GB/T 36809-2018 可可丛枝病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36809—2018

　　可可丛枝病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofMoniliophthoraperniciosa

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36809—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：冯黎霞、王卫芳、何日荣、魏霜、刘福秀、何瑞芳。

　　GB/T 36809—2018

　　可可丛枝病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了植物检疫中可可丛枝病菌(Moniliophthoraperniciosa)的检疫鉴定方法。

　　本标准适用于可可丛枝病菌的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 1538 . 1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则

　　3 方法原理

　　可可丛枝病菌在寄主上的为害症状、病菌形态学特性与培养特征及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。 该病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录 A。

　　4 设备用具

　　4 . 1 仪器设备

　　体视显微镜、生物显微镜、电子天平(感量 0. 001 g)、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱、PCR

　　仪、电泳仪和凝胶成像系统。

　　4 . 2 实验用具

　　标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、镊子、解剖刀、酒精灯、接种针、培养皿(直径9 .0 cm)、烧杯、量筒、三角瓶、载玻片、盖玻片、可调移液器(可调范围 2.5 μL~1 000 μL)、离心管。

　　5 试剂和培养基

　　5 . 1 试剂

　　青霉素、链霉素、无水乙醇、马铃薯、葡萄糖、琼脂、70%乙醇、无菌双蒸水、2% CTAB 提取缓冲液、 10% SDS 溶液、3 mol/L 醋酸钠溶液、PCR试剂(包括 Taq 聚合酶、dNTP、缓冲液)、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCl、EDTA(乙二胺四乙酸)、琼脂糖、分子量标准物、TAE 电泳缓冲液。

　　5 . 2 培养基

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) : 200 g 去皮马铃薯，20 g 葡萄糖，18 g 琼脂，加水至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　PDA选择性培养基：高压灭菌后的 PDA冷却至 45 ℃ ~50 ℃ ,无菌操作条件下 1 000 mL 培养基

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　　中加入 0.3 g链霉素和 0.3 g青霉素，混匀，倒平板，静置备用。

　　燕麦可可培养基：21 g CaSO4 , 517 g 干燥的可可枝条(研磨成粉末状)，138 g 燕麦粉，700 mL 水，混匀后分装到三角瓶中，121 ℃高压灭菌 20 min,静置冷却备用。

　　配制培养基时，按照 SN/T 1538 . 1 的要求。

　　6 检验鉴定方法

　　6 . 1 症状检查

　　6 . 1 . 1 可可种子症状检查

　　将待检样品倒入洁净白瓷盘内，检查种子是否有粘附，挑选干瘪、弱小、畸形、变色的可疑病种子，用手术刀剥离种皮和种子，检查病部是否有菌丝体(症状特点参见附录 B 图 B. 1) 。无症种子随机取样后待保湿培养。

　　6 . 1 . 2 苗木症状检查

　　仔细检查植株枝条有无徒长、变色、肿胀，树皮有无变色、开裂、溃疡、腐烂，枝条、腋芽、叶片等部位有无异常增殖，枝条是否从顶端开始干枯死亡，肉眼或显微观察干枯枝条树皮内层是否有菌丝，帚状老枝上是否有真菌担子果(症状特点参见图 B. 1、图 B. 3、图 B. 4) ,担子果下方枝条上是否有白色的孢子堆。将可疑枝条和种子样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样 日期等信息。

　　6 . 2 实验室鉴定

　　6 . 2 . 1 直接检验

　　观察记录病组织的外观及剖面症状特点，将有明显病征的病枝与病果置于体视显微镜下检查，挑取病部菌丝体、孢子堆，制成玻片，置于生物显微镜下镜检。

　　6 . 2 . 2 保湿培养

　　如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝(剥开树皮，用剪刀剪成 0 .4 cm×0 .4 cm)或病果(用手术刀剥离种皮和种子)置于样品袋中，于 25 ℃在黑暗条件下保湿培养，5 d 后，观察症状的变

　　化，进行显微镜检及病原菌的分离培养。

　　6 . 2 . 3 菌丝体分离培养

　　直接挑取病部的子实体或孢子团，置于 PDA 选择性培养基平板上;或采用组织分离培养法，用

　　70%乙醇对植物组织表面消毒 30 s,风干后用消毒过的刀片切取病健交界处组织，切成 0 .4 cm×0 .4 cm小块后放置于 PDA选择性培养基平板上，在黑暗或弱光条件下 28 ℃培养 5 d~15 d,定期观察，将菌落

　　边缘菌丝体置于新鲜的 PDA平板上进行纯化，以便于后续的形态学和分子生物学鉴定。

　　6 . 2 . 4 担子果和担孢子纯化培养

　　挑取 PDA平板上培养的菌丝块，植入无菌燕麦可可培养基，28 ℃、黑暗或弱光条件下保湿培养30 d,放大镜或肉眼观察是否有担子果产生，担子果下方是否有白色的担孢子堆。

　　6 . 2 . 5 病原菌形态和培养性状观察

　　PDA上纯化菌落生长 7 d后，体式显微镜下观测菌落中是否有病菌孢子形成，记录菌落培养性状，

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　　包括菌落生长速度、颜色、形状等，如有孢子产生，则将培养皿放在显微镜(100×)或(200×)下观察孢子生长方式，并挑取少许制片，在生物显微镜下镜检，观测菌丝、孢子形态特征。显微镜(1 000×)下测量孢子的形状、大小、孢子孢壁厚度等。在 28 ℃、黑暗或弱光条件下，观察菌落生长速度、颜色变化、担子

　　果和担孢子的形成情况。 相似致病菌可可链疫孢荚腐病菌的菌丝体和菌落特征与可可丛枝病菌有显著不同，两者的异同点是鉴定区分两病菌的关键(两者异同点参见附录 C) 。

　　6 . 2 . 6 分子生物学鉴定

　　6 . 2 . 6 . 1 DNA提取

　　采用附录 D 的方法提取病菌基因组 DNA。

　　6 . 2 . 6 . 2 PCR检测及 ITS基因分析

　　采用附录 D扩增检测病菌基因组 DNA 中的 ITS基因，测序后进行 BLAST 与系统发育分析。

　　7 鉴定特征

　　7 . 1 病菌形态

　　新鲜菌丝无色，呈弯曲膨大状态，菌丝间相互缠绕，菌丝宽 5 μm~ 50 μm,为单核菌丝;随时间推移，菌丝变细窄，菌丝宽 1 μm~3 μm,成长为双核菌丝，并开始出现锁状联合(菌丝体形态参见图 B.2)。在适当的湿度条件下，产生担子果，呈蘑菇状，菌盖粉红至深红，(31 μm~32 μm) × (7 μm~9 μm) ,担孢子纯白色，半透明，(7 μm~11 μm) × (4 μm~5 μm)。

　　7 . 2 菌落特征

　　菌落在 PDA平板上初为纯白色，后为奶油色，圆形，不隆起，菌丝致密，平铺于培养基表面形成毡状菌丝层，打开培养皿盖，菌落有蘑菇气味。

　　7 . 3 ITS序列特征

　　PCR 扩增产物大小约为 650 bp,在 GenBank 中进行 BLAST 分析，病菌与已知的可可丛枝病菌菌株的 ITS1-18S、5.8S-IST2、28S 区域序列 GQ919138、GQ919120、GQ919118、EU047930、EU047936 等

　　的同源性最高，系统发育分析显示病菌菌株与可可丛枝病菌聚在同一簇。

　　8 结果鉴定

　　符合下列任一种情况均可判定为检出可可丛枝病菌：

　　— 如果病部有明显的病状和病征，病菌形态学特征与鉴定指标 7 . 1 吻合，扩增得到的 ITS 序列在系统发育树上与可可丛枝病菌聚在一簇;

　　— 如果病部有病状但无病征，经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌形态学特征及培养性状与鉴定指标 7.1~7. 2 吻合，并且扩增得到的 ITS 基因在系统发育树上与可可丛枝病菌聚在一簇。

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　　9 样品和资料的保存

　　9 . 1 样品的保存

　　样品经标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人后置于 4 ℃冰箱保存;可可丛枝病菌纯分离物标注后，菌株在含 30%甘油的冻存管中于-80 ℃保存，或将菌株转接在 PDA 斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于 4 ℃下保存，并定期(180 d)转管。

　　对鉴定为可可丛枝病菌的样品至少保存 6 个月，以备复核谈判和仲裁，样品保存期满后，应无害化处理。

　　9 . 2 检验资料的保存

　　妥善保存检验资料，以备复核、谈判和仲裁。 检验报告应注明检验时间、方法和结果等，并有检验检疫员的签名;检验图片包括症状、病菌等。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　可可丛枝病菌技术性资料

　　A.1 分类地位

　　学名：Moniliophthoraperniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora (2005)

　　异名：Marasmiusperniciosus Stahel(1915);crinipellisperniciosa (Stahel) Singer(1942)

　　英文名：witches’broom disease(WBD) , crinipellis pod rot

　　分类地位：真菌界 (Fungi) , 担子菌 门 (Basidiomycota) , 担子菌纲 (Basidiomycetes) , 伞菌亚纲(Agaricomycetidae) ,伞菌目(Agaricales) , 口蘑科(Tricholomataceae),链疫孢属(Moniliophthora)。

　　A.2 寄主范围

　　可可(Theobromacacao)、尖叶异翅木(Heteropterysacutifolia)、红木(Bixaorellana)、辣椒(cap- sicum annuum)、番茄(solanum lycopersicum)、茄子(s.melongena)、洋茄(s.lycocarpum)、锥花茄(s.paniculatum)、s.cernuum、Boutelouaeriopoda、Arrabidaea℃errucosa，以及可可属(Theobroma)、茄科 ( Solanaceae)、紫 葳 科 (Bignoniaceae)、金 虎 尾 科 ( Malpighiaceae)、梧 桐 科 ( Sterculiaceae)、 Herrania属其他一些植物。

　　A.3 地理分布

　　主要分布在拉丁美洲及加勒比海地区：巴西、巴拿马、秘鲁、哥伦比亚、玻利维亚、厄瓜多尔、委内瑞拉、伯里兹、多米尼加、格林纳达、圣文特森、特立尼达与多巴哥、圭亚那、苏里南。

　　A.4 危害症状

　　可可丛枝病菌在可可营养生长时期、花期、结荚成熟期都可以侵染，侵染部位为叶、茎、荚果、种子和花序。 侵染后，茎干外部褪色，溃疡，生长不正常，枝条肿大，感病植株在茎、叶片等部位产生丛枝症状，腋芽丛生。 果实、花序发生肿大、畸形，病部有变色坏死症状。 叶片生长不正常，叶柄、叶枕肿大致叶片成三角形，有时叶脉及叶肉肿大，叶片坏死。 果实肿大畸形，果肩宽，向下渐窄如胡萝 卜状，果实/果荚有褪色现象，坏死组织有黑褐色或黑色边缘，流出不正常粘液，种子粘连在一起。 感病植株枝条干枯坏死后，会长出菌盖为粉红色至深红色的子实体，菌盖颜色随时间推移而变暗。

　　A.5 病害循环

　　可可丛枝病菌病害循环具明显的寄生和腐生两个生长阶段。 首先病菌担孢子产生芽管通过气孔侵入植物分生组织，引起植株增生和畸形，失去顶端优势形成丛枝，病菌在植物细胞间营活体寄生生活，此时菌丝体为单核菌丝，菌丝弯曲呈波纹状，较宽，无锁状联合，人工接种条件下，活体寄生阶段可以持续

　　60 d左右;在病菌危害组织坏死、死亡前或后，菌丝体发展为双核菌丝，较窄，具锁状联合，病菌侵入细

　　胞内，营腐生生活，在干湿度合适的条件下，产生担子果，并形成担孢子，完成病害循环。

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　　A.6 传播途径

　　可可丛枝病菌主要通过果荚内部组织和种子表面粘附的孢子和菌丝远距离传播，病菌也能侵染植株，随苗木远距离传播。 由子实体产生的担孢子可以在高湿度的情况下经由空气传播，担孢子产生芽孢通过气孔侵染寄主的根、茎、花及幼果。 病菌在田间不能够通过茄属植物进行传播。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　可可丛枝病菌为害症状、病菌的形态特征图

　　a)可可植株腋芽丛生症状 b)可可荚果腐烂症状

　　图 B.1 M.perniciosa在可可植株和荚果上的为害状

　　a)活体营养阶段 b)腐生营养阶段

　　图 B.2 M.perniciosa菌丝体形态

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　　a)不同发育阶段的担子果 b)释放孢子后的担子果 c) 田间可可上的担子果

　　图 B.3 M.perniciosa担子果形态

　　a)接种 30 d后茎

　　尖轻微肿胀增大

　　b)接种 80 d后接种部位

　　明显肿胀增大并有腋芽丛生

　　c)接种 100 d后茎尖坏死 d)接种 270 d后干枯枝条上的担子果

　　图 B.4 可可苗接种 M.perniciosa后不同时间阶段的症状变化

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　可可丛枝病菌与可可链疫孢荚腐病菌的比较

　　可可丛枝病菌与可可链疫孢荚腐病菌异同见表 C. 1 。

　　表 C.1 可可丛枝病菌与可可链疫孢荚腐病菌异同

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　PCR检测鉴定方法

　　D.1 DNA提取 —CTAB法

　　采用常规 CTAB法提取病菌基因组 DNA作扩增模板，分离材料可选寄主病部的菌丝体、担子果或

　　担孢子堆，也可选分离物菌落边缘新鲜菌丝(PDA 培养基、25 ℃、黑暗条件下培养 5 d) 20 mg。加入 570 μL 2% CTAB提取液，30 μL 10% SDS 溶液，充分研磨，65 ℃水浴 30 min,加入 600 μL 酚氯仿液(酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇 25 ∶ 24 ∶ 1)抽提 2 次，11 000 g 常温离心 5 min,取上清液，加入 1/10 体积 3 mol/L醋酸钠溶液和 2 倍体积无水乙醇混匀，室温静置 20 min, 11 000 g 4 ℃离心 10 min,弃上清液，沿离心管壁加入 1 mL 70%乙醇溶液清洗 DNA 沉淀，11 000 g 4 ℃离心 5 min,弃上清液，加入 40 μL Tris-EDTA缓冲液溶解，置于-20 ℃备用。也可用商品化的适合真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌

　　丝 DNA。

　　D.2 PCR反应

　　PCR 引 物：ITS6 ( 5′-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′) ( Cooke, 1997) , ITS4 ( 5′-TCCTC-

　　CGCTTATTGATATGC)(White, 1990)PCR反应体系见表 D.1。每个样品设 2 个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。PCR 反应条件：95 ℃ 3 min;

　　95 ℃ 50 s , 58 ℃ 50 s , 72 ℃ 1 min, 30 个循环;72 ℃ 7 min延伸 。

　　表 D.1 PCR反应体系

　　D.3 PCR产物检测

　　用 1 × TAE 配制 1.2%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至 55 ℃左右。将 5 μL 溴化乙锭(EB)加入到配制好的 100 mL凝胶中。将凝胶倒入凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入 1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约 1 mm,冷却静置。将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔，同时设计 PCR 的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标准物(Marker)。接通电源，以 3 V/cm~5 V/cm 电场强度进行电泳，0.5 h后观察结果。电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。

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　　D.4 PCR产物测序、ITS序列 BLAST及系统发育分析

　　PCR产物纯化后测序，测序结果与 NCBI/GenBank 数据库中的已知序列进行 BLAST 比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种。从 GenBank 获得与实验菌株 ITS 序列同源性较高的相关种属的 ITS序列，构建系统发育树。用 MEGA version 4.0.1 进行进化分析，进化树的构建采用 Neighbour-joining

　　方法，设置均为默认值，同时计算进化距离及各分支的置信度。

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　　参 考 文 献

　　[1] Aime M C, Mora W P. The causal agents of witches broom and frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao)form a new lineage of Marasmiaceae [J]. Mycologia, 2005 , 97 (5) : 1012-1022 .

　　[2] Cooke D E L, Duncan J M. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on ITS1 and ITS2 sequences of the ribosomal RNA gene repeat[J].Mycological Research, 1997 , 101 : 667-677.

　　[3] Lyndel W M, Johana R, Bryan A B, et al.Moniliophthora perniciosa，the causal agent of witches broom disease of cacao : what’s new from this old foe? [J].Molecular Plant Pathology, 2008 , 9 (5) : 577-588 .

　　[4] Marelli J P, Maximova S N, Gramacho K P, et al.Infection biology of Moniliophthoraperni- ciosa on theobroma cacao and Alternate solanaceous Hosts [J]. Tropical Plant Biology, 2009 , 2 : 149-160 .

　　[5] Scarpari L M, Meinhardt L W, Mazzafera P, et al. Biochemical changes during the develop- ment of witches broom : the most important disease of cocoa in Brazil caused by crinipellisperniciosa [J].Journal of Experimental Botany,2005,56(413) : 865-877.

　　[6] White T J , Bruns T D, Lee S, et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal DNA genes for phylogenetics [J].Academic Press, 1990 , 315-322.