GB/T 32211-2015 液相色谱用可变波长光度检测器的测试方法

　　ICS 17. 180.99 N 52

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 32211—2015

　　液相色谱用可变波长光度

　　检测器的测试方法

　　Standardpractice fortestingvariable-wavelength photometric

　　detectorsused in liquid chromatography

　　2015-12-10发布 2016-07-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 32211—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中国机械工业联合会提出 。

　　本标准由全国工业过程测量和控制标准化技术委员会(SAC/TC124)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国仪器仪表行业协会 、大连依利特分析仪器有限公司 、中国计量科学研究院 、北京创新通恒科技有限公司 、华东理工大学 、北京分析仪器研究所 。

　　本标准主要起草人 :马雅娟 、张学云 、陶红 、沈志刚 、张维冰 、娄兴军 。

　　液相色谱用可变波长光度

　　检测器的测试方法

　　1 范围

　　本标准用 来 指 导 可 变 波 长 光 度 检 测 器 (VWPD) 的 性 能 测 试 , 该 检 测 器 是 液 相 色 谱 系 统 中 在190 nm~ 800 nm 波长范围内的一个或多个波长工作的检测部件 。为与 GB/T 32212—2015一致 ,通常测试波长使用 254 nm ,也可选择其他波长进行测试 。

　　本标准旨在描述检测器的性能 ,包括独立于色谱系统的静态性能及与流动相通过的动态性能 。

　　关于液相色谱程序的总体说明 ,见参考文献[1] ~ [9] 。

　　关于液相色谱检测器的原理 、结构 、使用和评估的资料 ,见参考文献[10] 、[11]以及[1] ~ [7]中涉及检测器的内容 。

　　本标准并不涉及实际使用过程中有关的安全问题 。用户在使用前 ,确定本标准应用的局限性 ,并有责任制定适宜的安全及健康规范 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　ASTM E 275 紫外 、可见和近红外分光光度计性能描述和测试方法(Practice for describing and measuring performance of ultraviolet,Visible,and near-infrared spectrophotometers)

　　ASTM E 682 液相色谱术语(Practice for liquid chromatography terms and relationships)

　　3 术语和定义

　　ASTM E 682、ASTM E 275界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　吸光度校准 absorbancecalibration

　　校正吸光度范围在 ±5%以内的验证程序 。

　　3.2

　　漂移 drift

　　测量 1 h 以上 ,用每小时吸光度单位(AU/h)表示的噪声包络线的平均斜率 。

　　3.3

　　动态 dynamic

　　在流量为 1.0 mL/min下的状态 。

　　3.4

　　线性范围 linearrange

　　可变波长光度检测器的线性范围是流动相中测试物质在检测器上的响应值与浓度的比值恒定在±5%内所对应的浓度范围 , 图 1 中和 7.2.2进行了详细说明 。线性范围是最高线性浓度与最小检测浓度或最小线性浓度中比值的较大者 。

　　GB/T 32211—2015

　　图 1 光度检测器线性图示例

　　3.5

　　长期噪声 long-term noise

　　在 6周期/h~ 60周期/h(0.1周期/min ~ 1.0周期/min)频率之间 ,检测器随机信号的最大振幅的峰-峰值 ,用 AU表示 。

　　注 : 这种噪声可能被误认为是后洗脱峰 ,该噪声仅表示观测到的噪声 ,但并不总能观测到 。

　　3.6

　　最小检测限 minimum detectability

　　特定溶剂中特定溶质在光度检测器中产生的响应值为 2倍检测器静态短期噪声的浓度 。

　　注 : 静态短期噪声是测量峰-峰值噪声 ,利用统计法测量噪声值时建议当噪声值等于 3倍均方根(RMS)时可保证其值

　　超过 99%置信水平 。 因为峰-峰值噪声接近 5倍均方值噪声 ,所以本标准定义的最小检测限为保守的估算值 。

　　3.7

　　响应时间(输出速度) response time(speed ofoutput)

　　在检测器线性范围内 , 当流动相组成以阶梯式从新的平衡值 10%变化到 90%时 ,检测器输出所需的时间 。

　　注 : 因为检测器体积很小 ,传输速率不受扩散影响 ,一般响应时间足够快 ,可忽略不计 。通常将记录仪(或数据处理装置)的响应时间与相关检测器电位差计和记录仪(或数据处理装置)放大器相比较 ,影响观测响应时间的因素包括实际检测器响应时间 、电子滤波和系统带宽 。

　　3. 8

　　短期噪声 short-term noise

　　在 1周期/min频率以上 ,检测器随机变化信号的最大振幅的峰-峰值 ,用 AU表示 。

　　注 : 短期噪声值决定了用可变波长光度检测器测定的最 小 信 号 值 和 痕 量 样 品 可 达 到 的 精 确 定 量 限 ,并 确 定 线 性 最低限 。本噪声仅对应于可观测到的噪声 。

　　3.9

　　静态 static

　　在无流量下的状态 。

　　3. 10

　　波长准确度 wavelengh accuracy

　　测试样品的最大吸收波长与其已知最大吸收波长的偏差 。

　　3. 11

　　波长重复性 wavelengh precision

　　可变波长光度检测器再现到相同光谱位置能力的评估 。

　　注 : 重复将检测器波长设定为已知样品的最大吸收波长处 ,考察测量已知样品吸收值的再现性 。

　　4 重要性和用途

　　4. 1 在不同或特定条件下 ,有可能观测和测量到检测器的各种性能 ,但是本标准旨在相同工作条件下获得一套完整的检测器技术指标 ,也指出了为完整地描述检测器的能力 ,在检测器使用范围内的几种条件下测试它的性能 。本标准中使用的术语和试验方法普遍适用 ,不考虑最终工作参数 。

　　4.2 使用的记录仪(或数据处理装置)或其他读数设备的线性和响应时间不应失真 ,否则会干扰检测器性能 。这需要调节增益 、阻尼 ,校准到与制造厂的标准一致 。如果在检测器和终端读数设备之间使用辅助电子滤波器或放大器 ,也应首先确定它们的性能指标 。

　　5 噪声和漂移

　　5. 1 测试条件

　　样品池中用适当级别的脱气纯甲醇充满 。如果有参比池 ,则选用空气或氮气充满 。 高压设备可能使空气中产生臭氧 ,所以最好选用氮气 。保持整个系统温度稳定 , 防止基线漂移 。

　　检测器应固定在测试现场 ,并且在测试开始前至少启动 24 h。预热不足会产生超出检测器真实值的漂移 。检测器波长设定在 254 nm。

　　5.2 测量方法

　　5.2. 1 在泵与检测器之间连接一个合适的装置 ,在 1.0 mL/min甲醇流量下 ,此装置可提供至少75kPa的背压 。检测器出口连接一小段(大约 100 mm)内径 0.25 mm 不锈钢管防止气泡形成 。将记录仪(或数据处理装置)连接到检测器对应的输出端 。

　　注 : 推荐的设备包括 :

　　a) 长度 2 mm~ 4 mm 的内径 0.1 mm 不锈钢管 。

　　b) 用扁口钳或切管器制成的长度 250 mm 内径 0.25 mm~ 0.5 mm 的不锈钢盘管 。

　　c) 固定在泵和进样器间背压阀 。

　　5.2.2 用脱气甲醇反复冲洗溶剂瓶和色谱系统 ,包括检测器 ,去除系统中所有其他溶剂 、可溶物质及夹杂的气体 。把甲醇注入溶剂瓶 ,并用泵带动甲醇冲洗整个系统至少 30 min,充分清洗系统 。

　　5.2.3 如需要 ,参比池中注入空气或氮气 。确保池体清洁 、没有尘埃并完全干燥 。

　　5.2.4 进行静态测试时 ,停泵 ,让色谱系统在室温 、无流量条件下稳定至少 1 h。设定衰减器在最大灵敏度(最小衰减量) ,也就是最小满度吸收值(AUFS) 。 调节具有可变响应时间的光度检测器的响应时间尽可能接近 2 s,记录使用的响应时间 ,调节检测器输出接近读数装置刻度中部 。在这种状态下 ,记录检测器信号至少 1 h,在测量过程中 ,环境温度变化不超过 2 ℃ 。

　　注 : 时间常数可通过响应时间乘以放大因子 2.2来换算 。 电子滤波器对观测噪声的影响可以通过设定一系列响应时间进行重复的噪声测量来确定 。

　　5.2.5 画几组长度在 0.5 min~ 1 min之间的平行包络线 ,观测任意 15 min周期内所有检测的随机变

　　化的框图(见图 2) 。这种画平行包络线的方法可以使每组平行线之间的距离最小 。计算出所有部分的平均值 , 以 AU表示的距离值除以光程(cm)得到静态短期噪声 。

　　5.2.6 在 15 min静态短期噪声测量段的中间做标记 ,在中间部分的四周画一系列平行包络线组 ,每组对应 10min长 ,选择线间纵向距离最大的一组平行包络线(见图 2) 。将纵向距离 AU值除以光程(cm)得到静态长期噪声 。

　　5.2.7 画一组 1 h纵向距离最小的平行包络线(见图 2) ,每根线的斜率为静态漂移 ,用 AU/h表示 。

　　5.2. 8 在 与 5.2.1~ 5.2.3 管 路 、溶 剂 、温 度 等 相 同 条 件 下 , 设 定 泵 流 量 1.0 mL/min, 让 系 统 稳 定15 min。在此流量条件下 ,记录信号至少 1 h,在测量过程中 ,环境温度变化不超过 2 ℃ 。

　　5.2.9 画几组平行线按 5.2.5 描述的方法测量纵向距离 ,并计算动态短期噪声 。

　　5.2. 10 按 5.2.6描述的方法测量动态长期噪声 。

　　5.2. 11 按 5.2.7描述的方法 ,画平行线组 ,这些线的斜率就是动态漂移 。

　　5.2. 12 系统的实际噪声可能比检测值大或小 ,这取决于检测器数据采集或信号检测方法 , 因为检测到的噪声是与读数装置的频率 、响应速度和带宽相关的函数 。

　　图 2 光度检测噪声和漂移测量示例(记录仪输出图)

　　6 波长准确度和重复性

　　6. 1 概述

　　可变波长光度检测器的波长准确度和重复性是色谱检测性能的重要参数 。在检测中选用的不同的波长检测不同吸收光谱的不同化合物 。 如果波长不准确 ,测定的线性范围也可能不正确 ,从而影响检测 。检测器的波长重复性要按照已知的相同波长来调节 。可变波长光度检测器波长由检测器的单色仪和光学校准来决定 。光学校准由制造商提供 ,一般不需要调整 。某些检测器换灯后需要对灯校准 。本标准可用于验证已校准的检测器其波长准确度和重复性是否符合制造厂的技术指标 。

　　6.2 波长准确度测量方法

　　6.2. 1 将已知最大吸收波长的化合物溶液注入检测池中 ,测定可变波长光度检测器波长准确度 。 比较化合物最大吸收波长的测量值与已知值 。具有多种可用的化合物和溶剂 。推荐方法见 6.2.2~ 6.2.5。

　　注 : 推荐方法包含于美国专利 4,836,673,本标委会不对本标准中任何条款有关专利权的有效性发表看法 。 明确建议该标准的使用者确定这些专利权的有效性 ,侵权专利权的风险全部由本标准的使用者负责 ,否则考虑其他可替代方法 。

　　6.2.2 测试溶液的配制 ,25 mL水中溶解 2 g 六水合高氯酸铒 ,浓度为 0.14 mol/L。选择合适的滤膜过滤溶液 ,确保样品中没有不溶性杂质 。

　　注 : 把水加入装 2 g六水合高氯酸铒的小瓶中溶解固体样品,转移到 25 mL容量瓶中 ,并用水定容 。最终溶液不需定量 ,转移溶液过程中应注意将溶解的高氯酸铒转移至容量瓶中 。

　　6.2.3 打开检测器 ,按产品说明书预热 。用水彻底冲洗检测池 ,使用的水最好与配制测试溶液使用的水相同(如果使用其他的测试化合物 ,确保使用与测试溶液相同的溶剂) 。测试过程中设定检测器波长为 250 nm ,将检测器归 0(在变换波长后 ,有些检测器会自动归 0) 。用 1 mL 以上的铒测试溶液冲洗检测池 ,记录吸光度读数 。增加 1 nm 波长 ,用 1 mL 以上的水冲洗检测池 ,将检测器归零 ,用铒测试溶液冲洗池体 ,并记录吸光度读数 。每次增加 0.5 nm 到 1 nm ,重复上述步骤 ,直至 260 nm。

　　6.2.4 绘制吸光度与波长关系曲线 ,并测定出最大吸光度(见图 3) ,将计算的最大吸光度与 255 nm 时高氯酸铒的最大吸光度比较 ,记录测试溶液的理论最大值与计算最大值 。计算的最大值应在制造商规定的波长精度以内 ,如果检测器不符合规定 ,根据说明书调整光源或单色仪 ,或同时调整两者 。

　　图 3 波长精度测试图示例

　　注 : 因为可变波长检测器可有较大的带通 ,所以无需以分光光度计的标准来要求其波长准确度 。根据报道已知波长已全部接近 nm。

　　6.2.5 可在 379 nm 或 522 nm 等波长处进行重复测试 ,如果有可见区的光源 ,则可用来测试 522 nm。

　　6.3 波长重复性测试方法

　　6.3. 1 对于可变波长光度检测器的波长重复性的测定 ,操作者重新设置检测器波长后 ,重复测定一种化合物溶液在已知其最大吸收波长的吸光度 。本方法主要以机械和(或)电子方法确定检测器的波长位置 , 以下为推荐方法 。

　　6.3.2 确认仪器波长 准 确 度 后 , 设 定 检 测 器 的 测 定 波 长 为 被 测 物 的 最 大 吸 收 波 长(高 氯 酸 铒 溶 液 为255 nm) ,用 1 mL 以上的水冲洗检测池 , 然后将检测器归 0。 用 1 mL 以上的高氯酸铒溶液冲洗检测池 ,记录吸光度 。重新设定检测器波长至与样品最大吸收波长相差 10 nm 以上处 ,再恢复至最大吸收波长 。重复冲洗测试溶液 ,记录吸收值 , 直至最后得到 5个样品吸光度值 。

　　6.3.3 计算吸光度读数的相对标准偏差(RSD)来确定波长重复性 ,见式(1) :

　　RSD

　　式中 :

　　Ai— 单个吸光度值 ;

　　A — 吸光度平均值 ;

　　n — 试验次数 。

　　7 最小检测限、线性范围和校准

　　7. 1 概述

　　如果要确定某一种物质在光度检测器上的线性范围 ,则应确定这种测试物质的响应 。 7.2 的方法已考虑为最差的情况 。

　　7.2 测试方法

　　7.2. 1 在甲醇中溶解一种适合的化合物 ,其具有紫外吸收且吸收值随波长变化而产生显著变化 。选择一个预期超出线性范围的浓度 ,通常吸收值在 2AU 以上 。将此溶液准确稀释成能覆盖整个线性范围的系列溶液 ,也就是说 ,稀释到最小检测浓度 。用甲醇冲洗检测池 ,在检测池中为甲醇时将检测器读数调整为 0。用最低浓度的样品溶液冲洗检测池至得到稳定读数 ,通常 1 mL 的冲洗量就足够 。记录检测器输出读数 。然后 ,用下一个浓度较高的样品溶液清洗注射器 ,依次将每份稀释得到的样品溶液注入检测池中 。在静态条件下测量 ,至少获得线性范围内的 5个测量值 。

　　7.2.2 计算每个样品溶液的检测器响应值(AU)与浓度(μg/μL)的比值 ,将这些比值对浓度的对数绘图(见图 1) 。线性区域定义为恒定响应比得到的水平线 。较高浓度时 ,一般与线性有负偏差 ,而在低浓度时 , 出现正 、负偏差均有可能 。在恒定响应比线上下 5%位置画水平线 ,测量恒定响应比线与一条 5%范围线在高浓 度 端 相 交 , 交 点 所 对 应 的 浓 度 就 是 线 性 上 限 浓 度 。 线 性 下 限 浓 度 是 最 小 检 测 浓 度 (见7.2.3)或恒定响应比线与一条 5%范围线在低浓度端相交交点所对应的浓度 ,两者中较大者 。

　　7.2.3 通过计算静态短期噪声 2倍的浓度 ,确定试验物质的最小检测限 ,需标明溶剂和溶质 。

　　7.2.4 计算线性上限和下限之间的比值得出线性范围 ,用一个数值表示 。 因为此值是在最差情况下测量的 ,对在选择波长范围内具有宽谱带吸收的物质 ,其线性范围可能要比测试得到的更大 。

　　7.2.5 绘制或计算检测器响应(AU)与已知摩尔吸光度测试物质浓度(μg/μL)之间的关系 ,找出通过坐标原点的最佳线段 ,按式(2)计算测试溶液的摩尔吸光度 ε:

　　…………………………( 2 )

　　式中 :

　　slop — 线性部分斜率 ,单位为吸光度单位微升每微克(AU · μL/μg) ;

　　MW — 摩尔质量 ,单位为克每摩尔(g/mol) ;

　　b — 制造厂规定的光程 ,单位为厘米(cm) 。

　　将得到的 ε值与实验测得的值或参考文献(见注)中的值进行比较 ,如果值相差大于 5% ,需要调整光度检测器 。具体操作查阅制造商说明书 。

　　注 : 甲醇中的脲嘧啶在 254 nm 处摩尔吸光度是 8.77× 103 ,在 280 nm 处是 1.42× 103 ;0.005 mol/L硫酸中的重铬酸钾在 254 nm 的摩尔吸光度是 4.22× 103 ,在 280 nm 是 3.60× 103 。

　　8 响应时间

　　8. 1 概述

　　当使用小粒径短柱和快速记录仪(或数据处理装置)时 ,检测器的响应时间就变得十分重要 。如果响应时间长 ,有可能降低检测噪声 ,增加线性范围 。尽管这对宽峰几乎没有影响 ,但是窄峰信号会明显下降 。如果响应时间可调 ,在其最大值和最小值处进行测试 。

　　8.2 测试方法

　　8.2. 1 流动相组成可呈梯度变化 ,输出信号记录在快速响应装置上 。如果记录仪(或数据处理装置) 响应时间不是远远小于检测器响应时间 ,那么只能得到检测器和记录仪(或数据处理装置) 响应时间的叠加值 ,记录色谱图时也是叠加的响应时间 。

　　8.2.2 设定流量为 2.0 mL/min。

　　8.2.3 通过在泵和检测器之间安装有 1 mL定量环的进样阀(或者体积至少是 4 倍检测器输入端到输出端管路总体积的定量环) ,可获得信号值的阶梯式变化 。观察记录仪(或数据处理装置) 谱图 ,确定其已达到稳定 。不稳定状态可能发生在响应时间为快速情况下 ,此时需要增加样品体积 。将定量环中充满一定浓度的检测物 质 的 甲 醇 溶 液(参 考 7.2.1) , 在 适 当 的 衰 减 值 下 能 得 到 检 测 器 满 量 程 的 50% ~ 95%信号 ,此时可认为该浓度在线性范围以内 。

　　8.2.4 以 3.0 mL/min流量重复上述测量 。如果测量值小于 2.0 mL/min时得到的值 ,那么在更大流量下重复测量 ,直到获得稳定的数值 。

　　8.2.5 谱图上新平衡值信号从 10%上升到 90%时 ,所需要的时间为响应时间(见图 4) 。谱图采集速度应足够快才能获得准确的测量结果 。

　　图 4 光度检测器与响应时间测量示例

　　9 折光率(RI)灵敏度

　　9. 1 概述

　　理想状态下 ,要使运行梯度时基线变化最小 ,紫外可见检测器应对流动相变化而引起的折光率变化

　　不敏感 。在这种试验条件下 ,折光率的灵敏度是通过测量检测池中充满甲醇(n= 1.329) , 然后充满环

　　9.2 测量方法

　　9.2. 1 开启检测器 ,并使之稳定 1 h 以上 ,或按制造厂规定时间预热 。

　　9.2.2 设定波长 280 nm ,检测器/记录仪(或数据处理装置)输出 0.01AUFS。

　　9.2.3 设定绘图速率 1 cm/min。

　　9.2.4 用注射器向检测池注入至少 1 mL 甲醇 ,使得检测池内充满甲醇 。将注射器继续连接在检测池入 口 ,用一合适的盖或塞堵住检测器出口管来密封检测池 。

　　9.2.5 记录至少 5 min的基线 。

　　9.2.6 取下管盖或塞子 ,重复此过程 ,直至基线变化不超过 0.001AU。

　　9.2.7 取下管盖或塞子 ,用注射器注入色谱级乙醇清洗检测池 。

　　9.2. 8 清洁 、干燥 ,用注射器注入环己烷 ,重复 9.2.4~ 9.2.6。

　　9.2.9 以 AU 为单位 ,测量并记录 2条基线的差值(见图 5) 。

　　图 5 可变波长检测器折光率测量示例

　　10 补充说明

　　10. 1 其他重要参数

　　10. 1. 1 要对可变波长光度检测器(VWPD) 进 行 更 全 面 的 评 估 , 除 上 面 描 述 的 因 素 外 , 下 列 因 素 也 很重要 。

　　10. 1.2 衰减范围 :在标准输出电压 下 检 测 器 输 出 的 最 大 和 最 小 电 压 值 设 置 , 用 满 刻 度 吸 收 单 位 表 示(AUFS) 。此电压规定为记录仪(或数据处理装置)满刻度毫伏数 (mVFS) 。 当零点信号调整为记录仪(或数据处理装置)的零点后 ,该 AU准确地代表了记录仪(或数据处理装置)的满刻度值 。

　　10. 1.3 波长范围 :检测器可正常使用的波长范围 。

　　10. 1.4 带通 :最大值一半时谱线的宽度 ,对于宽谱光源 , 由滤光片的带宽决定 。

　　10. 1.5 光程 :光通过检测池中液体的轴向有效长度 。

　　10. 1.6 池体积 :检测池中产生光吸收的有效体积 。

　　10. 1.7 检测器体积 :检测器入口与出 口之间的总体积 ,入口端应可直接连接色谱柱 , 出 口端可与另 一检测器入口端相连 。

　　10.2 参比

　　10.2. 1 检测器采用单光束时 ,无参比 。

　　10.2.2 检测器采用双光束时 ,其中有一个参比池 。应事先说明 ,否则参比为空气 。

　　10.2.3 对于双光束仪器 ,如果样品光路与参比光路平衡时的光强比不是 1 ∶ 1,应事先说明 。

　　10.3 监视器

　　显示到达样品光能量的仪表或其他装置 ,应说明该仪表测量的量纲 。

　　10.4 校准检查

　　在不使用外部装置情况下 ,调节检测器输出至特定吸收值的装置 。

　　10.5 灯类型

　　检测器使用的光源种类 。

　　10.6 灯预期寿命

　　5 只或更多灯连续工作的平均寿命 ,通常是指光强度衰减到一半 ,而不是完全失效时的寿命 。

　　10.7 压力限

　　保证检测池正常工作而不产生损害或泄漏时的最大工作压力 。

　　10. 8 热交换器

　　把流动相温度调整到与检测器池体温度相近的装置 。

　　10.9 检测池接触材质

　　检测池所有与流动相接触部位的材料 。

　　10. 10 输入管

　　所有连接到检测池入口管路的材质 、长度和内径 。

　　10. 11 最大归零补偿

　　检测器在微调或粗调和微调同时进行的条件下 ,检测器零点变化的最大量 。

　　10. 12 光电检测器

　　光电检测器的类型 。

　　10. 13 杂散光滤光片

　　如果有 ,说明其类型以及带通 。

　　参 考 文 献

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　　[15] GB/T 32212—2015 液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法 .