GB/T 36815-2018 蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36815—2018

　　蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofDiaporthevacciniShear

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36815—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：罗加凤、崔铁军、刘跃庭、张莹、黄国明、廖芳。

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　　蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了蓝莓果腐病菌的分离培养、致病性测定及分子生物学检测方法。

　　本标准适用于蓝莓果腐病菌寄主种苗、植株和果实中蓝莓果腐病菌的检疫鉴定。

　　2 蓝莓果腐病菌的基本信息

　　中文名：蓝莓果腐病菌

　　学名：Diaporthe℃accinii Shear

　　无性学名：phomopsis℃acciniiShear N.E. Stevens & H.F. Bain

　　英文名：fruit rot of blueberry, Phomopsis canker of blueberry, upright dieback of cranberry

　　分类地位：蓝莓果腐病菌(Diaporthe℃accinii Shear) 属真菌界(Fungi), 子囊菌门(Ascomycota) ,子囊菌纲(Ascomycetes), 间座壳目(Diaporthales), 间座壳科(Diapouthaceae), 间座壳属(Diaporthe)。

　　传播途径：病菌依靠带菌种苗和果实进行远距离传播。

　　蓝莓果腐病菌的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征、致病性测定(参见附录 A、附录 B、附录 C) 及 ITS1/ ITS4 核酸序列比对结果作为蓝莓果腐病菌的检疫鉴定依据。

　　4 仪器用具和主要试剂

　　4 . 1 仪器用具

　　4 . 1 . 1 仪器

　　体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱(- 20 ℃ ) , PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。

　　4 . 1 . 2 用具

　　灭菌培养皿(直 径 90 mm~ 100 mm)、三 角 瓶、镊 子、手 术 剪、手 术 刀、接 种 针、一 次 性 注 射 器(1 mL)、棉纱、脱脂棉、酒精灯、塑料研杵、可调微量加样器。

　　4 . 2 主要试剂

　　乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris-HCl、氯仿、异戊醇、三氯甲烷、乙醇、氯化钾、氯化镁、蛋白酶 K、引物 ITS1/ ITS4、Taq聚合酶等分子生物学试剂，或用植物组织及真菌基因组提取试剂盒提取 DNA。 葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、乳酸、2 . 0%次氯酸钠 ( NaClO) 。

　　酸性马铃薯葡萄糖培养基(APDA, pH 5 . 0~6 . 0)、APDA选择性培养基(制备方法参见附录 D) 。

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　　5 病菌的鉴定

　　5 . 1 症状检查

　　取待检植株，观察植株枝条是否有萎蔫，树皮下是否有溃疡病斑，芽周围的树皮是否变褐色，叶片上是否有病斑，果实是否有腐烂，枝、叶、果实上是否有病菌的子实体(分生孢子器或子囊壳，参见附录 A中图 A. 1) 。发现子实体的，直接进行镜检;发现有可疑症状但未发现子实体的，取可疑的枝、叶、果实 一部分进行保湿培养，诱发分生孢子器产生，一部分进行分离培养。

　　5 . 2 直接镜检

　　发现病菌子实体的，直接用灭菌的挑针或牙签挑取，制片镜检，显微镜下观察分生孢子器、分生孢子的形态特征，同时将孢子转接到 APDA选择性培养基上进行分离培养。

　　5 . 3 保湿培养

　　可疑枝条病健交界部分，用手术刀切成 5 cm~7 cm 长的片段，叶片取整片叶片或切取部分叶片，果实取整个果实，灭菌水冲洗后进行保湿培养，21 ℃ ~24 ℃ , 12 h/ 12 h光照黑暗交替培养，注意保持湿度，在体式显微镜下观察是否有分生孢子器等产孢结构形成。 分生孢子产生后及时转接到 APDA 选择性培养基上进行分离培养。

　　5 . 4 病原菌的分离培养

　　未发现病菌子实体的样品进行组织培养，将有可疑症状的枝、叶、果实病健交界处组织剪成 1 cm~ 2 cm 长的片段，自来水冲洗后，2 . 0%次氯酸钠表面消毒 1 min,再用灭菌水冲洗 3 次，置 APDA 选择性培养基平板上，20 ℃ ~ 24 ℃培养，培养 3 d 开始观察菌落形态，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用APDA纯化，黑暗培养，7 d后体视显微镜下观测分生孢子器产生情况，显微镜下测定分生孢子器、分生孢子形态特征。

　　5 . 5 致病性测定

　　如有必要，进行致病性测定。

　　泥炭和沙子按照 1 ∶ 1 的比例混匀后，种植蓝莓苗，当蓝莓花芽长出时，用蓝莓果腐病菌孢子悬浮液(孢子适宜浓度为 1 × 10 6 CFU/mL)对蓝莓花芽进行喷雾接种，以蒸馏水为对照，接种后放入培养箱内20 ℃ ~28 ℃黑暗条件下保湿培养 3 d,然后移至温室继续培养。

　　接种后观察植株发病情况，如出现可疑病斑，取病健交界处组织 2 . 0%次氯酸钠溶液消毒 1 min,无菌水清洗 3 次，置 APDA选择性培养基上培养并进行病菌再分离。

　　5 . 6 核酸序列比对

　　5 . 6 . 1 引物

　　采用 ITS1/ ITS4 进行扩增，目标片段约为 590 bp。

　　ITS1 : 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

　　ITS4 : 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

　　5 . 6 . 2 DNA提取

　　可疑菌株在 APDA上生长 7 d左右，取菌丝提取 DNA(参见附录 E),也可用植物组织及真菌基因

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　　组提取试剂盒提取 DNA,提取步骤详见使用说明。

　　5.6.3 PCR反应

　　PCR反应体系总体积 30 μL,包含：缓冲液 3.0 μL; 10 mmol/L dNTP 0.5 μL;Taq聚合酶 2.5 U;引物各 0.5 μL(20 μmol/L);DNA模板 1 μL。反应程序：94 ℃预变性 2 min; 94 ℃ 1 min, 53 ℃ 1 min, 72 ℃延伸 1.5 min, 30 个循环;72 ℃延伸 10 min。

　　扩增产物在 1 . 5%琼脂糖凝胶 1 × TAE 缓冲液中电泳，EB 染色后凝胶成像，如有 目标片段大小的单带出现，扩增产物进行序列测定。

　　将测序获得的序列与 NCBI 网站 GenBank 中相关序列进行同源性比对分析。

　　6 鉴定特征

　　6 . 1 培养性状

　　APDA培养基上菌落平铺不隆起，乳白色，也有的菌落为黄灰色或灰褐色，产生 3 个 ~5 个界限明显的环痕(个别菌株不产生环痕)，菌落老熟后环痕不明显，菌丝毡状或羊毛状，菌落生长较快，速度为

　　10 mm/d~12 mm/d;培养 7 d后菌落中出现黑色的分生孢子子座，皮革状，0 . 8 mm~2 . 8 mm, 内生分

　　生孢子器，参见附录 B 中图 B. 1 。

　　6 . 2 形态特征

　　无性态形态特征：分生孢子器黑色，部分埋生于寄主组织或培养基质内，球形至不规则形，基部宽，

　　散生或合生，单腔，单孔口，寄主上的分生孢子器较培养基上的小，大小为 0 . 2 mm× 0 . 5 mm,培养基上大小为(0 . 5 mm~1 . 0 mm) × (1 . 2 mm ~1 . 3 mm),分生孢子器常不规则破裂，释放白色、淡黄色或粉红色成团的分生孢子黏液。 分生孢子两种形状 α 型和 β 型：α 孢子无色，单胞，透明，椭圆形，具 2 个明显

　　的油球，大小(6 μm~10.5 μm) × (2.2 μm~3.2 μm),平均 7.8 μm×2.9 μm; β 孢子线形，钩状，单胞，无色，大小(15 μm~24 μm) × (1 μm~1.5 μm),平均 20 μm×1.2 μm,参见附录 B 中图 B.2。分生孢子黏

　　液中 α 型孢子丰富，β 型孢子则较少。

　　有性态形态特征：有性阶段子囊壳需经过越冬阶段在 2 年 ~3 年枯死枝条上产生，子囊壳通常在树皮和木质部之间生成，有时靠近分生孢子器。 成熟的子囊壳具长颈，突出树皮外，子囊壳直径(0 . 3 mm~

　　0.5 mm) × (0.2 mm~0.4 mm),球形，黑色，壁厚多层，基部较平;子囊椭圆形，无柄，(37 μm~51 μm) × (7 μm~12 μm),孔口小，顶部增厚，含 8 个子囊孢子;子囊孢子椭圆形，有时不规则形，大小(8 μm~ 12 μm) × (2 μm~3 μm),双胞，隔膜处稍缢缩，各具 1 个油球。 培养基上较难产生子囊壳，培养时间长，子囊和子囊孢子较寄主上小，子囊大小为 (32 μm~ 48 μm) × ( 5 . 8 μm~ 9 . 6 μm), 子囊孢子为(6.4 μm~12.8 μm) × (2.5 μm~4.2 μm)。

　　蓝莓果腐病菌与蓝莓上其他近似种的区别参见附录 F。

　　6 . 3 致病性测定的症状表现

　　接种后的幼苗在温室生长 3 d后，接种的花出现坏死，随着花盛开，坏死的情况进一步扩展。 接种后 1 周，与花芽毗邻的茎出现坏死，在接种 2 周 ~3 周后病斑继续扩展，茎上坏死溃疡病斑发展成深褐色(参见附录 C 中图 C. 1) 。

　　发病植株茎部病健交界处组织消毒后分离培养，7 d 后长出 6 . 1 及 6 . 2 所述典型菌落和分生孢子器，可证明分离菌是蓝莓果腐病菌的病原菌。

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　　6 . 4 ITS序列比对

　　ITS1/ITS4 扩增得到大小约为 590 bp 的片断，测序结果与 NCBI 网站 GenBank 中 Diaporthe℃ac- cinii菌株(如：EU571098.1 等)序列比对，同源性为 99%~100%。

　　7 结果判定

　　病原菌培养性状和形态特征符合 6 . 1 及 6 . 2 中描述，ITS 序列比对结果与 6 . 4 描述相符，可鉴定为蓝莓果腐病菌。

　　8 样品保存

　　8 . 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存。 对检出蓝莓果腐病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中，以备复核，保存期满后高压灭菌处理。

　　8 . 2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为蓝莓果腐病菌的菌株，应妥善保存。 将菌株接种于 PDA 培养基斜面上，存活后置于 4 ℃ ~8 ℃黑暗条件下保存，定期(3 个月)转接，以防止病菌死亡，至少保存 6 个月，必要时用病菌分生孢子制作冻干菌种保存。

　　8 . 3 结果记录与资料保存

　　实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员签字。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　蓝莓果腐病菌的其他信息

　　A.1 寄主范围

　　大果蓝莓(vaccinium macrocarpon)、蔓蓝莓(v.oxycocco)、蔓蓝莓中间变种(v.oxycoccos var. intermedium)、高灌蓝莓(v.corymbosum)、兔眼蓝莓(v.ashei)。

　　A.2 地理分布

　　欧洲：英国、荷兰、德国、罗马尼亚、立陶宛。

　　北美洲：加拿大、美国(阿肯色州、伊利诺伊州、印第安纳州、马里兰、马萨诸塞州、密歇根州、新泽西州、北卡罗来纳州、俄勒冈州、华盛顿、威斯康星州)。

　　南美洲：智利。

　　A.3 症状特征

　　多汁的、当年生的蓝莓枝条染病后，4 d就开始萎蔫并出现小的病斑，病菌继续通过茎向下传播，使大多数枝条甚至整株植物枯死，茎上尤其是茎基出现窄而长的、凹陷或平的溃疡病斑，常被树皮所覆盖， 2 年生蓝莓则常显示木质部的褪色;病菌侵入叶片产生褐色病斑，叶片上病斑直径 1 cm,分生孢子器通常出现在 3 年 ~5 年生的老茎上，8 月 ~10 月发生;花芽染病后首先变褐枯萎，随后花芽周围的树皮变为褐色并坏死，随着花芽的开放，新的侵染又开始。 生长季节的后期，叶部出现无数小的坏死斑并逐渐联合起来，导致叶片枯萎;果实受侵染后变为红褐色，出现黏性软腐，常裂口渗出黏稠状液体。 蓝莓果腐病菌在植株上的症状如图 A. 1 所示。

　　图 A.1 蓝莓果腐病菌在植株上的症状

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　　说明：

　　a—蓝莓枝条萎蔫症状及茎杆上的分生孢子器;

　　b —花芽受害萎蔫枯死症状;

　　c — 叶片褐色病斑;

　　d— 大果蓝莓(v.macrocarpon)果实开裂渗出黏稠状液体;

　　e—蔓蓝莓(v.oxycocco)果实黏性软腐症状。

　　注：a、b、c、d 引 自 2009 OEPP/EPPO , Bulletin 39, PM7/86 ; e 引 自 P. McManus, 1998。

　　图 A.1(续)

　　A.4 传播途径

　　近距离传播：蓝莓果腐病病原菌在枯死的枝蔓上越冬，子囊孢子或分生孢子在潮湿的环境条件下通过雨水飞溅或流动扩散传播，开始从花芽入侵，再进入维管组织引起枯萎，病原菌通过维管组织侵入茎干并向基部扩散至老枝，初期病害的发展迅速，几天后侵染的枝条出现明显的症状。 萌发的分生孢子在生长季节进入果实并且一直潜伏，直至收获季节果实成熟引起果实的腐软，果汁渗漏。

　　远距离传播：病菌依靠带菌种苗和果实及枝叶残体进行远距离传播。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　蓝莓果腐病菌培养性状和形态特征

　　APDA培养基上蓝莓果腐病菌的培养性状如图 B. 1 所示。

　　说明：

　　a—APDA上环痕状菌落;

　　b —菌落中环状排列的黑色分生孢子子座。

　　图 B.1 APDA培养基上蓝莓果腐病菌的培养性状

　　蓝莓果腐病菌培养性状和形态特征如图 B. 2 所示。

　　图 B.2 蓝莓果腐病菌培养性状和形态特征

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　　说明：

　　a— 分生孢子器及孔口溢出的黄色分生孢子黏液;

　　b — α孢子和 β孢子;

　　c — 分生孢子器孔口溢出的白色分生孢子黏液;

　　d—具 2 个明显油球的 α孢子。

　　图 B.2(续)

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　致病性测定症状表现

　　致病性测定症状表现如图 C. 1 所示。

　　注：引 自 M.E. Daykin等，1990。

　　图 C.1 致病性测定症状 —4 周后枝条上出现深褐色溃疡病斑

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　　附 录 D

　　(资料性附录)培养基配制方法

　　D.1 酸性马铃薯葡萄糖培养基(APDA)

　　马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取 200 g,蒸馏水中煮 30 min,用 4 层纱布过滤，加入 20 g葡萄糖、 18 g琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至 1 000 mL,用乳酸将 pH 调至 5 . 0~6 . 0,分装于三角瓶中， 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　D.2 APDA选择性培养基

　　高压灭菌后的 APDA冷却至 45 ℃ ~50 ℃时，无菌操作下 1 000 mL培养基中分别加入 0 . 3 g链霉素和 0 . 3 g青霉素，混匀，倒平板，静置备用。

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　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　DNA提取方法

　　DNA提取步骤如下：

　　a) 挑取菌丝约 0 . 1 g,用灭菌滤纸吸干水分，放入 1 . 5 mL离心管中，加液氮冷冻，用塑料杵磨碎菌丝，待用。

　　b) 离心管中加入 400 μL~500 μL CTAB缓冲液和 0.1 g蛋白酶 K,混匀，65℃水浴 1 h, 14 000 g离心 5 min,保留上清液。

　　c) 取上清液，加 500 μL 的 Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) 混匀，14 000 g 离心5 min 。

　　d) 取上清液于 1 . 5 mL离心管中，加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1),轻摇混匀，14 000 g 离心5 min 。

　　e) 取上清液，加入 1 mL异丙醇混匀，-70 ℃下放置 1 h,或 -20 ℃过夜;13 000 g离心 10 min,可见 DNA沉淀。

　　f) 弃去上清液，冷70%乙醇洗 DNA沉淀 2 次，室温干燥;用 30 μL~50 μL Tris-EDTA缓冲液溶解 DNA。

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　　附 录 F

　　(资料性附录)

　　蓝莓果腐病菌与其近似种的区别

　　蓝莓果腐病菌与其近似种的区别如表 F. 1 所示。

　　表 F.1 蓝莓果腐病菌与其近似种的区别

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　　参 考 文 献

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