GB/T 36808-2018 木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36808—2018

　　木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofxanthomonascassavae(exwieheetDowson)

　　vauterinetal.

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36808—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局、中华人民共和国临沂出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：封立平、厉艳、管旭芳、赵丽青、夏明星、伦才智、王简、王英超、吴兴海、邵秀玲。

　　GB/T 36808—2018

　　木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了植物检疫中木薯细菌性叶斑病的检疫鉴定方法。

　　本标准适用于木薯繁殖材料中叶、地上茎、幼苗、树干及树枝中木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 28096—2011 木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法

　　3 木薯细菌性叶斑病菌的基本信息

　　3 . 1 名称

　　学名：xanthomonascassa℃ae (ex Wiehe et Dowson)Vauterin et al.

　　异名：xanthomonascampestrispv.cassa℃ae(Wiche &Dowson 1953) Maraite &Weyns 1979

　　英名：Cassava leaf spot

　　3 . 2 分类地位

　　木薯细菌性叶斑病菌属细菌界 Bacteria,变形菌门 Proteobacteria,变形菌纲 Gammaproteobacteria,黄单胞菌目 Xanthomonadales,黄单胞菌科 Xanthomonadaceae,黄单胞菌属 xanthomonas。

　　4 方法原理

　　木薯细菌性叶斑病菌侵染木薯(Manihotesculenta)。 主要通过带病的根茎、叶片等传播，其症状特点(参见附录 A)、培养性状和生物学特性(参见附录 A)、致病性测定、病原菌分子生物学特征是该病菌的鉴定依据。

　　5 仪器设备

　　5 . 1 电子天平。

　　5.2 生物显微镜：放大倍数 40 × ~1 000 ×。

　　5 . 3 生物安全柜：符合 EN 12469 : 2000 。

　　5 . 4 温控培养箱：温控范围 5 ℃ ~50 ℃ 。

　　5 . 5 高压灭菌锅：灭菌工作温度 105 ℃ ~138 ℃ 。

　　5.6 PCR仪：控制精确度 ±0.25 ℃ ,温度范围 4 ℃ ~99 ℃。

　　5 . 7 琼脂糖水平电泳仪。

　　5 . 8 凝胶成像分析系统。

　　GB/T 36808—2018

　　5.9 离心机：转速<8 000 r/min。

　　5. 10 超低温冰箱：-80 ℃。

　　5. 1 1 人工气候箱：控湿范围：相对湿度 50%~95%;控温范围：5 ℃ ~50 ℃;光照度：3 000 lx/12 000 lx/ 22 000 lx两面光照，五级可调。

　　5. 12 单道可调微量加样器：适配标准吸嘴 2.5 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。

　　5. 13 BIOLOG GENⅢ细菌自动鉴定系统(可选)。

　　5 . 14 其他：包括解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、枪头、放大镜、手术剪、镊子、试管、接种环等。

　　6 化学试剂

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

　　6 . 1 无水乙醇。

　　6 . 2 乙二胺四乙酸(EDTA) 。

　　6 . 3 十二烷基硫酸钠(SDS) 。

　　6 . 4 聚乙烯吡咯烷酮。

　　6 . 5 三氯甲烷。

　　6 . 6 异戊醇。

　　6 . 7 异丙醇。

　　6 . 8 DL2000 DNA Marker。

　　6 . 9 琼脂糖。

　　6 . 10 1%次氯酸钠溶液：将 1 mL次氯酸钠加到 100 mL蒸馏水中。

　　6. 1 1 三烃甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,pH 8.0)：称量 121.1 g Tris 置于 1 L烧杯中，加入约 800 mL 的去离子水，充分搅拌溶解。 加入约 42 mL 的浓盐酸调节 pH 至 8 . 0 。将溶液定容至 1 L。 高温高压灭菌后，室温保存。

　　6 . 12 10 mg/mL蛋白酶 K溶液：将 0 . 1 g 蛋白酶 K 溶解于 10 mL 去离子水中。 保存在- 20 ℃冰箱里，避免反复冻融。

　　6. 13 6×上样缓冲液：称量 EDTA 4.4 g、Bromophenol Blue 250 mg、Xylene Cyanol FF 250 mg, 共置于 500 mL烧杯中。 向烧杯中加入约 200 mL 的去离子水后，加热搅拌充分溶解。 加入 180 mL 的甘油后，使用 2 mol/L氢氧化钠调节 pH 至 7 . 0 。用去离子水定容至 500 mL后，室温保存。

　　6 . 14 1 mol/L氯化镁溶液：溶解 20 . 3 g 六水氯化镁于足量的水中，定容到 100 mL。 -20 ℃保存，冰袋运输。

　　6. 15 dNTP(四管套装，含 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP4 种溶液)：-20 ℃保存，冰袋运输。

　　6 . 16 Taq DNA 聚合酶： -20 ℃保存，冰袋运输。

　　6 . 17 10 mg/mL溴化乙锭染色液：称量 1 g 的溴化乙锭，加入到 100 mL容器中。 加入去离子水 100 mL,充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭。 将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

　　7 实验室检验

　　7 . 1 症状检查

　　首先进行木薯病症观察。 该病害可造成木薯生长点的损伤;叶片畸形、坏死、凋萎、黄化，并产生臭

　　GB/T 36808—2018

　　味;地上茎可发生树皮褪色、溃疡、顶枯、渗液、损伤处附有霉状物、茎内部变色，产生臭味等症状。 着重检查叶片，看是否能发现深绿色的水浸角斑或坏死的角斑。 在茎的绿色部位寻找小的损伤或溃疡，看能否在损伤和溃疡处发现深绿或深褐色的病斑，是否伴有黄色的渗出液。 如果在木薯生长的近花期阶段，可观察植株是否有坏疽或顶梢枯死症状。 木薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状参见附录 A中图 A. 1 和图 A. 2,木薯细菌性叶斑病菌与近似种木薯细菌性萎蔫病菌在症状上的主要区别参见表A. 1 。

　　7 . 2 病菌的分离纯化

　　7 . 2 . 1 病组织(病叶或茎段)中病菌的分离

　　取病健交界处，用 1%次氯酸钠溶液处理 1 min~3 min,再用无菌水清洗三次，最后把病组织置放在洁净的载玻片上捣碎，静置 10 min~20 min,用接种环蘸取汁液在 NA平板上划线，划 3 个平板以上， 28 ℃下培养 3 d~5 d后，检查并筛选培养基上的菌落。 在 NA 培养基上的菌落为黄色、光滑、奶酪状，质地黏稠。 NA培养基的配制方法见附录 B 中 B. 1 。

　　7 . 2 . 2 菌种纯化

　　采用平板划线法，即用灭菌的移种环蘸取 NA 平板上菌落后，在 YDCA 培养基上进行多次划线纯化，在 28 ℃下温度下培养 3 d~5 d,移出单个菌落后在 YDCA培养基上进一步扩大繁殖。 在 YDCA培养基上的菌落也为黄色、光滑、奶酪状，质地黏稠。 YDCA培养基的配制方法见 B. 2 。

　　7 . 3 生化指标测定

　　采用 BIOLOG GENⅢ细菌自动鉴定系统(Version 2 . 8 及以上版本)或应用细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行生化指标的检测。

　　7 . 4 致病性测定

　　将在 YDCA培养基上培养 48 h后的菌株，配成 10 8 CFU/ mL 的细菌悬浮液，采用针刺接种法，用消毒的接种针蘸上细菌悬浮液，针刺木薯植株的上部幼叶、嫩茎等，每一菌株接种 5 株，阴性对照用无菌

　　水代替接种液。 接种后的植株置放于人工气候箱，在 28 ℃ ~ 32 ℃温度下，先在 100%相对湿度保湿24 h~48 h,然后在 80%左右的相对湿度下，每天在 7000 lx~10 000 lx下光照培养 16 h, 黑暗下培养

　　8 h。 接种 7 d后开始观察症状，每天观察一次，接种后 30 d不表现症状的视为不发病。 如接种一周后观察到植株上的叶片出现黑绿色水渍角斑，直径 0 . 5 mm~1 mm,病斑扩散较慢的情况，则需进行继续观察。 若 2 周后出现角斑发展成为坏疽，周围围绕黄色晕环，病斑沿着叶脉扩散并引发整个叶片凋萎的症状视为感病。

　　7 . 5 PCR检测

　　从木薯组织(叶片或种茎)中抽提总核酸，进行 PCR 检测分析。 或取分离培养的细菌菌落，制成细菌悬浮液，进行 PCR检测，无需抽提总核酸。 检测方法步骤见附录 C。

　　8 结果判定

　　若经症状检验并分离的细菌菌株在培养基上的菌落特征与描述相符，生化鉴定结果与 xanthomonas cassa℃ae特征相符(参见表 A. 1),致病性测定表现典型症状，木薯病组织分离物 DNA 的 PCR检测结果

　　GB/T 36808—2018

　　与附录 C 的实验结果相符，符合上述所有条件则可以判定为检出木薯细菌性叶斑病菌;否则为未检出。

　　9 样品和菌种保存

　　9 . 1 样品保存

　　样品(植株或根茎)拍照后经登记和签字后置于- 80 ℃超低温冰箱中妥善保存 3 个月。 对鉴定为木薯细菌性叶斑病菌的样品至少应保存 6 个月，以备复检、谈判和仲裁，样品保存期满后，需经灭菌处理，使用高压灭菌器 121 ℃湿热灭菌 20 min 以上。

　　9 . 2 菌种保存

　　从样品中分离并鉴定为木薯细菌性叶斑病菌的菌株应该转接到 NA 或 YDCA 培养基试管斜面28 ℃培养 48 h,经登记和签字后置于 4 ℃冰箱中保存，每隔 20 d 转接一次;必要时用真空干燥机制成冻干粉，置于 -80 ℃下长期保存。

　　GB/T 36808—2018

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　木薯细菌性叶斑病菌的相关资料

　　A.1 地理分布

　　南美洲：哥伦比亚;

　　非洲：布隆迪、刚果民主共和国、肯尼亚、马拉维、卢旺达、坦桑尼亚、乌干达。

　　A.2 寄主植物

　　木薯(Manihotesculenta)。

　　A.3 症状

　　木薯细菌性叶斑病的主要症状有叶片角斑、褐变、萎蔫、流脓及根茎部分的溃疡、干枯、褐变、腐烂。叶片发病初期出现水渍状、暗绿色病斑，病斑常常沿叶脉扩展，合并成多角形的斑块，随着病害的发展，斑块的中心发生褐变、溢出黄色的菌脓或由黄晕围绕。 初期多是由于冰雹或风沙造成木薯嫩茎部形成伤 口，病菌由此进入并侵染，2 周后在侵染点出现暗绿色的病斑，一个月后病斑可达 1 cm~2 cm,嫩茎病部黑褐色，下陷，常溢出黄色的菌脓，随后枯萎、落叶。

　　A.4 生物学特性

　　病原细菌为革兰氏阴性，菌体短杆状，大小 0 . 5 μm~0 . 6 μm× 1 . 5 μm~1 . 8 μm, 多数以 10 个连接

　　成短链。 不产生芽孢。 鞭毛单根极生。 氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性反应。 可水解七叶苷，从蛋白陈产生硫化氢。 淀粉水解能力强。 不产生尿酶。 可产生黄色素。

　　A.5 传播和侵染

　　在雨季刚开始的一段有利气候条件下，木薯细菌性叶斑病菌可由木薯上的附生植物进行长距离传播 。在田间，该病原菌可由风和雨传播。 病菌通过植物的气孔和表皮伤口进入植物。 这些伤口一般由雨季的第一场雨时强风吹起的沙粒和小碎石造成。 病菌在叶组织的细胞间增殖导致了水浸状角斑的形成 。角斑扩展较慢，1 周后直径达到 0 . 5 mm~1 mm。 一般 2 周后角斑成为坏疽，由黄晕围绕。 有时可以观察到病斑沿着叶脉扩散。 病菌对嫩叶基部的叶脉的侵染可造成整个叶片的凋萎。 在茎上，围绕着侵染点首先出现深绿色的病斑，当病斑扩展，绕茎一周时逐渐引起顶枯。 在细胞溶解酶的作用下树皮层破裂并渗出黄色的菌脓。 被侵染的茎通常呈黑褐色，疤痕状并伴有溃疡。 木薯细菌性叶斑病菌主要易在砂土或黏质砂土中发生，病菌发展的最适温度为 25 ℃ 。

　　GB/T 36808—2018

　　A.6 木薯细菌性叶斑病菌与木薯细菌性萎蔫病菌的主要区别

　　表 A.1 木薯细菌性叶斑病菌与木薯细菌性萎蔫病菌的主要区别

　　A.7 木薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状

　　木薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状见图 A. 1 和图 A. 2 。

　　图 A.1 木薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状(枯萎)

　　GB/T 36808—2018

　　图 A.2 木薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状(角斑)

　　GB/T 36808—2018

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　木薯细菌性叶斑病菌常用的培养基配方

　　B.1 NA培养基

　　牛肉浸膏 3.0 g,蛋白陈 10.0 g,NaCl 5.0 g,琼脂 15.0 g~20.0 g,蒸馏水 1 000.0 mL,调整 pH 至 6.8~

　　7.0 , 121 ℃湿热灭菌 20 min。

　　B.2 YDCA培养基(YeastDextroseChalkAgar培养基)

　　酵母膏 10.0 g, 葡萄糖 20.0 g,碳酸钙 20.0 g, 琼脂 15.0 g~20.0 g,蒸馏水 1 000.0 mL, 121 ℃湿热灭菌 20 min。

　　GB/T 36808—2018

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　木薯细菌性叶斑病菌与木薯细菌性萎蔫病菌的 PCR区别方法

　　C.1 试剂制备(或使用商品化的试剂盒)

　　C.1 . 1 总核酸抽提缓冲液

　　100 mmol/L三烃甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)pH 8. 0、10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、 2% 十二烷基硫酸钠(SDS) 、100 μg/mL 蛋白酶 K溶液、1%聚乙烯吡咯烷酮。

　　C.1 .2 TE 缓冲液(PH 8.0)

　　1 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0

　　0 . 1 mmol/ L EDTA

　　C.1 .3 50 ×TAE 电泳缓冲液(PH 8.0)

　　Tris

　　冰醋酸

　　0.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)

　　C.1 .4 6×上样缓冲液(含溴酚蓝指示剂) C.1 .5 其他试剂

　　三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)、异丙醇、DL2000 DNA Marker、溴化乙锭染色液。

　　C.1 .6 PCR反应试剂

　　10 × PCR 缓冲液、氯化镁 、dNTP、Taq DNA 聚合酶、琼脂糖。

　　C.2 总核酸提取

　　按 GB/T 28096—2011 中 B. 2 进行样品中总核酸的提取。 将木薯叶片 1 g 或木薯种茎 1 g 放入灭菌研钵中，加入液氮用研杵研成粉状，取粉末移入 1 . 5 mL 离心管中，加入 1 000 μL 抽提缓冲液，在65 ℃水浴孵育 30 min;室温 14 000 g 离心 15 min;取上清液加入等体积的三氯甲烷和异戊醇(24 ∶ 1)混合溶液，混匀，放置 15 min, 14 000 g 离心 15 min;取上清液加入等体积的三氯甲烷和异戊醇(24 ∶ 1)溶液混匀，放置 15 min, 14 000 g 离心 15 min;取上清液加入 0 . 6 倍的异丙醇混匀，14 000 g 离心30 min;弃上清液，用 70%乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤两次，并倒置离心管 1 min;加入 100 μL TE 缓冲液悬浮总核酸，置于 -20 ℃下保存备用。

　　C.3 16SrRNA基因序列扩增

　　C.3. 1 引物序列

　　16sF: 5′-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3′

　　GB/T 36808—2018

　　16sF: 5 -ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3′ C.3.2 PCR反应体系(浓度均为终浓度)

　　C.3.3 空白对照的设置

　　以双蒸水(ddH 2 O)作为空白对照。

　　C.3.4 PCR的反应参数

　　94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35 个循环;72 ℃延伸 10 min。不同仪器可根据仪

　　器要求将反应参数作适当调整。

　　C.3.5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5%的琼脂糖凝胶。 每个样品取 5 μL 的 PCR产物与 1 μL 的 6×上样缓冲液混匀，并加到置于 1×TAE缓冲液的 1 . 5%琼脂糖凝胶孔中，用 DNA Marker 作为分子量标记，然后在 120 V下电泳并进行分析。 电泳结束后在凝胶成像仪下进行分析并拍照记录实验结果。

　　C.3.6 测序

　　采用通用引物为 M13-47 及 RV-M(或 M13-48) 测序，测序结果在 Genbank 中进行 BLAST 比对，

　　比较 PCR产物与黄单胞属的同源性。 如果 PCR扩增产物与黄单胞属 16S基因相似性达到 99%以上，则判断结果为黄单胞属细菌，否则判定结果为阴性。 如果判断结果为黄单胞属细菌，则进行 avrBs2 基因序列扩增实验。

　　C.4 avrBS2 基因序列扩增

　　C.4. 1 引物序列

　　AvrBs2-Fm: 5 -GGACTAGTCCTGCCGGTGTTGATGCACGA-3

　　AvrBs2-Rm: 5′-CCGCTCGAGCGGTGATCGGTCAACAGGCTTTC-3′

　　C.4.2 PCR反应体系(浓度均为终浓度)

　　GB/T 36808—2018

　　Taq DNA 聚合酶 2.0 U

　　DNA模板 200 ng

　　补 ddH2 O 至 25 μL。

　　C.4.3 阳性对照、阴性对照和空白对照的设置

　　采用木薯细菌性叶斑病菌标准菌株作为阳性对照，采用木薯细菌性萎蔫病菌标准菌株作为阴性对照，以 ddH 2 O 作为空白对照。

　　C.4.4 PCR的反应参数

　　94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35 个循环;72 ℃延伸 8 min。不同仪器可根据仪器

　　要求将反应参数作适当调整。

　　C.4.5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5%的琼脂糖凝胶。 每个样品取 5 μL 的 PCR产物与 1 μL 的 6×上样缓冲液混匀，并加到置于 1×TAE缓冲液的 1 . 5%琼脂糖凝胶孔中，用 DNA Marker作为分子量标记，然后在 120 V下电泳并进行分析。 电泳结束后在凝胶成像仪下进行分析并拍照记录实验结果。

　　C.4.6 结果判断

　　木薯细菌性叶斑病菌与阳性对照均有 780 bp 大小的产物带出现，木薯细菌性萎蔫病菌无产物带出现。

　　GB/T 36808—2018

　　参 考 文 献

　　[1] 任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定.北京：农业出版社，1994 .

　　[2] Bradbury JF.Guide to Plant Pathogenic Bacteria.Wallingford, UK : CAB International, 1986.

　　[3] Mooter M van den, Maraite H , Meiresonne L, et al. Comparison between xanthomonas campestris pv.manihotis (ISPP list 1980)and x.campestris pv.cassa℃ae (ISPP list 1980)by means of phenotypic, protein electrophoretic, DNA hybridization and phytopathological techniques. Journal of General Microbiology,1987,133(1) : 57-71.

　　[4] Santos RMDB dos, Dianese JC. Comparative membrane characterization of xanthomonas campestris pv.cassa℃ae and x.campestris pv. manihotis.Phytopathology,1985,75(5) : 581-587.

　　[5] Vauterin L , Hoste B , Kersters K , et al. Reclassification of xanthomonas.International Journal of Systematic Bacteriology,1995,45(3) : 472-489.

　　[6] Verdier V, Boher B, Maraite H , et al. Pathological and molecular characterization of xan- thomonascampestris strains causing diseases of cassava ( Manihot esculenta) . Applied and Environ- mental Microbiology,1994,60(12) : 4478-4486.

　　[7] Young JM, Saddler GS, Takikawa Y, et al.Names of plant pathogenic bacteria 1864-1995.Re- view of Plant Pathology,1996,75(9) : 721-763.