GB/T 36824-2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36824—2018

　　松针红斑病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofMycosphaerellapiniE.Rostrup

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36824—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：李云飞、宗凯、姚剑、孙娟娟、华陈意、郑海松、余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满、谢超。

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　　松针红斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了松属(pinus)、其他寄主植物及植物材料中松针红斑病菌检疫和鉴定方法。

　　本标准适用于松属及相关种属苗木、枝叶中松针红斑病菌的检疫和鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　3 松针红斑病菌基本信息

　　中文名：松针红斑病菌。

　　学名：MycosphaerellapiniE.Rostrup apud Munk(Envans, 1984)。

　　异名：Eruptiopini (Rostr.) M. E. Barr

　　scirrhiapini Funk & A.K. Parker

　　cytosporinaseptospora G. Doroguine

　　septoriellaseptospora (G. Dorog.) Sacc.

　　Actinothyrium marginatum Sacc.

　　Dothistromapinivar. lineareThyr & C. G. Shaw

　　Dothistromaseptosporum var. lineareThyr & C. G. Shaw

　　Dothistromapinivar. kenienseM. H. Ivory

　　Dothistromaseptosporum var. kenienseM. H. Ivory

　　Dothistromapinisensu auct. NZ

　　Dothistromaseptosporum (G. Dorog.) M.Morelet

　　Dothistromaseptosporum (G. Dorog.) M.Morelet var. septosporum

　　septoriaseptospora (G. Dorog.) Arx

　　分类地位：真菌界(Fungi), 子囊菌门(Ascomycota), 座囊菌纲(Dothideomycetes), 煤怠 目 (Capno- diales),球腔菌科 (Mycosphaerellaceae), 球腔菌属(Mycosphaerella)。无性型为 Dothistroma septo- sporum (Dorog.) Morelet。松针红斑病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　本方法以松针红斑病菌的为害症状，形态特征、培养性状及分子生物学特征作为检疫鉴定的主要依据，寄主及地理分布作为辅助鉴定依据。

　　5 器材和试剂

　　5 . 1 器材

　　透视显微镜、超净工作台、电子天平、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷

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　　冻离心机、荧光定量 PCR仪、可调移液器(1 000 μL, 200 μL, 20 μL, 10 μL,2.5 μL)、培养皿、烧杯、三角

　　瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、移植环、研钵、液氮罐、标签等。

　　5 . 2 试剂

　　无水乙醇、次氯酸钠、CTAB缓冲液、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、液氮、实时荧光 PCR 预混液、引物和探针，麦芽浸膏琼脂培养基(MEA):2%麦芽浸膏、2%琼脂、pH 值为 5±0 . 2 。

　　6 抽样方法

　　按 SN/T 2122 进行抽样。

　　7 现场查验

　　检查幼苗、针叶是否有浅绿色、黄色至红褐色的病斑，针叶是否坏死、脱落。 观察坏死针叶是否为针叶尖端坏死、病斑上是否有红褐色斑点、段斑以及黑色斑点(参见附录 B) 。将疑似感病样品或无症样品标识清晰后带回实验窒做进一步检验。

　　8 实验室检验

　　8 . 1 切片检验

　　选取疑似感病样品，剪取带有黑色斑点或凸起裂口的针叶组织(约 5 mm),用刀片对有黑点或裂口组织块进行徒手切片，用移植环将切薄的组织片移至载玻片中央的水滴中，在显微镜下观察子囊座、子囊孢子或分生孢子盘、分生孢子等病原菌相关特征。 如针叶病斑上未发现黑点或裂口，可将有病针叶在20 ℃条件下保湿培养约 20 d,观察是否长出黑点或裂 口，若长出则进行切片镜检。 如针叶病斑组织切片中的子囊座或分生孢子盘尚未见成熟的孢子，可将有病针叶在 20 ℃下保湿培养 1 d~2 d,待孢子成熟后再做切片镜检。

　　8 . 2 分离培养

　　在典型病斑中切取小块感病组织或无症针叶组织(约 5 mm), 将该组织在 1%次氯酸钠中浸泡10 min。用无菌水冲洗 3 次后置于麦芽浸膏琼脂平板上，20 ℃恒温光照( 16 h 光照，8 h 黑暗)培养2 周 ~4 周后镜检。 期间要仔细观察菌落的生长状态并做记录。

　　8 . 3 形态观察

　　从菌落中挑取少许培养物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察。

　　8 . 4 实时荧光 PCR检测

　　松针红斑病菌的实时荧光 PCR检测方法见附录 C。

　　9 病菌形态特征

　　9 . 1 有性阶段

　　子囊座在落叶上形成，通常位于红斑区，最初埋生于表皮下，成熟后不规则地或通过 1 个 ~2 个沿针叶轴向的裂缝突出于表皮(参见附录 B) 。 子囊座黑色，大小为(400 μm~ 1 000 μm) × (300 μm~

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　　400 μm) , 具单或多腔。 子囊为囊状至圆柱状，双囊壁，大小约为(35 μm~55 μm) × (6 μm~9 μm), 内有 8 个子囊孢子，子囊孢子呈透明椭圆形，具圆形先端，具 1 个分隔，通常有 4 个油滴状斑点，大小(10 μm~15 μm) × (3 μm~4 μm)。

　　9 . 2 无性阶段

　　病菌不规则地分布于坏死区、部分死亡针叶组织上，有时会聚集于红斑处。 分生孢子盘最初埋生于

　　针叶表皮下，呈腔室状，成熟时呈椭圆形，平行于针叶长轴排列。 分生孢子盘黑色，大小为(300 μm~ 650 μm) × (150 μm~300 μm),基座由厚壁的假薄壁细胞组织组成。 成熟的分生孢子盘在潮湿条件下会分泌白色透明的分生孢子黏液，分生孢子透明、薄壁、光滑、直或略弯，梭型至棍棒型，1 个 ~5 个分隔，多数为 2 个 ~3 个分隔，具有圆形先端和截型基部，(12 μm~48 μm) × (2 μm~3 μm) 。

　　9 . 3 培养性状

　　松针红斑病菌在 MEA平板上生长速度较慢(相对于松针褐枯病和松针褐斑病)，最初产生灰白色气生菌丝，逐渐变为灰褐色至黑色，菌落凸起呈爆裂状，在 MEA 平板上形成轻微的红褐色色斑。 在

　　20 ℃ 下菌丝每周生长 1 . 5 mm~2 . 0 mm,菌丝生长最适温度为 20 ℃ ~25 ℃ ,菌丝生长最适 pH 值为3~5。

　　9 . 4 与近似种的区别

　　松针红斑病菌与近似种的区别见表 1 。

　　表 1 松针红斑病菌与近似种的区别

　　10 结果判定

　　如果样品具有该病的典型症状，且切片或分离培养的病菌形态特征与第 9 章的描述相符，即可判定为检出松针红斑病菌;如果分离培养的病菌形态特征与第 9 章的描述相符，且实时荧光 PCR 检测为阳性，亦可判定为检出松针红斑病菌。

　　1 1 样品、菌种保藏

　　分离菌转接在 MEA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于 4 ℃保存，定期转接，有条件可进行冷冻干燥保存。 检出病菌的样品标识清晰后妥善保存 6 个月，保存期满灭活处理。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　松针红斑病菌的其他信息

　　A.1 为害症状

　　感病针叶首先出现黄色斑点，之后逐渐变大具有明显界限的环绕针叶轴向的条带，最终导致针叶先端死亡。 该病的典型症状是褐色条带周围有一环绕针叶轴向的砖红色区域，然而该症状的出现取决于寄主植物及感病位置，有些情况下并不出现。 有时，砖红色色素会缩减为小红点分布于子实体结构周围 。感病针叶一般呈先端死亡、具有环带状患病部或坏死区，且具有绿色基底。 严重感病的针叶会整体变褐色，过早落叶，老叶先落;轻度感病的叶片，落叶病症会延迟 1 ~2 年出现。 严重感病松树的典型症状是只有当年生针叶，反复感染会导致枝条或整株树的死亡。

　　A.2 寄主

　　樟子松(p.syl℃estrisvar.mongolica)、红松(p.koraiensi)、油松(p.tabulaeformis)、长白松(p.syl- ℃estriformis)、偃松(p.pumila)、云 南 松(p.yunnanensis)、湿 地 松(p.elliottii)、火 炬 松(p.taeda Linn)、奥地利黑松(p.nigra var.austriaca)、南欧黑松(p.nigra var.oiretian)、西黄松(p.ponderosa)、 白皮松(p.Bungeana)、欧洲黑松(p.nigra)、辐射松(p.radiata)、扭叶松(p.contorta)、海岸松(p.pi- naster)、加勒比松(p.caribaea)、加那利松(p.canariensis)、地中海松(p.halepensis)、大叶松(p.en- gelmannii)、卡西亚松(p.kesiya)、山松(p.monte≈umae)、卵果松(p.oocarpn)、北美乔松(p.strobus)、加州山松(p.monticola)、加州沼松(p.muricata)、糖松(p.lambertiana)、柔松(p.flexilis)、欧洲山松 (p.mugo)、辛 松(p.pungens)、多 脂 松(p.resinosa)、拟 北 美 乔 松(p.pseudostrobus)、岛 松(p. insularis)、长叶松(p.palustri)、意大利松(p.pinea)、辐射松(p.radiate)、瑞士五叶松(p.cembra)及欧洲落叶松(Larixdecidua)、西特喀云杉(piceasitchensis)、北美黄杉(pseudotsugamen≈iesii)等

　　植物。

　　A.3 地理分布

　　欧洲：奥地利、比利时、法国、德国、希腊、意大利、罗马尼亚、西班牙、瑞典、英国、前南斯拉夫、俄罗斯、芬兰、波兰、捷克、丹麦、立陶宛、挪威、乌克兰、瑞士、葡萄牙。

　　亚洲：文莱达鲁萨兰国、格鲁吉亚、印度(查谟和喀什米尔北方邦、泰米尔纳德邦)、日本(北海道、本州)、朝鲜、韩国、巴基斯坦、尼泊尔、菲律宾、斯里兰卡、中国(黑龙江、内蒙古)。

　　非洲：肯尼亚、马拉维、南非、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦。

　　北美洲：加拿大(不列颠哥伦比亚省、萨斯喀彻温省、纽芬兰)、美国(加利福尼亚、佛罗里达州、夏威夷、爱荷华、爱达荷州、马里兰州、伊利诺斯、明尼苏达、蒙大纳、俄亥俄州、内布拉斯加州、奥克拉荷马、俄勒冈、弗吉尼亚州、华盛顿)。

　　中美洲和加勒比海地区：哥斯达黎加、瓜地马拉、洪都拉斯、牙买加、尼加拉瓜。

　　南美洲：阿根廷、巴西(巴拉那、圣保罗)、智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、乌拉圭。

　　大洋洲：澳大利亚(新南威尔士州、昆士兰、塔斯马尼亚、维多利亚)、新西兰。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　松针红斑病为害状及病原菌形态特征

　　B.1~图 B.5。

　　a) 松针红斑病为害瑞士五叶松(p.cembra) b)松针红斑病为害瑞士五叶松(p.cembra)

　　c) 松针红斑病为害欧洲山松(p.mugo) d)松针红斑病为害欧洲山松(p.mugo)

　　图 B.1 松针红斑病菌为害不同松树

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　　e)松针红斑病为害西黄松(p.ponderosa) f)松针红斑病为害西黄松(p.ponderosa)

　　g) 松针红斑病为害欧洲黑松(p.nigra) h)松针红斑病为害欧洲黑松(p.nigra)

　　i) 松针红斑病为害扭叶松(p.contorta)

　　注：a)、b)、c) 和 d) 引 自 EPPO/CABI. Mycosphaerella dearnessii and Mycosphaerella pini[R]. Bulletin OEPP/ EPPO Bullitin 38 , 349-362.e) 引 自 Robert L. James.f) 引 自 Susan K. Hagle.g) 引 自 A. Steven Munson.h) 引 自Andrej Kunca.i) 引 自 USDA Forest Service, Northern and Intermountain Region.

　　图 B.1(续)

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　　a) 子实体凸出针叶表皮 b) 子实体凸出针叶表皮

　　图 B.2 松针红斑病菌(Mycosphaerellapini)子实体凸出针叶表皮(放大镜下可见红色素)

　　图 B.3 潮湿条件下松针红斑病菌(Dothistromaseptospora)

　　分生孢子盘在针叶上产生透明分生孢子黏液

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　　a) 子囊座横截面 b) 子囊及子囊孢子

　　图 B.4 松针红斑病菌有性型 Mycosphaerellapini显微形态

　　a) 分生孢子盘横截面 b) 分生孢子

　　图 B.5 松针红斑病菌无性型 Dothistromaseptospora显微形态

　　注：图 B.2~图 B.5 引 自 EPPO/CABI.Mycosphaerelladearnessiiand Mycosphaerellapini[R]. Bulletin OEPP/EP-

　　PO Bullitin 38 , 349-362 .

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　松针红斑病菌的实时荧光 PCR检测方法

　　C.1 DNA提取

　　C.1 . 1 将分离培养物置于研钵用液氮冷冻后磨碎，称取 50 mg~100 mg 于 1 . 5 mL 的灭菌离心管中，加入 700 μL CTAB缓冲液，振荡混匀，置于 65 ℃温浴 60 min~90 min,期间不断混匀。

　　C.1 .2 加入 700 μL 酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1),振荡均匀，12 000 r/min, 离心 15 min。

　　C.1 . 3 取上清液放入另一 1 . 5 mL新管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒 3 次 ~5 次，室温下放置 1 h。 C.1 .4 12 000 r/min离心 10 min, 弃去上清液。

　　C.1 .5 加入 400 μL 70%乙醇溶液洗涤，12 000 r/min 离心 1 min, 弃上清液，将离心管室温下干燥15 min 。

　　C.1 .6 加入 50 μL~100 μL TE或 ddH2 O,充分溶解后置于 -20 ℃冰箱保存备用。

　　注：也可使用试剂盒进行 DNA提取，具体方法按照试剂盒说明书操作。

　　C.2 实时荧光 PCR检测

　　C.2 . 1 引物探针序列

　　松针红斑病菌实时荧光 PCR方法鉴定引物探针序列见表 C. 1 。

　　表 C.1 引物序列

　　C.2 . 2 检测体系

　　按照表 C. 2 配置反应体系，混合均匀后放入荧光定量 PCR 仪扩增。 每个样品设置两个平行，以松针红斑病菌 DNA 为阳性对照，其他真菌 DNA 为阴性对照，ddH 2 O 为空白对照。

　　表 C.2 检测体系

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　　表 C.2(续)

　　注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

　　C.2 . 3 反应条件

　　95 ℃ 30 s; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 25 s, 共 40 个循环。

　　C.3 结果判定

　　C.3 . 1 对照结果

　　阳性对照：检测 Ct值小于或等于 35 ;

　　阴性对照：检测 Ct值大于或等于 40 ;

　　空白对照：检测 Ct值大于或等于 40 ;

　　上述指标有一项不符合，应重做实时荧光 PCR扩增。

　　C.3 . 2 检测结果的判定

　　样品 Ct值大于 35,判定该样品为阴性。

　　样品 Ct值小于或等于 35,判定该样品为阳性。

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　　参 考 文 献

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