GB/T 36825-2018 蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36825—2018

　　蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofEobaniavermiculata(Miller，1774)

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36825—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国张家港出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：王沛、周卫川、崔俊霞、陆军、肖琼。

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　　蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了蠕虫尹氏蜗牛 Eobania℃ermiculata ( Müller, 1774)检疫鉴定的方法原理、器具与试

　　剂、现场检疫、实验室鉴定、结果评定以及标本处理和保存。

　　本标准适用于蠕虫尹氏蜗牛的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注文件的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　SN/T 3067—2011 软体动物常规检疫规范

　　3 术语和定义

　　SN/T 3067—2011 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　矢囊 dartsack

　　蜗牛雌性生殖系统中一个藏有 1 枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构。

　　3.2

　　恋矢 lovedart

　　矢囊中钙质或壳质的骨针。

　　注：为蜗牛交配的刺激器官。

　　3.3

　　盲管 diverticulum

　　受精囊柄分枝形成的空管状结构。

　　3.4

　　鞭状体 flagellum

　　蜗牛雄性生殖系统中的附器，由阴茎本体末端延伸形成。

　　注：位于阴茎本体和输精管交接处后面的部分。

　　4 方法原理

　　蠕虫尹氏蜗牛主要随运输工具、种苗和污染的货物远距离传播。 该蜗牛为杂食性的有害生物，不需要特定的寄主植物，凡接触过地面的物品都有可能是污染源。 传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据。 贝壳、螺体、生殖系统形态特征和线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 I(COI) 基因序列是实验室鉴定的主要依据。 蠕虫尹氏蜗牛相关信息参见附录 A。

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　　5 器具与试剂

　　5 . 1 器具

　　5 . 1 . 1 体视显微镜：10 × 以上。

　　5 . 1 . 2 放大镜 。

　　5 . 1 . 3 手电筒 。

　　5 . 1 . 4 塑料自封袋：5 # 、8 # 。

　　5. 1 .5 广口标本瓶：500 mL。

　　5. 1 .6 孔径土壤筛：4 mm。

　　5 . 1 . 7 小铁铲 。

　　5 . 1 . 8 游标卡尺 。

　　5 . 1 . 9 白瓷盘 。

　　5 . 1 . 10 培养皿 。

　　5 . 1 . 1 1 镊子 。

　　5 . 1 . 12 剪刀 。

　　5 . 1 . 13 显微镊子 。

　　5 . 1 . 14 显微剪刀 。

　　5 . 1 . 15 微针 。

　　5 . 1 . 16 解剖蜡盘 。

　　5 . 1 . 17 标签 。

　　5. 1 . 18 移液枪：2.5 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL。

　　5 . 1 . 19 微型离心机。

　　5 . 1 . 20 PCR仪 。

　　5. 1 .2 1 离心管：1.5 mL。

　　5. 1 .22 PCR反应管：0.2 mL。

　　5 . 1 . 23 恒温金属浴。

　　5 . 2 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。

　　5.2. 1 75%乙醇。

　　5 . 2 . 2 无水乙醇。

　　5 . 2 . 3 硫酸镁 。

　　5 . 2 . 4 动物基因组 DNA提取试剂盒。

　　5.2.5 2 × PCR预混合液(2 × TaqPCR MasterMix)。

　　5 . 2 . 6 双蒸水 。

　　6 现场检疫

　　对来自疫区的集装箱、木质包装材料必须重点检查，仔细观察集装箱的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蜗牛。 对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应认真检查，对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。 蜗牛爬行过后，一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。 发现蜗牛，随时装入塑料自封袋或标本瓶带

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　　回实验室做进一步的检验鉴定。 发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或幼螺。

　　7 实验室鉴定

　　7 . 1 测量观察

　　用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒长和宽。 用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征。

　　7.2 尹氏蜗牛属 Eobania Hesse，1915 鉴定特征

　　贝壳大型，圆球形，螺旋部低矮。 受精囊具有延伸的盲管，其长度超过受精囊柄。 矢囊很小。 鞭状体一般比阴茎和阴茎本体短。 本属贝壳形态与耳螺属 otala Schumacher, 1817 相似，但前者壳口简单、口缘白色或接近棕色，外唇反折锋利;而后者壳 口有时有齿、口缘内侧深褐色，外唇反折、增厚、不锋利。

　　7 . 3 蠕虫尹氏蜗牛鉴定特征

　　7 . 3 . 1 卵

　　白色，椭圆形，长短径约为 3 mm × 4 . 1 mm。

　　7 . 3 . 2 贝壳

　　7 . 3 . 2 . 1 成螺

　　贝壳呈低矮圆球形，相当坚固，有 4 个 ~5 个螺层，各螺层适度膨胀。 体螺层圆形，在前方强烈向下倾斜。 壳面颜色多变，从黄白色到褐色，常有色带或斑点，呈蠕虫状，一般有 4 条 ~5 条深褐色条带，螺旋部色带常断裂成为一系列的斑点。 体螺层腹面在色带和脐孔之间的区域为淡白色。 壳口和口缘白色，口缘外折反卷。 胚螺层光滑。 次螺层有许多发达的锻锤状的雕刻。 贝壳无脐孔。 壳高 14 mm~

　　24 mm, 壳宽 22 mm~ 32 mm。 贝壳大小有地理分布上的差异，如在希腊的 Gávdos 岛，壳高可达

　　24.5 mm~33.5 mm(参见附录 B 中图 B.1)。

　　7 . 3 . 2 . 2 幼螺

　　幼螺贝壳外形与成螺基本相似，但口缘不外折，脐孔狭窄且开放，生长螺脐孔部分被轴唇外折所遮盖，至成螺时脐孔完全闭合。

　　7 . 3 . 3 螺体

　　浅褐色，腹足背部颜色较深，至腹部逐渐变为淡黄色(参见附录 B 中图 B. 2) 。

　　7 . 3 . 4 生殖系统

　　7 . 3 . 4 . 1 生殖系统解剖

　　将麻醉或闷杀(见 9 . 1)处理后的标本，剥去外壳，将软体固定在蜡盘上，在体视显微镜下，从头部的体右侧找到生殖孔。 解剖从生殖孔开始，先用显微剪刀沿生殖孔外围一圈剪开体壁，然后从背部纵向轻轻剪开体壁肌肉。 仔细辨认外生殖器的各种结构，尤其要注意阴茎牵引肌和输精管及受精囊的辨认。最后将生殖系统从体腔中分离出来。

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　　解剖完后，将生殖系统用解剖微针固定，按标准状态摆放(参见附录 B 中图 B. 3),然后进行拍照、绘图、特征观察和描述。

　　7 . 3 . 4 . 2 生殖系统特征

　　阴茎本体细长，其宽度与鞭状体差不多。 阴茎肿胀，呈梭形至棒状。 鞭状体也很长，末端逐渐变细。输精管长。 阴道长度适中。 矢囊不大，棍棒状。 恋矢横切面成“十”字状四瓣分裂。 游离输卵管扭曲，缠绕 。黏液腺从矢囊基部的上方插入阴道，非常发达，黏液腺 2 枝，每枝分两个树杈，基部长，棒状，每个树杈还继续各分两枝，末端有许多分叉，呈爪状。 受精囊柄长，具有相当长而稍微膨胀的颈部和强烈弯曲的盲管(参见附录 B 中图 B. 3) 。

　　7.3.5 COI基因片段序列鉴定

　　参见附录 C方法提取 DNA、PCR 扩增和测序，将所测序列与序列数据库 (Genbank) 登录号为KJ995731 已知蠕虫尹氏蜗牛的 COI 基因标准序列进行比对，相似度大于或等于 95% 确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品。

　　8 结果评定

　　以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体和生殖器解剖形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别(参见附录 D),符合 7 . 3 . 2 或同时符合 7 . 3 . 2、7 . 3 . 3、7 . 3 . 4 形态特征的蜗牛鉴定为蠕虫尹氏蜗牛。 单独查获的卵粒符合 7 . 3 . 1 形态特征，需按照 SN/T 3067—2011 , 8 . 4 饲养鉴定方法进行孵化和饲养实验。 符合7 . 3 . 5 作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证，当检测样品的 DNA 序列与已知蠕虫尹氏蜗牛的DNA 序列同源性大于或等于 95%时，确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品，需要进一步做形态鉴定。

　　9 标本处理和保存

　　9 . 1 标本处理

　　将蜗牛置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，进行闷杀，蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中，逐渐伸展身体;或逐渐加入少量硫酸镁，进行麻醉闷杀。

　　将闷杀后软体伸展的蜗牛标本置于 75%的乙醇溶液中固定，每隔 1 d~2 d 换 1 次乙醇溶液，共换3 次 ~4 次，便可长期保存于 75%的乙醇溶液中。

　　9 . 2 标本保存

　　经处理后的标本，至少妥善保存 6 个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　蠕虫尹氏蜗牛相关信息

　　A.1 名称

　　学名：Eobania℃ermiculata(Müller, 1774)

　　异名：Helix℃ermiculata Müller, 1774

　　英文名：Chocolate-band snail

　　A.2 寄主

　　杂食性，以各种绿色植物为食。 幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的茎、叶和果实，喜食多汁的蔬菜、水果和花卉等园艺作物。

　　A.3 分类地位

　　蠕虫尹 氏 蜗 牛 隶 属 软 体 动 物 门 Mollusca, 腹 足 纲 Gastropoda, 肺 螺 亚 纲 Pulmonata, 柄 眼 目Stylommatopgora, 大蜗牛科 Helicidae,尹氏蜗牛属 Eobania Hesse, 1913。该属为大蜗牛科一小属，仅有 3 个种。 蠕虫尹氏蜗牛的近似种有康氏坦丁尹氏蜗牛 E.constantinae ( Forbes, 1838)、梅西拉尹氏蜗牛 E.massylaea (Morelet, 1851)。

　　A.4 地理分布

　　大洋州：澳大利亚东南部。

　　亚洲：日本。

　　非洲：地中海沿岸国家。

　　欧洲：地中海盆地：从西班牙东部至克里米亚均有分布，具体分布包括以色列、埃及、西班牙东部、保加利亚东部、希腊南部和北部、乌克兰、克里米亚。 英国伦敦也有分布。

　　北美洲：美国南部加利福尼亚和新奥尔良。

　　A.5 危害性

　　蠕虫尹氏蜗牛主要危害蔬菜、草莓、饲草、果树、花卉等经济作物。 据文献报道，在埃及北部沿海地区，蠕虫尹氏蜗牛是最重要的农业有害生物，对农作物和果园生产构成了严重威胁，且危害正在逐年加重。

　　该蜗牛起源于南欧，是一种适应性强、危害严重的杂食性有害生物。 由于蠕虫尹氏蜗牛寿命长达5 年，成螺可连续几年产卵，因而极易在新区建立种群，危害作物和破坏生物多样性。 该螺入侵美国后，在葡萄园生栖危害，对加利福尼亚和德克萨斯的葡萄园构成严重威胁。 澳大利亚从地中海地区进口

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　　水果时，将蠕虫尹氏蜗牛列入检疫性有害生物名单，对于检疫中发现该蜗牛，都进行相应的熏蒸灭螺处理。

　　蠕虫尹氏蜗牛在中国没有分布，目前中国口岸已多次截获。 鉴于蠕虫尹氏蜗牛的危害性和传入风险及其在国际上的检疫地位，需要加强对该蜗牛的检疫，警惕其传入国内，危害农林生产。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　蠕虫尹氏蜗牛形态及生殖系统特征

　　蠕虫尹氏蜗牛形态及生殖系统特征见图 B. 1、图 B. 2 和图 B. 3 。

　　a)侧面

　　b)腹面 c)背面图 B.1 成螺贝壳形态特征

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　　图 B.2 螺体爬行状态特征图

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　　说明：

　　AG — 蛋白腺;

　　F — 鞭状体;

　　St —矢囊;

　　DSt —盲管;

　　MG — 黏液腺;

　　P — 阴茎;

　　E — 阴茎本体;

　　PR — 阴茎牵引肌;

　　S — 受精囊。

　　图 B.3 蠕虫尹氏蜗牛生殖系统形态(引schileyko)

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　蠕虫尹氏蜗牛 PCR鉴定方法

　　C.1 DNA 提取

　　取适量腹足肌肉，用 SDS 方法或动物基因组 DNA 试剂盒方法提取 DNA。

　　C.2 COI基因引物

　　LCO1490 : 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3

　　HCO2198 : 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′

　　PCR 目标产物片段大小约为 680 bp。

　　C.3 反应体系

　　反应体系为 20 μL：其中 DNA模板 2 μL, LCO1490(10 μmol/L) 0.5 μL, HCO2198(10 μmol/L)

　　0.5 μL,2×PCR预混合液 10 μL,双蒸水 7 μL。

　　C.4 PCR扩增条件

　　94 ℃ 5 min; 94 ℃ 50 s, 45 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s, 30 个 ~35 个循环;72 ℃ 10 min, 4 ℃。

　　C.5 测序

　　将 PCR 扩增样品送有资质的生物技术公司测序。

　　C.6 比对鉴定

　　将双向测序获得的 600 bp~700 bp 长度 DNA 序列，经软件拼接和人工校对后，与 Genbank 登录号为 KJ995731 已知蠕虫尹氏蜗牛的 COI 基因标准序列进行比对，相似度大于或等于 95% 的待鉴样品确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品。

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　蠕虫尹氏蜗牛与近似种的鉴别

　　蠕虫尹氏蜗牛与近似种鉴别特征比较见表 D. 1 。

　　表 D.1 蠕虫尹氏蜗牛与近似种鉴别特征比较