜稀释 8个 ~ 10个浓度备用 。

　　8.4 亲和力测定

　　8.4. 1 加样

　　将梯度稀释的待测样本各取 100 μL加至按 8. 1制备的靶标包被板中 ,每个稀释度的待测样品重复3个孔 , 以 100 μL的稀释液作为空白对照 。37 ℃恒温孵育 30 min~ 60 min。

　　8.4.2 清洗

　　重复步骤 8. 1. 2。

　　8.4.3 酶标抗体孵育

　　根据待测样本的宿主来源选择酶标抗体 ,按说明书选择抗体稀释液稀释酶标抗体 ,每孔加入 100 μL,室温孵育 30min~60min。

　　8.4.4 清洗

　　重复步骤 8. 1. 2。

　　8.4.5 显色与终止

　　每孔加入 100 μL或说明书推荐量的显色工作液 。避光孵育 15 min~ 30 min后立即加入 50μL或说明书推荐量的终止液 ,结束显色反应 。

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　　8.4.6 吸光度值测定

　　反应终止 30 min内 ,使用酶标仪测定吸光度值 。

　　注 : 建议使用双波长测量 ,根据反应产物的敏感吸收峰 选 择 检 测 波 长 ,根 据 其 不 敏 感 区 域 选 择 参 比 波 长 ,用 检 测 波长的吸光度值减去参比波长的吸光度值得到实际的吸光度值 。

　　8.5 分析结果表述

　　8.5. 1 绘制结合曲线

　　以吸光度值为纵坐标 ,待测样品的浓度为横坐标 ,通过数据处理软件使用公式(1) 的非线性回归模型拟合数据 ,绘制结合曲线 。

　　Y …………………………( 1 )

　　式中 :

　　Y — 吸光度值 ;

　　Bmax — 最大结合响应的吸光度值 ;

　　X — 待测样品的浓度 ,单位为摩尔每升(mol/L) ;

　　KD — 平衡解离常数 ,单位为摩尔每升(mol/L) 。

　　8.5.2 结果表达及要求

　　通过数据分析软件计算得到最优的 KD 值(即待测样品的亲和力) 、结合曲线拟合的 R2 值及置信区间 ,其中 R2 应大于或等于 0. 95。

　　9 精密度

　　在重复性条件下获得的 3 次独立测定结果的标准偏差不应超过算术平均值的 20% 。

　　10 报告内容

　　测试报告应至少包含以下信息 :

　　a) 靶标信息 ;

　　b) 样品信息或编号 ;

　　c) 主要仪器设备及试剂 ;

　　d) 测试技术参数 ;

　　e) 测试日期 、试验人员 、环境条件及测试结果 。