GB/T 39101-2020 多肽抗菌性测定 抑菌圈法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 39101—2020

　　多肽抗菌性测定 抑菌圈法

　　Determinationofantimicrobialactivityforpolypeptides—Inhibitionzonemethod

　　2020-09-29 发布 2021-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 39101—2020

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：北京工商大学、河北科技大学、深圳市计量质量检测研究院、河北农业大学、北京萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总局食品审评中心、中国测试技术研究院生物研究所。

　　本标准主要起草人：贾英民、马爱进、王志新、田益玲、郝帅、彭海、周李华、杨志坚、郑燕燕、郑刚、陈晶、姜雨、杨国武。

　　GB/T 39101—2020

　　多肽抗菌性测定 抑菌圈法

　　1 范围

　　本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法。

　　本标准适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789 . 2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　多肽 polypeptides

　　介于氨基酸和蛋白质之间，由 2 个或 2 个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。

　　3.2

　　抑菌圈 inhibitionzone

　　固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域。

　　3.3

　　抗菌性 antimicrobialactivity

　　抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效价 U 值(AU)来表示。

　　4 原理

　　利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后，使其周围的菌株生长受到抑制，形成无菌繁殖区域，根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径，计算抑菌效价 U 值来判定活性。

　　5 试剂或材料

　　除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5 . 1 生理盐水

　　0 . 85%生理盐水：称取 8 . 5 g氯化钠于容量瓶中，用一级水溶解并定容至 1 000 mL。 121 ℃ ± 1 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。

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　　5 . 2 培养基

　　营养肉汤培养基(NB)、营养琼脂培养基(NA)、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA), 配制参见附录 A。

　　5 . 3 指示菌标准菌株

　　革兰 氏 阳 性 细 菌：金 黄 色 葡 萄 球 菌(staphylococcus aureus)CICC 10473 ( CGMCC 1. 8721、 ATCC 29213),藤黄微球菌(Micrococcusluteus)CICC 10269(CGMCC 1.3749、ATCC 10240),蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CICC 10277(CICC 10468、ATCC 11778)。

　　革兰氏阴性细菌：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CICC 10305 (CICC 23657、CGMCC 1. 2385、 ATCC 25922)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)CICC 22956(ATCC 14028)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)CICC 10351(CICC 23694、CGMCC 1.2421、ATCC 9027)。

　　丝状真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2463(CGMCC 3.5487、CICC 40372、ATCC 16404),产黄青霉(penicillium chrysogenum)CICC 40654(CGMCC 3. 7894、ATCC 10106),桔青霉(penicillium citrinum)CICC 2478(ATCC 9849) 。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 恒温培养箱：温度精度 1 ℃ 。

　　6.2 电子天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 g。

　　6.3 分光光度计：波长范围为 190 nm~900 nm。

　　6 . 4 游标卡尺或抑菌圈测量仪：精度 0 . 02 mm~0 . 1 mm。

　　6.5 血球计数板：16 格 × 25 格或 25 格 × 16 格。

　　6 . 6 玻璃平皿：直径为 90 mm,底部平整。

　　6.7 不锈钢牛津杯：内径 6.0 mm±0.1 mm、外径 7.8 mm±0.1 mm、高 10 .0 mm±0.1 mm。

　　7 试验步骤

　　7 . 1 抗细菌性能测定

　　7 . 1 . 1 样品制备

　　称取多肽样品 10 . 0 mg,水溶性好的样品采用无菌缓冲液溶解与定容，水溶性差的样品先溶于无水乙醇再用无菌缓冲液定容至 1 . 0 mL,使其浓度为 10 . 0 mg/mL,作为储备液，4 ℃ ~6 ℃冰箱中保存，应在一周内使用。 使用时，采用无菌缓冲液将多肽储备液进行稀释，制备成至少 5 个不同浓度的待测溶

　　液，浓度的选择应使抑菌圈直径 8.00 mm~25.00 mm,且线性方程 R2 ≥0.990 0。

　　7 . 1 . 2 指示菌悬液制备

　　7 . 1 . 2 . 1 菌种活化

　　将指示菌接种于 5.0 mL NB培养基的试管，36 ℃ ± 1 ℃、200 r/min±1 r/min 培养 18 h~24 h 进行第一次传代培养;取第一代培养液接种于 5 . 0 mL NB培养基的试管，36 ℃ ±1 ℃ 、200 r/ min±1 r/min培养 18 h~24 h进行第二次传代培养;取第二代培养液接种于 5 . 0 mL NB 培养基的试管或 50 . 0 mL NB培养基的锥形瓶，36 ℃ ± 1 ℃ 、200 r/ min±1 r/min培养至指示菌的稳定期，作为第三代培养液。

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　　7 . 1 . 2 . 2 菌悬液制备

　　预先按照 GB 4789 . 2 进行指示菌的菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600) 的对应关系;将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为 1 × 10 8 CFU/mL~5 × 108 CFU/ mL。

　　7 . 1 . 3 检测平板制备

　　将配制的 NA培养基加热溶解，冷却至 45 ℃ ~50 ℃,将制备的指示菌菌悬液按照 1%的添加量加入 NA培养基中，充分混合均匀，量取 20 mL倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。

　　7 . 1 . 4 测定

　　在含有指示菌的检测平板中等距离安放 5 个 ~6 个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品 100 μL,缓缓加入牛津杯中，每个处理重复 3 次 。将平板移入 4 ℃ ~ 6 ℃冰箱中预扩散 4 h~ 10 h,取出平板，放入36 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰，采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量 3 次，并记录平均值。

　　以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程(R2 ≥0 . 990 0) 。杆菌肽对 S.aureus ATCC 25923 的线性关系图参见附录 B 的图 B. 1 。

　　7 . 2 抗丝状真菌性能测定

　　7 . 2 . 1 样品制备

　　同 7 . 1 . 1 。

　　7 . 2 . 2 指示菌孢子悬液制备

　　7 . 2 . 2 . 1 菌种活化

　　将指示菌孢子或菌悬液接种于 PDA培养基的固体平板上，29 ℃ ± 1 ℃恒温培养 48 h~72 h,作为第一代孢子培养物;取第一代孢子培养物接种于 PDA培养基的固体平板上，29 ℃ ± 1 ℃恒温培养 48 h~ 72 h,作为第二代孢子培养物;取第二代孢子培养物接种于 PDA培养基的固体平板上，29 ℃ ± 1 ℃恒温培养 48 h~72 h,作为第三代孢子培养物。

　　7 . 2 . 2 . 2 孢子悬液制备

　　将第三代孢子培养物用 0 . 85%生理盐水洗脱孢子，血球计数板计 数，将 孢 子 浓 度 调 整 至 1 ×

　　106 CFU/mL~5 × 106 CFU/mL。

　　7 . 2 . 3 检测平板制备

　　将配制的 PDA培养基加热溶解，冷却至 45 ℃ ~50 ℃,将制备的指示菌孢子悬液按照 1%的添加量加入 PDA培养基中，充分混合均匀，量取 20 mL倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平板使之均匀铺平，待其凝固后备用。

　　7 . 2 . 4 测定

　　在含有指示菌的检测平板中等距离安放 5 个 ~6 个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品 100 μL,缓缓加入牛津杯中，每个处理重复 3 次 。将平板移入 4 ℃ ~ 6 ℃冰箱中预扩散 4 h~ 10 h,取出平板，放入29 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中，正置培养 18 h~24 h 至抑菌圈清晰，此时指示菌为菌苔状，基本还未形成菌

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　　丝;采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量 3 次，并记录平均值。

　　以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程(R2 ≥0 . 990 0) 。硫酸多粘菌素 B对 A.nigerATCC 16404 的线性关系图参见图 B. 2 。

　　8 试验数据处理

　　抗菌性按式(1)计算：

　　U …………………………( 1 )

　　式中：

　　U —抗菌效价，单位为 AU每毫克(AU/mg) ;

　　V —样品的测定体积，单位为毫升(mL) ;

　　X0 — 线性方程的 X 轴截距;

　　C —样品的初始测定浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) 。

　　计算结果以 3 次平行测定值的算术平均值表示，保留两位有效数字。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　培 养 基

　　A.1 营养肉汤培养基(NutrientBroth，NB)

　　A.1 . 1 将蛋白陈 10 g、牛肉膏 3 g、氯化钠 5 g放入 1 000 mL一级水中，煮沸溶解，调节 pH 值至 7 . 2 ~

　　7 . 4,分装后于高压蒸汽灭菌器中，121 ℃ ± 1 ℃灭菌 20 min。

　　A.1 . 2 可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。

　　A.2 营养琼脂培养基(NutrientAgar，NA)

　　A.2 . 1 将蛋白陈 10 g、牛肉膏 3 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 g放入 1 000 mL一级水中，煮沸溶解，调节 pH值至 7.2~7.4,分装后于高压蒸汽灭菌器中，121 ℃ ± 1 ℃灭菌 20 min。

　　A.2 . 2 可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。

　　A.3 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar，PDA)

　　A.3 . 1 将去皮切块马铃薯 200 g放入 1 000 mL 一级水中，煮沸 10 min~20 min,用纱布过滤，补加 一级水至 1 000 mL。加入葡萄糖 20 g、琼脂 15 g, 加热溶化，调节 pH 值至 5.4~5.8 , 115 ℃ ± 1 ℃灭菌20 min 。

　　A.3 . 2 可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　抗菌性测定线性关系图

　　B.1 抗细菌性能测定

　　杆菌肽二倍梯度稀释 5 个浓度，浓度范围为 0 . 062 5 mg/mL~ 2 . 0 mg/mL。 杆菌肽对 S.aureus

　　ATCC 25923 的线性关系图见图 B. 1 。

　　图 B.1 杆菌肽对s.aureus ATCC25923 的线性关系图

　　B.2 抗丝状真菌性能测定

　　硫酸多粘菌素 B二倍梯度稀释 5 个浓度，浓度范围为 0 . 125 mg/mL~4 . 0 mg/mL。 硫酸多粘菌素B对 A.nigerATCC 16404 的线性关系图见图 B.2。

　　图 B.2 硫酸多粘菌素 B 对 A.nigerATCC 16404 的线性关系图