GB/T 34776-2017 T4 DNA连接酶 酶活及杂质检测方法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34776—2017

　　T4 DNA连接酶 酶活及杂质检测方法

　　T4 DNA ligase—Detectionmethodsofactivityandimpuritiesofenzyme

　　2017-1 1-01 发布 2018-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34776—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：中国测试技术研究院、深圳华因康基因科技有限公司、福建华灿制药有限公司。

　　本标准主要起草人：周李华、李怀平、盛司潼、孙登峰、谭辉彪、黄发灿、金虹、马丽侠、叶德萍、李花、王智、沈兴中、谭和平。

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　　T4 DNA连接酶 酶活及杂质检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了 T4 DNA连接酶的活力、杂质的检测方法。

　　本标准适用于作为分子生物学研究用的 T4 DNA连接酶。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　YY/T 0087 电泳装置

　　YY/T 0657 医用离心机

　　JJG 646 移液器检定规程

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　DNA连接酶 DNA ligase

　　一种封闭 DNA链上的缺口酶，借助 ATP 或 NAD水解提供的能量催化相邻的核苷酸分子间 3′-羟基和 5′-磷酸基形成磷酸二酯键。

　　注：DNA连接酶催化底物可以是 DNA或 RNA。 依据酶的类型不同，反应中产生高能中间产物的辅助因子可以是ATP 或 NAD+ 。

　　3.2

　　T4 DNA连接酶 T4 DNA ligase

　　一种 T4 噬菌体基因 30 的编码产物，以 ATP作为辅助因子，催化双链 DNA 或 RNA 的 5′-磷酸末端和 3′-羟基末端形成磷酸二酯键。

　　注：带有 His-Tag,分子质量约为 70 ku,来源于转化有 T4 DNA 连接酶表达载体的 E.coli菌株。 主要作用是催化DNA末端之间的连接，修复双链核酸中的单链切刻。

　　3.3

　　酶活力单位 unitactivity

　　在 20 μL 1 × T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16 ℃ 反应条件下，30 min能使 50% 的经 Hind Ⅲ消化的 λDNA 片段 [5′端浓度为 0 . 12 μmol/L(300 μg/mL)] 连接所需的酶量即为 1 活力单位。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。

　　SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

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　　electrophresis)。

　　Tris 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl) metyl aminomethane)。

　　5 试剂与溶液

　　除非另有规定，本方法所用的试剂应为不含 DNA 和 DNase 的分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用 0 . 22 μm 过滤器过滤除菌;酶缓冲液应避免反复冻融;水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5. 1 氯化钠(NaCl)。

　　5.2 琼脂粉(Agar)。

　　5.3 氢氧化钠(NaOH)。

　　5.4 乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA, C10 H14 N2 O8 Na2)。

　　5.5 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) , 1 mmol/L EDTA, 使用 HCl 或 NaOH 调节 pH。

　　5.6 酶贮存溶液：50 mmol/L KCl , 10 mmol/L Tris-Cl(pH 7. 4) , 0. 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 200 μg/mL BSA 和 50%的甘油。

　　5.7 10 × T4 DNA Ligase Buffer: 400 mmol/L Tris-Cl, 100 mmol/L MgCl2 , 100 mmol/L DTT, 5 mmol/L ATP(pH 7.8)。

　　5.8 50×TAE缓冲液：称取 484 g Tris, 量取 114.2 mL冰乙酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0),溶于水中，定容至 2 L。

　　5.9 10×上样缓冲液：含 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF,30%甘油水溶液。

　　6 主要仪器和设备

　　6 . 1 电泳系统：应符合 YY/T 0087 的要求。

　　6 . 2 凝胶成像系统。

　　6.3 加热制冷水浴/循环器：-20 ℃ ~100 ℃。

　　6 . 4 冷冻离心机：可以在 4 ℃下进行离心，离心转速 10 000 r/ min 以上，应符合 YY/T 0657 的要求。

　　6.5 微量可调移液器：0.5 μL~10 μL, 10 μL~100 μL, 100 μL~1 000 μL,应符合 JJG 646 的要求。

　　7 试验方法

　　7 . 1 酶活力测定

　　7. 1 . 1 λ DNA-Hind Ⅲ 底物制备

　　λ DNA-Hind Ⅲ按照以下步骤进行制备：

　　a) 按表 1 配制酶切反应体系。 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂离心。

　　表 1 酶切反应体系

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　　表 1(续)

　　b ) 37 ℃ 反应 4 h。 反应结束后向样品管中加入等体积的酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1),轻轻摇匀;12 000 r/ min 离心 8 min。 小心地将上清转移到新 EP 管中，不应吸到下面有机相里的液体。

　　c ) 加入等体积的氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1),轻轻摇匀;12 000 r/min离心 8 min。 小心地将上清转移到新 EP 管中。

　　d) 加入 1/10 体积的 3 mol/ L 醋酸钠颠倒混匀，再加 2 倍以上体积的无水乙醇，颠倒充分混匀后窒温放置沉淀。

　　e) 用适量 75%~80%乙醇清洗白色沉淀 2 次 。

　　f) 放于超净台轻风将残余乙醇吹干，也可以窒温蒸发。

　　g) 用适量的 TE 缓冲液溶解 DNA。

　　h) 紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测 DNA 浓度和纯度(电泳检测结果条带清晰明亮，无杂带，范围分布在 23 130 bp~125 bp 之间。 紫外可见分光光度计测定产物的 A260/A280 在 1 . 8~1 . 9之间，A260/A230>2) 。

　　7 . 1 . 2 T4 DNA连接酶活力检测

　　按表 2 顺序配制 20 μL连接反应体系，每个梯度设置 3 个平行。

　　表 2 酶活力测定反应体系

　　构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组。

　　加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂快速离心，在最适温度下(一般为 16 ℃),反应 30 min,进行电泳( 电泳条件参见附录 A),观察连接情况;根据参照酶加入的最小体积乘以稀释倍数计算待测酶活力。 具体计算方式可参见附录 A。

　　7 . 2 杂质检测

　　7 . 2 . 1 核酸内切酶检测

　　按表 3 顺序配制连接反应体系。

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　　表 3 核酸内切酶检测连接反应体系

　　加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂快速离心，在最适温度下(一般为 37 ℃)连接 4 h,连接产物进行电泳，根据电泳图谱，判断酶中是否夹杂有核酸内切酶，如条带清晰、明显、不发生变化，说明无核酸内切酶污染。

　　7 . 2 . 2 核酸外切酶检测

　　7 . 2 . 2 . 1 单链外切脱氧核糖核酸酶检测

　　按表 4 顺序配制连接反应体系。

　　表 4 外切酶检测连接反应体系

　　加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂快速离心，在最适温度下(一般为 30 ℃)连接过夜，反应产物经 15% SDS-PAGE 电泳检测并成像分析实验结果。 无 DNA 降解说明无单链外切脱氧核糖核酸酶的污染。

　　7 . 2 . 2 . 2 双链外切脱氧核糖核酸酶污染检测

　　按表 5 顺序配制连接反应体系。

　　表 5 外切酶检测连接反应体系

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　　加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂快速离心，在最适温度下(一般为 37 ℃)孵育 4 h,反应产物经 15% SDS-PAGE 电泳检测并成像分析实验结果。 无 DNA 降解说明无双链外切脱氧核糖核酸酶的污染。

　　7 . 2 . 3 核酸酶检测

　　按表 6 顺序配制连接反应体系。

　　表 6 核酸酶检测连接反应体系

　　轻轻混匀，短暂快速离心;最适温度下(一般为 37 ℃)连接 24 h 或 18 h,连接产物进行电泳，带型不发生变化。 如果带型清晰、明显、无变化说明无其他可检测到的核酸酶污染。

　　7 . 2 . 4 连接效率检测

　　按表 7 顺序配制连接反应体系。

　　表 7 连接效率检测连接反应体系

　　轻轻混匀，短暂快速离心;最适温度下(一般为 16 ℃ ~22 ℃)连接 1 h,连接产物进行电泳，≥98%的 λDNA- Hind Ⅲ片段被连接或 ≥95% λDNA- Hae Ⅲ片段被连接，如果带型清晰说明连接效率高。

　　7 . 2 . 5 连接-再切检测

　　按表 8、表 9 顺序配制连接反应体系和酶切反应体系。

　　加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂离心在最适温度下(一般为 16 ℃ ~22 ℃),反应 1 h,进行电泳，然后回收连接后的 DNA,溶于内切酶缓冲液中;按表 9 顺序配制酶切反应体系。

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　　表 8 连接反应体系

　　表 9 酶切反应体系

　　轻轻混匀，短暂离心，最适温度下(一般为 37 ℃)酶切 4 h,酶切产物进行电泳，如果能被内切酶再次切割，表示识别序列恢复完全，3′和 5′末端保持完整。 通过以上结果，可以判断是否存在连接酶抑制剂或磷酸酶以及核酸外切酶等杂质。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　T4 DNA连接酶酶活力计算

　　A.1 酶连接产物凝胶电泳检测

　　取 0 . 8 g琼脂糖，于 100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭(10 mg/mL)至终浓度为0 . 5 μg/mL,制胶。 在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。 将 5 μL ~8 μL 酶连接产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。 9 V/ cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。 紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

　　A.2 酶活力计算

　　图 A.1 待测酶活力检测电泳图谱

　　从图 A. 1 可以看出，稀释 1 200 倍的待测酶与稀释 400 倍的参考酶同一酶量的连接反应产物相同，

　　即酶活力相当。 因参照酶活力为 5 weiss/μL,计算稀释倍数后，得出待测酶的酶活力为 15 weiss/μL, 即3 000 CEU/μL。