GB/T 39100-2020 多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 39100—2020

　　多肽抗氧化性测定 DPPH 和 ABTS法

　　Determinationofantioxidantactivityforpolypeptides—

　　DPPH andABTSmethods

　　2020-09-29 发布 2021-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 39100—2020

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：河北科技大学、河北农业大学、北京工商大学、华测检测认证集团股份有限公司、北京萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总局食品审评中心、中国检验检疫科学研究院。

　　本标准主要起草人：王志新、田益玲、贾英民、马爱进、郝帅、彭海、刘文秋、杨志坚、郑刚、姜雨、邹明强、孙宇、齐小花。

　　GB/T 39100—2020

　　多肽抗氧化性测定 DPPH 和 ABTS法

　　1 范围

　　本标准规定了 DPPH 和 ABTS法测定多肽抗氧化性能的方法。

　　本标准适用于多肽体外抗氧化性能的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　多肽 polypeptides

　　介于氨基酸和蛋白质之间，由 2 个或 2 个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。

　　3.2

　　抗氧化能力 antioxidantactivity

　　清除自由基的能力，以待测多肽半数清除量与谷胱甘肽半数清除量的比值(AO值)来表示。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　ABTS:2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2 , 2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-

　　sulfonic acid) diammonium salt]

　　AO：抗氧化能力(antioxidant activity)

　　DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

　　DMSO：二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)

　　EC50：半数清除量 (half maximal effective concentration)

　　5 试剂或材料

　　除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，试验用水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5 . 1 谷胱甘肽

　　L-还原型，纯度 ≥98%。

　　GB/T 39100—2020

　　5 . 2 过硫酸钾

　　分析纯。

　　5 . 3 二甲基亚砜

　　分析纯。

　　5 . 4 DPPH 溶液

　　称取 DPPH 5 . 0 mg,适量无水乙醇溶解，避光超声使其充分溶解，再用无水乙醇定容至 100 . 0 mL,配制成 50.0 μg/mL 的 DPPH 溶液。 该溶液应现配现用。

　　5 . 5 ABTS溶液

　　称取 ABTS 200.0 mg,过硫酸钾 34.4 mg,溶于 50.0 mL蒸馏水，摇匀，窒温避光放置 24 h后，作为ABTS母液。取适量 ABTS母液，用 95%乙醇稀释至吸光度值在 0.70±0.02 内(OD734),作为 ABTS测

　　定溶液，该溶液应现配现用。

　　注：可以根据分光光度计的灵敏度配制合适浓度的 ABTS测定溶液。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 分光光度计：波长范围为 400 nm~800 nm, 吸光度值精确至 0 . 001 。

　　6.2 电子天平：感量为 0.000 1 g。

　　7 DPPH · 自 由基清除法

　　7 . 1 原理

　　DPPH是一种暗紫色棱柱状结晶，在无水乙醇溶液中呈深紫色，DPPH · 自 由基在可见光区 517 nm处具有较强吸收峰。 该方法通过 DPPH 提供的 1 个稳定的 DPPH · 自 由基与抗氧化性多肽提供的 1 个电子配对结合，使 DPPH · 自 由基的特征性紫色消失，变为无色或浅黄色，采用紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度。 通过与谷胱甘肽的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化能力 AO值。

　　7 . 2 试验步骤

　　7 . 2 . 1 样品制备

　　7 . 2 . 1 . 1 待测样品溶液

　　称取多肽样品 10 . 0 mg,水溶性好的样品采用蒸馏水溶解与定容，水溶性差的样品先溶于 DMSO再用蒸馏水定容，定容至 1 . 0 mL,充分混合均匀，配制成 10 . 0 mg/mL 的母液。 用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的待测样品溶液。 待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在 35%~65% ,且线性方程的 R2 ≥0.950 0。

　　7 . 2 . 1 . 2 谷胱甘肽溶液

　　称取 L-还原型谷胱甘肽 10 . 0 mg,蒸馏水定容至 1 . 0 mL,充分混合均匀，配制成 10 . 0 mg/mL 的母液 。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的谷胱甘肽溶液。 谷胱甘肽溶液浓度的选择应使

　　GB/T 39100—2020

　　其清除率在 35%~65%,且线性方程的 犚2 ≥0.950 0。

　　7 . 2 . 2 测定

　　7 . 2 . 2 . 1 对照组

　　取 3 支试管，分别编号为 1 、2、3 号，每支试管中按照表 1 的组合添加试剂。

　　表 1 试剂添加量

　　在 1 号试管中加入 3 . 0 mL DPPH 溶液和 1 . 0 mL谷胱甘肽溶液，作为试验组(犃s ) ;在 2 号试管中加入 1 . 0 mL 谷胱甘肽溶液和 3 . 0 mL 无水乙醇溶液，作为对照组(犃c ) ;在 3 号试管中加入 3 . 0 mL DPPH 溶液和 1 . 0 mL样品溶剂溶液，作为空白组(犃b ) 。分别充分混合均匀后，窒温避光反应 30 min,于波长 517 nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。

　　7 . 2 . 2 . 2 样品组

　　用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同 7 . 2 . 2 . 1 。

　　7 . 2 . 3 试验数据处理

　　按式(1)计算：

　　犘 …………………………( 1 )

　　式中：

　　犘 — 清除率;

　　犃s — 待测溶液与 DPPH 溶液混合液的吸光度;

　　犃c — 待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度;

　　犃b —DPPH 溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度。

　　以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除率的线性方程(犚2 ≥0.950 0),计算半数清除量 EC50,按式(2)计算多肽样品的抗氧化能力 AO值。

　　…………………………( 2 )

　　式中：

　　AO — 抗氧化能力;

　　EC50(S) —多肽样品的半数清除量，单位为毫克每升(mg/L) ;

　　EC50(R) —谷胱甘肽的半数清除量，单位为毫克每升(mg/L)。

　　计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。

　　8 ABTS+ 自 由基清除法

　　8 . 1 原理

　　ABTS经氧化后生成较稳定的蓝绿色 ABTS+ 自 由基，在可见光区 734 nm 处有最大吸收峰，抗氧

　　GB/T 39100—2020

　　化性多肽与 ABTS+ 自 由基反应后使其褪色，在 734 nm 处的吸光值降低，采用紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度。 通过与谷胱甘肽的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化能力 AO值。

　　8 . 2 试验步骤

　　8 . 2 . 1 样品制备

　　8 . 2 . 1 . 1 待测样品溶液

　　称取多肽样品 10 . 0 mg,水溶性好的样品采用蒸馏水溶解与定容，水溶性差的样品先溶于 DMSO再用蒸馏水定容，定容至 1 . 0 mL,充分混合均匀，配制成 10 . 0 mg/mL 的母液。 用 95%乙醇将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的待测定溶液。 待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在 35%~65% ,且线性方程的 犚2 ≥0.950 0。

　　8 . 2 . 1 . 2 谷胱甘肽溶液

　　称取 L-还原型谷胱甘肽 10 . 0 mg,蒸馏水定容至 1 . 0 mL,充分混合均匀，配制成 10 . 0 mg/mL 的母液 。用 95%乙醇将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的测定溶液。 谷胱甘肽溶液浓度的选择应使其

　　清除率在 35%~65%,且线性方程的 犚2 ≥0.950 0。

　　8 . 2 . 2 测定

　　8 . 2 . 2 . 1 对照组

　　取 2 支试管，分别编号为 1 、2 号，每支试管中按照表 2 的组合添加试剂。

　　表 2 试剂添加量

　　在 1 号试管中加入 3 . 6 mL ABTS溶液和 0 . 4 mL 谷胱甘肽溶液，作为试验组(犃s ) ;在 2 号试管中加入 3 . 6 mL ABTS溶液和 0 . 4 mL样品溶剂溶液，作为空白组(犃b );分别充分混合均匀后，室温避光反应 5 min,于波长 734 nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。

　　8 . 2 . 2 . 2 样品组

　　用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同 8 . 2 . 2 . 1 。

　　8 . 2 . 3 试验数据处理

　　按式(3)计算：

　　犘 …………………………( 3 )

　　式中：

　　犘 — 清除率;

　　犃b —ABTS溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度;

　　GB/T 39100—2020

　　As — 待测溶液与 ABTS溶液混合液的吸光度。

　　以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除率的线性方程(R2 ≥0.950 0),计算半数清除量 EC50 ,按 7 . 2 . 3 中的式(2) 计算多肽样品的抗氧化能力AO值。 计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。

　　9 重复性

　　在重复性条件下获得的不低于 3 次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 20%。