GB/T 34736-2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34736—2017

　　绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术

　　Detectionofjaagsiektesheepretroviruswithdotblottinghybridization

　　2017-1 1-01 发布 2018-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34736—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本标准主要起草单位：内蒙古农业大学、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、北京农业职业学院。

　　本标准起草人：刘淑英、齐景伟、王海艳、王振玲、马学恩、梁化春、赵泽赞、孙晓林。

　　GB/T 34736—20 17

　　引 言

　　绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis, OPA) 是由绵羊肺腺瘤病毒 (Jaagsiekte sheep ret- rovirus, JSRV)引起的一种慢性、进行性、接触传染性的肺脏肿瘤性疾病。 主要特征是患羊咳嗽、呼吸

　　困难、大量浆液性鼻液、消瘦、Ⅱ型肺泡上皮细胞和无纤毛细支气管上皮细胞肿瘤性增生[1] 。剖检可见病羊肺脏发生实变，回缩不良，体积变大，比正常肺脏大 2~3 倍 。肺表面有坚实的圆形粟粒大小的灰白色结节即腺瘤灶，小结节发生融合，形成形状不一并且不规则的大结节。 气道内充满泡沫状液体，抬起两条后腿可从鼻孔流出泡沫状液体即具有证病意义的小推车试验[2] 。

　　绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)是引起绵羊肺腺瘤病的病原。 在所有已研究过的正常绵羊基因组内都含

　　有约 20 拷贝的与 JSRV密切相关的内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus, ERVs)序列，因其基因结构与绵羊肺腺瘤病毒的极为相似，也称为内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV), 为了区别称绵羊肺腺瘤病毒为 exJSRV[3] 。研究表明，enJSRV 和 exJSRV 的基因结构在 gag 基因、长末端重复序列(LTR) 、 env基因处区别较大，特别是 env基因编码跨膜蛋白区域(TM)和长末端重复序列的 U3 区是 2 个高可变区。 所以在检测病原 exJSRV 时，在这 2 个高可变区处设计特异性引物和制备特异性探针来排除 enJSRV[4][5] 。

　　到目前为止，全世界都没有建立统一特异性诊断该病的方法[1] 。其原因有三个方面：一是该病的潜伏期较长，病程较长，对处于潜伏期或临床症状不明显的病羊很难发现。 二是病羊体内检测不到循环抗体，很难用常规的免疫学方法进行诊断，三是引起该病的病原绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)仍未建立体外培养体系，所以常规的病毒分离鉴定方法也无法利用。 目前对该病的诊断还主要依靠临床症状和病理组织学检查。 所以建立特异性诊断该病的技术标准将在国家出入境检验检疫、国内种羊安全评价、羊场检疫清群等方面具有非常重要的意义。

　　GB/T 34736—20 17

　　绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术

　　1 范围

　　本标准规定绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测的试剂、材料和设备、抽样、操作方法、结果判定等。

　　本标准适用于检测临床疑似病羊和进出口种羊肺组织或外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒核酸，也适用于羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义、缩略语

　　3 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 . 1 . 1

　　斑点杂交 dotblottinghybridization

　　利用核酸探针，在杂交膜上与待测样本核酸 DNA 杂交，核酸探针带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子结合形成杂交体，再用呈色反应显示。 斑点杂交是直接将待检羊只的组织或血液样品 DNA变性后，点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前病毒 DNA 的分子杂交技术。

　　3 . 2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　AMV：鸟类 RNA病毒反转录酶(Avian Myeloblastosis Virus)

　　BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate)

　　cDNA：互补 DNA (Complementary DNA)

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　dNTPs : 4 种脱氧核糖核苷三磷酸混合物(Deoxyribonucleoside Triphosphates)

　　EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid)

　　enJSRV：内源性绵羊肺腺瘤病毒(Endogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus )

　　ERV：内源性逆转录病毒(Endogenous Retrovirus)

　　JSRV：绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Sheep Retrovirus)

　　NBT：四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium)

　　OPA：绵羊肺腺瘤病(Ovine Pulmonary Adenomatosis)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　GB/T 34736—20 17

　　RNA：核糖核酸(Ribonucleic Acid)

　　RT：反转录(Reverse Transcriptase)

　　SDS：十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate)

　　SSC：柠檬酸钠盐(Saline Sodium Citrate)

　　Tris：三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)

　　4 材料与试剂

　　除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。 提取病毒 RNA所用试剂应使用无 RNA酶的容器进行分装。

　　4 . 1 水

　　GB/T 6682,三级水。

　　4 . 2 商品化的 DNA提取试剂盒

　　用于组织和血液样品 DNA 的提取，4 ℃ ~8 ℃保存。

　　4 . 3 商品化的 RNA提取试剂盒

　　用于组织和细胞总 RNA 的提取，4 ℃ ~8 ℃保存。

　　4 . 4 斑点杂交所需溶液

　　4.4. 1 1 mol/L 马来酸：配制见 A.1。

　　4 . 4 . 2 洗涤缓冲液(马来酸缓冲液)：配制见 A. 2 。

　　4 . 4 . 3 检测缓冲液：配制见 A. 3 。

　　4.4.4 1 mol/L Tris-盐酸溶液：配制见 A.4。

　　4.4.5 10% SDS溶液：配制见 A.5。

　　4 . 4 . 6 20 倍稀释 SSC缓冲溶液：配制见 A. 6 。

　　4 . 4 . 7 封闭溶液：配制见 A. 7 。

　　4 . 4 . 8 抗体溶液：配制见 A. 8 。

　　4 . 4 . 9 预杂交溶液：配制见 A. 9 。

　　4 . 4 . 10 杂交溶液：配制见 A. 10 。

　　4 . 4 . 1 1 NBT/BCIP显色液：配制见 A. 11 。

　　4.4. 12 0.2 mol/L EDTA：配制见 A.12。

　　4 . 5 地高辛探针标记和检测试剂盒

　　用于特异性探针的标记和灵敏度检测，保存于 -20 ℃ 。

　　4 . 6 制备探针所需模板 RNA

　　制备探针所需模板 RNA 见 B. 1 。

　　4 . 7 制备探针所需特异性引物和探针序列

　　制备探针所需特异性引物和探针序列参见附录 C 和附录 D。

　　GB/T 34736—20 17

　　4 . 8 AMV逆转录酶及 5 倍逆转录酶反应缓冲液

　　AMV逆转录酶及 5 倍逆转录酶反应缓冲液，保存于 -20 ℃ ,避免反复冻融。

　　4.9 Taq酶及 10 倍 Taq酶反应缓冲液

　　Taq酶及 10 倍 Taq酶反应缓冲液，保存于 -20 ℃ ,避免反复冻融。

　　5 材料与设备

　　5 . 1 高压灭菌器。

　　5.2 微量加样器：量程分别 0.2 μL~2 μL、1 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL 和 100 μL~ 1 000 μL 的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。

　　5 . 3 高速冷冻离心机：可控温至 4 ℃、离心速度可达 12 000 r/ min 以上。

　　5 . 4 恒温水浴锅。

　　5 . 5 硝酸纤维素膜或尼龙膜。

　　5.6 2 ℃ ~-20 ℃冰箱。

　　5 . 7 PCR扩增仪。

　　5 . 8 核酸电泳仪和水平电泳槽。

　　5 . 9 凝胶成像系统。

　　5 . 10 高温鼓风干燥箱(可调温度至 120 ℃ ) 。

　　5 . 1 1 恒温摇床。

　　6 样品采集

　　6 . 1 组织样品

　　用无菌剪刀和镊子剪取肺脏组织，如果肺叶上有明显的灰白色结节的典型病变时，采集病变与正常交界处的组织。 将待检样品装入冻存管，编号，迅速放入液氮罐中备用。

　　6 . 2 血液样品

　　颈静脉采血，用淋巴细胞分离液收集白细胞。 编号，迅速放入液氮罐中备用。

　　6 . 3 样品存放

　　样本采集后迅速放入液氮罐中，若需长期保存应放在 -80 ℃冰箱，应避免反复冻融。

　　7 操作方法

　　7 . 1 样品 DNA 的制备

　　取约黄豆粒大小的组织样品或血液白细胞分离液(1 mL,细胞密度 2×105 个/mL~10× 105 个/mL) ,采用常规 DNA提取试剂盒，按说明书的方法进行操作，提取得到的 DNA 样品用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，保证样品 DNA 的完整和估测 DNA浓度达 500 ng/μL,并于 4 ℃保存备用。

　　7 . 2 特异性探针的制备与检测

　　探针标记的具体步骤和灵敏度检测方法的详细说明见附录 B。

　　GB/T 34736—20 17

　　7 . 3 斑点杂交检测

　　7 . 3 . 1 杂交膜的处理

　　剪取适合大小的尼龙膜(斜剪口，由小到大)，放在 15 mL 双蒸水中漂洗 10 min,让尼龙膜完全湿润，取出后再浸泡在 20 mL 20 倍 SSC溶液中 10 min,然后放在 3 层灭菌滤纸上，于室温干燥 3 min。

　　7 . 3 . 2 变性

　　将待测 DNA 10 μL(100 ng/μL)样品煮沸 14 min,快速放入冰水浴中，骤冷 10 min。

　　7 . 3 . 3 点样

　　将 7 . 1 中制备的 DNA样品取 1 μL点在杂交膜上于 120 ℃烘箱中烘 30 min。

　　7 . 3 . 4 预杂交

　　将杂交膜封入杂交袋中。 加入预杂交溶液，每组 500 μL 全部加完，使膜漂起即可，除去气泡，置37 ℃ ~42 ℃ 的恒温摇床上，轻轻振摇 1 h。

　　7 . 3 . 5 杂交

　　剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入含 3 μL 的 en狏探针或 U3 探针(20 pmol/μL) 的杂交液500 μL, 除去气泡，封 口。40 ℃过夜，大约 12 h~16 h。

　　7 . 3 . 6 洗膜

　　将杂交膜放入小烧杯(或抗体孵育盒)中，加 20 mL 洗涤溶液，在摇床中(40 ℃ 、70 r/min) 洗膜2 次，每次 30 min。

　　7 . 3 . 7 封闭

　　取出杂交膜，在 20 mL预热(40 ℃ ) 10 min 的马来酸冲洗缓冲液的平皿中浸泡 3 min平衡后，转入20 mL 10%封闭溶液中，室温作用 60 min。

　　7 . 3 . 8 酶联抗体结合

　　将杂交膜取出，放 入 一 个 新 的 平 皿 中，加 入 20 mL 含 抗 地 高 辛 抗 体 的 封 闭 溶 液 中，室 温 作 用30 min 。

　　7 . 3 . 9 洗膜

　　将杂交膜取出，放入含有 20 mL 马来酸冲洗缓冲液的平皿中，在摇床中(40 ℃ 、70 r/min) 洗膜2 次，每次 15 min;将膜取出，放入含有 20 mL检测缓冲液的平皿中平衡 5 min。

　　7 . 3 . 10 显色

　　将杂交膜放入 20 mL新制备的显色液中静置避光(铝纸包裹)显色 6 h~ 12 h。 用无 RNA 酶水终止反应 5 min。 杂交膜自然干燥后观察照相，避光保存。

　　GB/T 34736—20 17

　　8 结果判定

　　8 . 1 结果分析条件设定

　　采用已构建好的绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的阳性质粒为阳性对照，设无探针杂交序列的内源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因质粒为阴性对照。

　　阳性对照出现斑点和阴性对照同时不出现斑点为检测结果判定成立的前提条件，否则结果不成立。

　　8 . 2 阴性

　　膜上样品的点样处同时不出现斑点视为阴性。

　　8 . 3 阳性

　　点样膜上两个 en狏探针和 U3 探针(参见附录 C) 同时出现清晰的斑点为阳性结果。 其中一个探针点样处出现斑点为疑似病例，需再次判定。

　　GB/T 34736—20 17

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　杂交所需溶液配制

　　A.1 1 mol/L马来酸

　　116.08 g 马来酸溶于 800 mL无 RNA酶水中，定容至 1 000 mL,高压灭菌备用。

　　A.2 洗涤缓冲液(马来酸缓冲液)

　　1 mol/L 马来酸 50 mL, 5 mol/L氯化钠溶液 15 mL,添加无 RNA 酶水至 400 mL,用氢氧化钠调pH 至 7 . 5,再加 1 . 5 mL 吐温-20,最后再加无 RNA酶水定容到 500 mL,高压灭菌，室温保存。

　　A.3 检测缓冲液

　　1 mol/L Tris-盐酸(pH 9.5) 10 mL, 5 mol/L氯化钠 2 mL, 加 80 mL无 RNA酶水，0.1 mol盐酸调pH 至 9 . 5,定容至 100 mL, 高压灭菌。

　　A.4 1 mol/LTris-盐酸溶液

　　121.14 g Tris碱，溶于 800 mL 无 RNA 酶水中，调 pH 至 9. 5,定容至 1 000 mL, 高压灭菌，4 ℃储存。

　　A.5 10% SDS溶液

　　10 g 十二烷基磺酸钠(SDS),溶于 80 mL 的无 RNA酶水中，加热约 68 ℃溶解，调 pH 至 7 . 2,定容至 100 mL, 4 ℃存放，4 ℃储存。

　　A.6 20 倍 SSc溶液

　　87.65 g氯化钠，44.1 g 柠檬酸钠，溶于 400 mL 的无 RNA 酶水中，调 pH 至 7.0,定容至 500 mL, 4 ℃ 储存。

　　A.7 封闭溶液

　　马来酸缓冲液将 10 倍封闭液(试剂盒中提供)稀释成 1 倍封闭液(现用现配)。

　　A.8 抗体溶液

　　使用前将抗地高辛碱性磷酸酶溶液按 10 000 r/ min 离心 3 min,从表面吸取一定量并用封闭溶液1 ∶ 5 000 稀释。

　　GB/T 34736—20 17

　　A.9 预杂交溶液

　　25%去离子甲酰胺 25 mL

　　20×SSC液 20 mL

　　10% 封闭液 20 mL

　　10% SDS液 20 mL

　　0.5 mol/L 磷酸氢二钠(Na2 HPO4) 10 mL

　　0 . 1 mol/ L N-乙酰十二烷基肌氨酸钠 5 mL

　　试剂盒中提供的地高辛标记的杂交小颗粒(DIG Easy Hyb Granyles)直接溶解即可使用。

　　A.10 杂交溶液

　　取 3 μL 的 en℃探针或 u3 探针(20 pmol/μL)放入 PCR管中，沸水浴 10 min,快速放入冰水中骤冷10 min,加入 1 mL预杂交液中，混合均匀备用。

　　A.1 1 NBT/BCIP显色液

　　吸取试剂盒中 40 μL 四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT/BCIP) 混合溶液加到 2 mL 的显色缓冲液中，此液现用现配。

　　A.12 0 . 2 mol/LEDTA溶液

　　EDTA 1.169 0 g,溶于 20 mL无 RNA酶水中，用氢氧化钠调 pH 至 8.0,高压灭菌，4 ℃避光保存。

　　GB/T 34736—20 17

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　特异性探针的制备与检测步骤

　　B.1 制备探针所需模板 RNA

　　取约黄豆粒大小的自然感染绵羊肺腺瘤病的肺组织样品，采用市售商品化 RNA 提取试剂盒，按说明书的方法进行操作，RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行，避免 RNA气溶胶的污染，估测

　　总 RNA浓度达 500 ng/μL,并于 4 ℃保存备用。

　　B.2 反转录(RT)反应体系

　　采用 10 μL体系，在 PCR管中依次加入模板 RNA(500 ng/μL) 1 μL, dNTPs(25 pmol/μL)0.5 μL,随机引物(50 pmol/μL)0.5 μL, 5 倍反应缓冲液 2 μL, AMV反转录酶 0.5 μL,其余用无 RNA酶水补至

　　10 μL。反转录条件为：37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。

　　B.3 PCR反应体系

　　反应总体系为 50 μL, 在 PCR 管中依次加入 Taq酶(5 U/μL) 0 . 5 μL, 10 倍反应缓冲液 5 μL, dNTPs(215 mmol/L)4 μL, 反转录的 cDNA模板(步骤 B.2 得到)2 μL(500 ng/μL) , 20 pmol/μL 的上、下游引物 en℃-P1 , en℃-P2 ;U3 -P1 , U3 -P2(引物序列参见附录 C) 各 1 μL, 其余用无 RNA 酶水补至

　　50 μL。

　　B.4 PCR循环条件

　　94 ℃预变性 2 min, 94 ℃变性 30 s, en℃基因 52 ℃退火 30 s,U3 区 52 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸

　　1 min, 分别进行 35 个循环，最后于 72 ℃延伸 10 min。 反应后，PCR产物取 5 μL,在 1%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　B.5 CDNA探针的制备步骤

　　B.5. 1 按程序 B. 3 扩增的绵羊肺腺瘤病毒en℃基因和U3 区产物经纯化后，分别取 1 μg 放入 1 . 5 mL离心管中作为模板，并加灭菌双蒸水到 16 μL。

　　B.5 . 2 将 1 . 5 mL 离心管放在沸水浴变性 10 min,迅速将其转移到冰浴中冷却。

　　B.5.3 在变性 DNA 中加入 4 μL 的地高辛标记混合物，混匀并且瞬时离心。

　　B.5.4 37 ℃孵育 20 h,预计地高辛标记产物量约为 1 050 ng。

　　B.5.5 加入 EDTA 2 μL (0.2 mol/L, pH 8.0) ,且 65 ℃水浴 10 min, 以终止标记反应，- 20 ℃保存备用。

　　GB/T 34736—20 17

　　B.6 CDNA探针的检测

　　B.6. 1 将地高辛标记产物和对照样品 DNA用稀释液(试剂盒中提供)稀释成 10 pg/μL, 3 pg/μL, 1 pg/μL, 0.3 pg/μL,0.1 pg/μL。

　　B.6.2 取不同浓度的地高辛标记产物和对照 DNA各 1 μL平行点至尼龙膜上，120 ℃烘焙 30 min,使核酸与膜结合。

　　B.6 . 3 将膜放入塑料平皿，加 20 mL 马来酸缓冲液，10 ℃ ~25 ℃下摇床反应 2 min,用 10 mL 封闭液孵育 30 min,再用 10 mL抗体溶液孵育 30 min,再用 10 mL洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 15 min,然后用10 mL检测缓冲液平衡 5 min。

　　B.6 . 4 将膜转到另一平皿中，加入 2 mL 现配 NBT/BCIP显色液于黑暗中显色 16 h,用 50 mL灭菌双蒸水 5 min终止反应，根据尼龙膜上出现的斑点与对照样品 DNA对比，确定探针的灵敏度。

　　B.7 探针浓度规定

　　en狏探针浓度是 0 . 27 ng/μL,大于或等于 0 . 27 ng/μL的探针均可使用。U3 探针浓度是 0 . 18 ng/μL,大于或等于 0 . 18 ng/μL 的探针均可使用。

　　GB/T 34736—20 17

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　制备探针所需引物序列

　　制备探针进行 PCR反应所需引物序列见表 C. 1 和表 C. 2 。

　　表 C.1 制备 env探针所需引物序列

　　表 C.2 制备 U3 探针所需引物序列

　　GB/T 34736—20 17

　　附 录 D

　　(资料性附录)探针的核酸序列

　　D.1 env探针序列

　　gagtagccaaaggagaacaggttataatagtaaaacagcctgcctttgtaatgctgcccgttgaaatagctgaagcctggtatgatgaaactg ctttagaattattacaacgcattaatacggctctcagccgccctaagagaggcctgagcctgattattttgggtatagtatctttaatcaccctcat agctacagctgttacggcttccgtatctttagcacagtctattcaagctgcgcacacggtagactccttatcatataatgttactaaagtgatggg gacccaagaagatattgataaaaaaatagaagataggctatcagctctatatgatgtagtcagagtcttaggagagcaagttcagagcattaat tttcgcatgaaaatccaatgtcatgctaactataaatggatttgtgttacaaaaaagccatacaatacttctgattttccatgggacaaagtgaaga aacatttgcaaggaatttggttcaatactaatctatcgttagaccttttacaactgcataatgagattcttgatattgaaaattcgccgaaggctac actaaatatagccgatactgttgataatttcttgcaaaatttattctctaattttcctagtctccattcgctgtggaaaaccctgattggtgtaggaat acttgtgtttattataattgtcgtaatccttatatttccttgccttgTtcgtggcat

　　D.2 U3 探针序列

　　tttccttgccttgttcgtggcatggttcgcgattttctaaagatgagagttgaaatgctgcatatgaaatatagaaatatgttacagcaccaacatc ttatggagcttttaaaaaataaagagaggggagatgcgggggacgacccgtgaagggttaagtcctgggagctctttggcagaagccaaagc ctaggacaagtacctaagctccctgtcccgccaccctcaagaatttttaaaagctcttaaggctcggatgtttgcttttggcactgcttcatagaaa taccaggaaatctgattatataagaatccggtgaTtgtgtaagaatccggtgggtgtagtgaataatg

　　GB/T 34736—20 17

　　参 考 文 献

　　[1] Hofacre A, Fan H. Jaagsiekte sheep retrovirus biology and oncogenesis.viruses.2010 , 2(12) : 2618-2648

　　[2] Minguij on E1 , Gonzolez L, De las Heras M, et al. Pathological and aetiological studies in sheep exhibiting extrathoracic metastasis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte)[J]. Journal of comparative pathology, 2013,148(2-3) : 139-147

　　[3] Liu S L, Miller A D. Oncogenic transformation by the jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein[J]. Oncogene, 2006 , 26(6) : 789-801

　　[4] Hull S, Lim J , Hamil A, et al. Analysis of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) envelope protein domains in transformation[J]. Virus genes, 2012 , 45(3) : 508-517

　　[5] Palmarini M, Hallwirth C, York D, et al. Molecular cloning and functional analysis of three type D endogenous retroviruses of sheep reveal a different cell tropism from that of the highly related exogenous jaagsiekte sheep retrovirus[J]. Journal of virology, 2000 , 74(17) : 8065-8076