GB/T 34777-2017 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测 荧光定量PCR法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34777—2017

　　中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达产品残留 DNA检测 荧光定量 PCR法

　　DetectionofresidualDNA inbiologicalproductwhichexpressedfrom

　　Chinesehamsterovary(CHO)cell—

　　Fluorescentquantitativepolymerasechainreactionassay

　　2017-1 1-01 发布 2018-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34777—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：信达生物制药(苏州)有限公司、中国测试技术研究院生物研究所。

　　本标准主要起草人：孙左宇、周李华、李雪峰、黄晓刚、袁志军、郭燕红。

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　　中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达产品

　　残留 DNA检测 荧光定量 PCR法

　　1 范围

　　本标准规定了检测残留宿主 DNA 的荧光定量 PCR 法 。

　　本标准适用于 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)宿主细胞系表达的生物制品的残留宿主 DNA 的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　Ct值 cyclethreshold

　　每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CHO：中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)

　　5 原理

　　以真核细胞基因组中具有高拷贝数的 16SrRNA 为 目 的基因，设计特异性扩增该基因的 PCR 引

　　物，包括正向引物：Forward Primer ( 5′-CCAGGCATTGGTGGCAC-3′) 和 反 向 引 物：Reverse Primer

　　( 5′-AGACAGGGTTTCTCTGT-3′) 。

　　采用 SYBR荧光定量 PCR(FQ-PCR)法，采集荧光绘制出的 PCR扩增曲线 Ct值，与扩增体系中起始目的基因模板的对数值呈反比，以起始模板 DNA 对数值为纵坐标，Ct 值为横坐标，制作标准曲线。根据标准曲线方程计算样品的 DNA残留量，从而达到定量检测样品残留 DNA 的含量目的。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 荧光定量 PCR仪：含有 SYBR荧光染料检测通道。

　　6 . 2 紫外-可见分光光度计：波长范围：200 nm~760 nm。

　　6.3 微型离心机：转速范围：2 000 r/min~23 000 r/min。

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　　6 . 4 电热恒温水浴锅：室温至 100 ℃;温度波动范围：±0 . 5 ℃;温度显示精度：0 . 1 ℃ 。

　　6 . 5 生物安全柜/超净工作台。

　　7 试剂或材料

　　除非另有说明，本方法中仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 试剂盒的组成与相关试剂的配制方式参见相应的厂家说明书。

　　7 . 1 基因组提取试剂盒。

　　7 . 2 基因组纯化试剂盒。

　　7 . 3 DNA提取试剂盒。

　　7.4 引物：PCR正向引物：Forward Primer(5′-CCAGGCATTGGTGGCAC-3′合成 PAGE 级); PCR反向引物：Reverse Primer(5′-AGACAGGGTTTCTCTGT-3′合成 PAGE 级)。

　　7 . 5 限制性内切酶：EcoR Ⅰ 。

　　7 . 6 DNA标准品。

　　7 . 7 染料法荧光定量试剂盒。

　　7.8 蛋白酶 K(Proteinase K)。

　　7 . 9 异丙醇(AR) 。

　　7 . 10 无水乙醇(AR) 。

　　8 试验步骤

　　8 . 1 DNA提取

　　8 . 1 . 1 待测样品残留 DNA 的提取制备

　　用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为 1 mg/mL~ 20 mg/mL, 取 100 μL 稀释后的样品，参照DNA提取试剂盒的说明书，进行残留 DNA 的提取。

　　8 . 1 . 2 阳性对照样品 DNA 的提取制备

　　用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为 1 mg/mL~20 mg/mL,取 100 μL稀释后的样品，加入 20 μL 100 pg/mL 的 DNA标准品，参照 DNA提取试剂盒的说明书，进行残留 DNA 的提取。

　　8 . 1 . 3 阴性对照样品 DNA 的提取制备

　　用待测样品所对应的制剂缓冲液作为样品，参照 8 . 1 . 1 的方法进行相同倍数的稀释后，取 100 μL稀释后的样品，参照 DNA提取试剂盒的说明书，进行残留 DNA 的提取。

　　8 . 2 PCR扩增检测

　　8 . 2 . 1 DNA标准品工作液的制备

　　取 DNA标准品，分别稀释至 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL 和0 . 1 pg/mL等系列浓度，用于标准曲线的制备。

　　8 . 2 . 2 Real-timePCR条件及体系

　　按表 1 进行反应体系的配制，各样品制备 3 个复孔，加样过程先将除 DNA模板(即供测试的样品)以外的各组分预混合，16 μL/孔，最后加入标准品/待测样品/阴性对照/阳性对照 DNA 9 μL/孔，加好

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　　后盖紧盖子，将 PCR 96 孔板或 8 联管于台式离心机中瞬时离心，使混合液集中于底部。 放入 PCR 仪的抽屉。

　　表 1 PCR扩增体系

　　8 . 2 . 3 扩增条件

　　将制备好的 PCR反应体系放入 PCR仪的抽屉，按表 2 的反应条件进行 PCR扩增。

　　表 2 PCR扩增条件

　　8 . 2 . 4 系统适应性要求

　　8 . 2 . 4 . 1 有效扩增孔的取舍：根据如下检测数值的取舍标准选择有效孔：

　　a) 标准曲线上各数据点复孔，可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去，可舍去明显影响标准曲线相关性(使 R2 ≥0 . 99) 的复孔数据。 整条曲线上舍去的复孔数不得超过 3 个 ;

　　b ) 阳性对照、待测样品各复孔间检测的 Ct值的 SD值大于 0 . 5 时，且由此计算的 DNA残留值在定量限以上，则该数据应重新检测。

　　8 . 2 . 4 . 2 系统适用性要求：

　　a) 扩增效率应在 90%~110% ;

　　b ) 标准曲线的相关系数 R2 ≥0 . 99 ;

　　c) 阳性对照样品中 DNA标准品的加样回收率应在 50%~150% ;

　　d) 阴性对照孔无非特异性扩增(DNA含量应小于或等于 1 pg/mL) 。

　　8 . 3 结果计算

　　8 . 3 . 1 一般原则

　　阳性对照中 DNA标准品的加样回收率为实际检测到在阳性对照中添加的 DNA标准品的量，除以在阳性对照中添加的 DNA标准品的理论值。 阳性对照中检测到的 DNA 总量减去待测样品中检测得到的 DNA量即为实际检测到添加的 DNA标准品的量。 由于各样品中提取的 DNA 体积固定，在计算过程中直接用浓度表示。

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　　8 . 3 . 2 阳性对照样品中的 DNA标准品加样回收率

　　阳性对照样品中的 DNA标准品加样回收率按式(1)计算：

　　犚 ……………………………( 1 )

　　式中：

　　犚 —DNA标准品加样回收率，% ;

　　ρ1 — 阳性对照品中的 DNA浓度测定值，单位为皮克每毫升(pg/mL) ;

　　ρ2 —待测样品中 DNA浓度测定值，单位为皮克每毫升(pg/mL) ;

　　ρ3 —加入的对照品 DNA 的终浓度，为 20 pg/mL。

　　8 . 3 . 3 待测样品残留 DNA含量

　　待测样品残留 DNA含量按式(2)计算：

　　狓= ρ4犳 ……………………………( 2 )

　　式中：

　　狓 —待测样品残留 DNA含量，单位为皮克每毫克(pg/mg) ;

　　ρ4 —待测样品中 DNA浓度，单位为皮克每毫升(pg/mL) ;

　　犳 —稀释倍数;

　　ρ5 —待测样品蛋白浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) 。