GB/T 38570-2020 植物转基因成分测定 目标序列测序法

　　ICS 07 . 080 A 2 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 38570—2020

　　植物转基因成分测定

　　目标序列测序法

　　Determinationforingredientsofgeneticallymodifiedplants—

　　Targetsequencingmethods

　　2020-03-31 发布 2020-03-31 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 38570—2020

　　GB/T 38570—2020

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中国标准化研究院提出并归口 。

　　本标准起草单位：江汉大学、武汉明了生物科技有限公司、中国标准化研究院、北京工商大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所、湖南杂交水稻研究中心 、深圳华大智造科技有限公司。

　　本标准主要起草人：彭海、陈利红、方治伟、张嘉楠、李甜甜、李论、崔野韩、马爱进、贾英民、陈红、周俊飞、翟文学、许娜、梁勇、高利芬、宋书锋、胡美霞、符习勤、张静 、余进文。

　　GB/T 38570—2020

　　植物转基因成分测定

　　目标序列测序法

　　1 范围

　　本标准规定了用目标序列测序法测定植物转基因成分的方法。

　　本标准适用于植物及其产品中的外源基因和转基因品系的定性检测。 本方法外源基因的定性检出低限(LOD)为 0 . 1%(外源基因与内标准基因间的拷贝数比)。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19495 . 2 转基因产品检测 实验室技术要求

　　GB/T 19495 . 3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　GB/T 19495 . 5—2018 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法GB/T 19495 . 7 转基因产品检测 抽样和制样方法

　　GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　内标准基因 endogenousreferencegene

　　在植物不同物种中普遍存在且拷贝数恒定的基因。

　　3.2

　　外源基因 exogenousgene

　　利用生物工程技术转入的使生物品种表现新的生物学性状的其他生物基因。

　　3.3

　　质控样品 controlsample

　　与待测样品平行制样，用于显示待测样品在制样过程中是否被污染的样品。

　　3.4

　　模板片段 templatefragment

　　由高通量测序片段中一组具有相同随机条形码的测序片段推测的一条模板脱氧核糖核酸(DNA)序列。

　　3.5

　　外源基因特征片段 characteristicfragmentofexogenousgene

　　包含了外源基因但在自然界中不存在的模板片段。

　　注：包括含有人工改造序列的外源基因序列，以及外源基因与除外源基因在起源物种中的边界序列以外的序列相连接的序列。

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　　4 原理

　　通过抽样与制样获得待测样品与质控样品，提取并片段化样品基因组 DNA、连接接头序列、PCR扩增连接产物、探针捕获扩增产物、扩增捕获产物获得测序文库、高通量测序、分析测序数据和进行质量控制并得出检测结论。

　　本方法通过不同的样品条形码识别并控制实验室气溶胶污染;通过外源基因特征片段识别外源基因并区分微生物污染;通过与多种转基因元件匹配的杂交探针同时检测多种转基因成分。

　　5 试剂或材料

　　除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

　　5 . 1 水：GB/T 6682 一级 。

　　5 . 2 文库构建试剂盒。

　　5 . 3 高通量测序试剂盒。

　　5 . 4 探针序列：见附录 A。

　　5 . 5 人工 DNA序列：见附录 B。

　　6 仪器设备

　　高通量测序仪。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 抽样和制样

　　7 . 1 . 1 待测样品抽样与制样

　　按 GB/T 19495 . 7 中规定的方法执行。

　　7 . 1 . 2 质控样品制样

　　从待测样品制样开始到结束的过程中，把 1 ng/μL 的人工 DNA 的溶液暴露于制样环境中，作为质控样品。

　　7 . 2 DNA提取与纯化

　　按 GB/T 19495 . 3 的方法或具有相同效果的基因组 DNA 提取试剂盒提取并纯化待测样品和质控样品 DNA。

　　7 . 3 文库构建

　　7 . 3 . 1 概述

　　利用文库构建试剂盒及其操作说明进行文库构建。

　　7 . 3 . 2 DNA片段化

　　利用酶切消化或机械破碎的方法，将待测样品和质控样品基因组 DNA 片段化至 100 bp~1 000 bp。

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　　片段化时，基因组 DNA 的最低加入量参照 GB/T 19495 . 5—2018 中附录 B 中规定的定量下限为 0 . 1%时的 DNA模板最低加入量。

　　7 . 3 . 3 末端修复与接头连接

　　对 7 . 3 . 2 中获得的产物进行末端修复并连接接头序列。 接头序列应包括三个部分：约 20 个碱基的通用序列、8 个碱基组成的随机条形码序列和 12 个碱基的样品条形码序列。 其中，不同的待测样品或质控样品使用不同的样品条形码序列，且在同一个实验室中相同的样品条形码序列在 30 天内，只使用一次。 按试剂盒说明纯化连接产物。

　　7.3.4 PCR扩增

　　利用 7 . 3 . 3 中接头上的通用序列设计引物对 7 . 3 . 3 中获得的产物进行扩增，扩增循环数小于或等于15 个 。其中，所设计的引物序列包含高通量测序仪的测序引物序列。 按试剂盒说明纯化扩增产物。

　　将具有不同样品条形码的待测样品或质控样品等质量混合后成为混合样品，每个混合样品中待测样品或质控样品的数目不宜超过 4 个 。

　　7 . 3 . 5 杂交捕获

　　将附录 A 中的探针按等摩尔质量混合，形成混合探针，利用混合探针对 7 . 3 . 4 中获得的产物进行杂交捕获。 按试剂盒说明纯化捕获产物。

　　7.3.6 PCR扩增

　　利用高通量测序仪的测序引物序列对 7 . 3 . 5 中的产物进行扩增，扩增循环数小于或等于 20 个，获得测序文库。 按试剂盒说明纯化测序文库。

　　7 . 4 高通量测序

　　利用高通量测序试剂盒及其操作说明对测序文库进行高通量测序，每个待测样品的测序碱基数据量设置为大于或等于 1 G。

　　8 质量控制

　　利用转基因鉴定软件对获得的测序数据进行质量控制，并输出质量控制结论。 质量控制程序要求如下：

　　a) 当质量控制结论为制样过程中存在交叉污染时，从 7 . 1 开始重新实验。

　　b ) 当质量控制结论为模板片段数量不足时，加大基因组 DNA用量后从 7 . 3 或之前的步骤开始重新实验。

　　c) 当质量控制结论为文库构建失败时，从 7 . 3 或之前的步骤开始重新实验。

　　d) 当质量控制结论为测序数据量不足时，从 7 . 4 或之前的步骤开始重新实验。

　　e) 当质量控制结论为测序数据质量合格时，进行结果分析。

　　9 结果分析与表述

　　9 . 1 结果分析

　　利用多位点多核苷酸多态性(MLMNP)转基因鉴定软件计算待测样品中外源基因特征片段的数目(TEF) 。

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　　9 . 2 结果表述

　　9 . 2 . 1 当 TEF<3 时，表述为“未检出× ×外源基因(或 × ×转基因品系)”。

　　9 . 2 . 2 当 TEF≥3 时，表述为“检出× ×外源基因(或 × ×转基因品系)”。

　　9 . 2 . 3 对于无法有效提取 DNA 的样品，表述为“未检出核酸成分”。

　　10 防污染措施

　　7.1~7.3.2 的测定步骤的防污染措施按 GB/T 27403 和 GB/T 19495.2 中的规定执行。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)探 针 序 列

　　A.1 外源基因探针序列见表 A. 1~表 A. 28 。

　　表 A.1 花椰菜花叶病毒的 35s启动子(pcaMV35s)探针序列

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　　表 A.2 花椰菜花叶病毒终止子(t35s)探针序列

　　A.3

　　玄参花叶病毒的 35s启动子(PFMV35s)探针序列

　　A.4

　　农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(PNOs)探针序列

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.5 农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)探针序列

　　A.6

　　新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ )探针序列

　　A.7

　　潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)探针序列

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　　表 A.7(续)

　　表 A.8 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.8(续)

　　A.9

　　烟草花叶病毒外壳蛋白(TMV-CP)探针序列

　　表

　　A.10

　　黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)探针序列

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.10(续)

　　表 A.1 1 马铃薯卷叶病毒复制酶(PLRVreP)探针序列

　　表

　　A.12

　　马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因(PVYCP)探针序列

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.12(续)

　　表 A.13 腈水解酶基因(BXN)探针序列

　　A.14

　　核糖核酸酶基因(BARNASE)探针序列

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　　表 A.15 BARNASE基因的特异抑制基因(BARSTAR)探针序列

　　表

　　A.16

　　草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)探针序列

　　表 A.17 草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)探针序列

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.18 6-磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)探针序列

　　表

　　A.19

　　苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白基因(BT)探针序列

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　　表 A.19(续)

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.19(续)

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　　表 A.19(续)

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　　表 A.19(续)

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.19(续)

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　　表 A.19(续)

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　　表 A.19(续)

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　　表 A.20 二磷酸核酮糖羧化酶 E9 基因的终止子(Te9)探针序列

　　表

　　A.2 1

　　豇豆的胰蛋白酶抑制剂基因(CPTI)探针序列

　　表

　　A.22

　　叶绿体转运肽(CTP2)探针序列

　　表 A.23 5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)探针序列

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.23(续)

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　　表 A.23(续)

　　A.24

　　水稻肌动蛋白

　　基因的启动子(PActin1)探针序列

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　　表 A.24(续)

　　表 A.25 玉米泛素基因的启动子(pubi)探针序列

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　　表 A.25(续)

　　表 A.26 水稻白叶枯病抗性基因(xa21) 探针序列

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　　表 A.26(续)

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　　表 A.27 谷氨酰胺转移酶 7 基因(tg7)探针序列

　　表 A.28 淀粉酶(Amy)探针序列

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　　A.2 品系特异性探针序列见表 A. 29 。

　　表 A.29 品系特异性探针序列

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　　表 A.29(续)

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.29(续)

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　　表 A.29(续)

　　GB/T 38570—2020

　　表 A.29(续)

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　　表 A.29(续)

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　　表 A.29(续)

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　　A.3 内标准基因探针序列见表 A. 30 。

　　表 A.30 核酮糖-二磷酸羧化酶(RBCL)探针序列

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　人工 DNA

　　人工 DNA 的序列(从 5′端到 3′端)：

　　ACTCCGGGTCGTGTGGGCTCCCAGGGCTCTGACCTGGATAGTAGCGCCACCCCGATCAACAC CGTTGATGTGAACAACGAGAGCTCCTCTGAAGGCTTCATCTGCCCGCAGTGTATGAAATCT CTGGGTAGCGCTGACGAACTGTTCAAACACTATGAAGCAGTTCACGACGCTGGTAACGATT CCGGCCATGGCGGTGAGTCTAACCTGGCCCTGAAACGTGATGACGTGACCCTGCTGCGTCA

　　GGAAGTGCAGGACCTCCAGGCTAGCTTGAAAGAAGAAAAATGGTACTCTGAAGAACTGAA AAAGGAACTGGAAAAATACCAGGGCCTGCAGCAGCAAGAGGCAAAACCGGACGGCCTGGT TACCGACTCTTCCGCTGAACTGCAGTCCCTGGAGCAGCAGCTGGAAGAAGCGCAGACTGAA AACTTCAACATTAAACAAATGAAGGACCTGTTCGAGCAGAAGGCCGCACAGCTGGCGACA

　　GAAATTGCAGACATTAAATCCAAATATGACGAAGAACGTAGCCTGCGTGAGGCGGCTGAG CAGAAAGTCACTCGTCTGACTGAGGAGCTGAACAAAGAAGCAACCGTTATCCAGGATCTCA AAACTGAGCTGCTGCAGCGTCCGGGTATCGAAGACGTGGCTGTTCTCAAAAAAGAGCTCGT GCAGGTGCAGACCTTGATGGACAACATGACCCTGGAACGTGAACGTGAATCAGAGAAGCT

　　GAAAGATGAGTGTAAAAAACTGCAGTCACAGTACGCTAGCTCTGAAGCGACGATCTCCCA GCTGCGTTCCGAGCTTGCCAAAGGCCCGCAGGAAGTTGCGGTGTATGTTCAGGAATTGCAG AAACTGAAGTCTAGCGTAAACGAACTGACTCAAAAGAATCAGACCCTCACCGAAAACCTG TTGAAAAAAGAACAAGACTACACAAAACTGGAAGAGAAACACAACGAAGAGTCCGTTTCT AAAAAGAACATTCAGGCGACCCTACACCAGAAAGATCTCGACTGCCAGCAGCTCCAAAGTC GCCTGTCTGCATCTGAAACGTCTCTCCACCGTATTCACGTAGAGCTGTCCGAAAAAGGGGA AGCCACCCAGAAACTCAAAGAAGAACTGTCCGAAGTTGAAACTAAGTACCAGCACTTGAA AGCTGAGTTTAAACAACTGCAGCAACAGCGTGAAGAAAAAGAGCAGCATGGTCTACAGCT CCAGTCCGAAATCAACCAGCTTCACTCCAAATTGCTGGAGACTGAACGCCAGCTGGGCGAA GCGCACGGCCGCCTGAAGGAACAGCGCCAGCTGTCCTCCGAAAAACTGATGGATAAAGAGC AGCAAGTGGCTGATCTGCAGCTTAAACTGTCTCGCCTAGAAGAACAACTGAAGGAAAAAG TTACGAACTCCACGGAGCTCCAGCACCAGCTGGATAAAACTAAACAGCAGCACCAGGAACA GCAGGCTCTGCAACAGTCCACGACCGCGAAACTGCGTGAAGCCCAGAACGATCTTGAACAA GTGCTCCGTCAGATCGGTGACAAAGACCAGAAAATTCAGAACCTTGAAGCGCTTCTGCAGA AATCTAAAGAGAATATCTCGCTGCTGGAAAAAGAACGTGAAGATCTATACGCTAAAATCC AGGCTGGCGAGGGGGAAACCGCAGTACTCAACCAACTGCAGGAGAAAAACCACACCCTGCA AGAACAGGTCACCCAACTGACGGAAAAGCTCAAGAACCAAAGCGAGTCTCACAAACAGGC ACAAGAGAACCTGCATGACCAAGTGCAGGAGCAGAAAGCGCACCTGCGTGCGGCTCAGGAC CGTGTTCTGTCTCTGGAAACTTCCGTTAACGAGCTGAATTCCCAGCTGAACGAGTCCAAAG AGAAAGTGTCCCAGCTCGACATCCAGATTAAGGCTAAAACTGAACTGCTGCTGTCCGCGGA GGCAGCTAAAACCGCCCAGCGCGCTGATCTCCAGAACCACTTGGATACAGCGCAGAACGCG CTCCAGGATAAACAG。