GB/T 31805-2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31805—2015

　　豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofCowpeaseveremosaicvirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31805—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中 华 人 民 共 和 国 厦 门 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 江 苏 出 入 境 检 验 检疫局 。

　　本标准主要起草人 : 陈青 、李彬 、方志鹏 、黄峰 、廖富荣 、陈红运 、林石明 。

　　豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学 、生物学和分子检测方法 。

　　本标准适用于可能携带有豇豆重花叶病毒的植物繁殖材料(种子 、植株)和产品的检疫鉴定 。

　　2 仪器设备和主要试剂

　　2. 1 仪器设备

　　PCR仪 、定量 PCR 仪 、灭菌锅 、制冰机 、超低温冰箱 、常规冰箱 、旋涡 震 荡 器 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系统 、微量研磨仪 、酶标仪 、洗板机 、微量天平(感量 :0. 001 g) 、水平电泳槽 、高速冷冻台式离心机 、水浴槽 、 pH计 、移液器(1 000 μL、200 μL、20 μL、2 μL) 、96孔酶标板 、研钵等 ; 防虫温室 。

　　2.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试 剂 均 为 分 析 纯 。 PCR 缓 冲 液 、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP) 、DNA聚合酶 、引物和探针 、琼脂 ,酶联检测试剂见附录 B。

　　3 检测样品的制备

　　3. 1 种子

　　挑取畸形种子播于灭菌土中 ,待长出 3 片 ~ 4 片叶后 ,将表现症状的植株编号 ,未表现症状的植株分组(10株为 1组)并编号 。采集的叶片分成 2份 ,根据需要分别用于酶联测定和分子检测 。

　　3.2 植株

　　有症状(如叶片畸形 、花叶 、斑驳等)的植株编号单独检测 。没有症状的分组并编号检测 ,分组方法和检测方法同 3. 1。双抗体夹心酶联免疫吸附测定 。

　　4 检测与鉴定

　　4. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　把制备的样品上清液加入已包被 CPSMV抗体的酶联板中 ,进行 DAS-ELISA。每个样品平行加到两个孔中 。设阴性对照和阳性对照[健康的植物组织作阴性对照 ,感染了 CPSMV 的植物组织作阳性对照 ,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致] ,样品提取缓冲液作空白对照 ,不同的检测试剂或试剂盒按说明操作 。具体操作见附录 B。

　　4.2 RT-PCR

　　分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后 ,进行 PCR扩增 。健康的植物组织作阴性对照 ,感染 CPSMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。具体操作见附录 C。

　　GB/T 31805—2015

　　4.3 IC-RT Real-timePCR

　　分别提取样品和对照的总 RNA,进行 IC-RT real-timePCR检测 。健康的植物组织作阴性对照 ,感染 CPSMV 的植物组织作阳性对照 ,超纯水作空白对照 。具体操作见附录 D。

　　4.4 生物学测定

　　样品按 1 ∶ 2~ 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积) 加入研磨缓冲液 , 在研钵中研碎 。研 碎 后 放 入 硅 藻 土(浓 度 为0. 5%)并与病汁液混匀 ,接种到鉴别寄主上 。具体操作参见附录 E。

　　5 结果判断

　　样品经 DAS-ELISA、普通 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR检测结果为阴性时 ,判定样品未检出豇豆重花叶病毒 。

　　样品经 DAS-ELISA检测 结 果 为 阳 性 , 进 一 步 用 RT-PCR 或 实 时 荧 光 RT-PCR 方 法 进 行 检 测 。 PCR结果 为 阴 性 , 判 定 未 检 出 豇 豆 重 花 叶 病 毒 ; PCR 结 果 为 阳 性 , 可 以 判 定 为 样 品 检 出 豇 豆 重 花 叶病毒 。

　　6 结果记录与样品保存

　　6. 1 结果记录

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有经手人和实验人员的签字 。酶联测定需有酶联板反应的原始数据;PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析结果 ;实时荧光 PCR需要有荧光曲线图与 Ct值 ;生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 。结果记录与资料保存期限至少 1 年 。

　　6.2 样品保存

　　经检验确定携带 CPSMV 的样品应在合适条件下保存以备复核 ,种子保存在 4 ℃ ,病叶冻干保存在-20 ℃或者 -80℃冰箱中 ,做好标记和登记工作 。样品保存期限至少 1 年 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　豇豆重花叶病毒相关资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 豇豆重花叶病毒基本信息

　　学名 :Cowpea severemosaicvirus

　　缩写 :CPSMV

　　分类地位 :豇豆花叶病毒属(Comovirus)成员 。

　　A. 1.2 方法原理

　　豇豆重花叶病毒的分子生物学特性 、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据 。

　　A.2 自然寄主

　　菜豆(Phaseolusvulgaris) 、大豆(Glycine max) 、绿豆(Vigna radiata) 、豇豆(Vigna sinensis) 、长豇豆(Vigna sesquipcdalis) 、毛 蔓 豆(Calopogonium mucunoides) , 直 生 刀 豆(Canavalia ensiformis) ,距 瓣 豆 ( Centrosema pubescens) , 菽 麻 ( Crotalaria juncea ) , Desmodium canescens, 大 翼 豆(Macroptilium lathyroides) , 四棱豆(Psophocarpustetragonolobus) ,Crotalaria paulinea。

　　A.3 病害症状

　　几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑 ,系统症状为斑驳或花叶 ,幼叶通常形成明显疱状突起 、畸形 。一些寄主表现系统坏死 。

　　大豆 :在巴西 ,受侵染的大豆出现植株矮化 、芽枯 、结荚数减少 、产量降低 ;

　　毛蔓豆 : 出现严重花叶和疱状突起 ;

　　距瓣豆 : 出现褪绿和花叶症状 ;

　　菽麻 : 叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状 ;

　　绿豆 : 叶片出现轻花叶和坏死斑症状 ;

　　豇豆 : 叶片出现褪绿花叶和严重畸形 。

　　A.4 分布

　　美国 、特立尼达(特立尼达和多巴哥共和国) 、波多黎各岛 、萨尔瓦多 、哥斯达黎加 、委内瑞拉 、苏里南 、巴西 、秘鲁 、墨西哥 。

　　A.5 传播途径

　　CPSMV可以通过机械传播 ,花粉 、种子传播 ,豇豆的种传率为 10% ,长豇豆(Vigna sesquipcdalis)

　　的种传率为 8% ;也可以通过甲虫传播 ,主要是叶甲科甲虫传播 ,大约有 10种 ,菜豆叶甲(Ceratoma tri- furcata) 是最重要的传 播 介 体 , 还 可 以 通 过 带 斑 黄 瓜 叶 甲 (Diabroticabalteata) 和 南 美 叶 甲 (D. spe- ciosa) 、Cerotomaruficornis等媒介昆虫传播 。

　　A.6 抗原特性

　　CPSMV具有强免疫原性 ,容易制备高滴度的特异抗体 。

　　A.7 粒体形态

　　病毒粒体为等轴对称二十面体 ,直径 25 nm ,无包膜 。

　　A. 8 基因组

　　CPSMV基因组由 2条 RNA组成 ,RNA-1和 RNA-2 由不同的病毒粒子包裹 ,RNA1包裹在沉降组分 B 的粒子中 ,RNA2包裹在沉降组分 M 的粒子中 。RNA-1长 5 957nt;RNA-2长 3 732 nt。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的豇豆重花叶病毒抗体 。

　　B. 1.2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的豇豆重花叶病毒抗体 。

　　B. 1.3 底物溶液

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP)100mg溶解于底物缓冲液 100 mL 中 ,现配现用 。

　　B. 1.4 样品抽提缓冲液

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW24000~40000) 20. 0 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　吐温 20 (tween-20) 20 mL

　　溶于 1 L 1×PBST,调 pH 至 7. 4,4 ℃冰箱保存 。

　　B. 1.5 包被缓冲液

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 900 mL蒸馏水 ,调 pH 至 9. 6,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃冰箱保存 。

　　B. 1.6 PBST缓冲液(洗涤缓冲液)

　　溶于 900 mL蒸馏水 ,调 pH 至 7. 4,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃冰箱保存 。

　　B. 1.7 酶标抗体稀释缓冲液

　　牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉 2. 0 g

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW24000~40000) 20. 0 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 1 L 1×PBST,调 pH 至 7. 4,4 ℃冰箱保存 。

　　B. 1. 8 底物(pNPP)缓冲液

　　溶于 800 mL蒸馏水 :

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,用 pH 调至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃冰箱保存 。

　　B.2 实验步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按说明稀释 ,加入酶联板的孔中 , 100 μL/孔 , 37 ℃孵育 4 h, 清空孔中溶液 , PBST洗涤 3 次 。

　　B.2.2 样品制备

　　样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液 ,用研钵研磨成浆 ,7 500 g离心 10 min,上清液即为制备好的待测样品 。 阴性对照 、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 ;空白对照为样品抽提缓冲液 。

　　B.2.3 加样

　　根据检测需要设计 96孔(或 48孔)酶联板 ,包括 2个阴性对照孔 、2个阳性对照孔 、2个空白对照孔和多个待测样品孔 。加样量为 100 μL/孔 ,每个样品设 1 个重复 。 4 ℃冰箱孵育过夜 ,酶联板用 PBST洗涤 3 次 。

　　B.2.4 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度 ,并加入到酶联板中 , 100 μL/孔 , 37 ℃孵育 2 h,PBST洗涤 3 次 。

　　B.2.5 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100μL/孔 ,加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B.2.6 读数

　　用酶标仪在 30 min、1 h 和 2 h 于 405 nm 处读 OD值 。

　　注 : 实际检测时 ,孵育温度 、PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 。

　　B.3 结果判断

　　B.3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值均<0. 15;

　　当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 ;

　　阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >5~ 10;重复性好 。

　　B.3.2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果作如下判断 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值接近 2,判为可疑样品,需用其他方法验证 。

　　B.3.3 若满足不了 B. 3. 1 质量要求 ,则不能进行结果判定 。

　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 RNA提取试剂

　　TrizoL裂解液 、三氯甲烷 、异丙醇 、75%乙醇 。

　　C. 1.2 反转录试剂

　　M-MLV 反转录酶 (200U/μL) ,5×反转录 Buffer,dNTP(10 mmol/L) ,Rnasin (40 U/μL) 、焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的 ddH2 O。

　　C. 1.3 PCR试剂

　　10×PCR Buffer、dNTP(10 mmol/L) 、DNA 聚合酶(5U/μL) 。

　　C. 1.4 电泳试剂

　　C. 1.4. 1 50× TAE

　　Tris 242 g

　　冰醋酸 57. 1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠 37. 2 g

　　加去离子水定容至 1 L。用时加水稀释至 1×TAE。

　　C. 1.4.2 6×加样缓冲液

　　0. 25% 溴酚蓝

　　40%(质量 ∶ 体积) 蔗糖水溶液

　　C.2 实验步骤

　　C.2. 1 总 RNA提取

　　称取 0. 1 g植物组织加液氮研磨成粉末状 ,迅速将其移入灭菌的 1. 5 mL离心管中 , 加入 1 mL 的TrizoL试剂 ,剧烈震荡摇匀 ,室温静置 3 min;4 ℃ ,12000g 离心 10min,取上清液 ;加入 200μL氯仿 ,上下颠倒混匀 ,室温静止 3 min;4℃ ,12000g 离心 10min,取上层水相 ;加等体积的异丙醇 ,颠倒混匀 ; 4 ℃ ,12 000g 离心 10 min,弃上清液 ;加 1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀 ,4 ℃ , 7 500 g 离心 5 min,弃乙醇 ;沉淀于室温下充分干燥后 ,溶于 30 μL经 DEPC处理的 ddH2 O, -20 ℃保存备用 。

　　C.2.2 RT-PCR反应

　　C.2.2. 1 引物与产物

　　RT-PCR检测引物见表 C. 1。

　　表 C. 1 PCR 引物序列

　　C.2.2.2 cDNA合成

　　反转录总体系为 12. 5 μL。在 PCR管中依次加入 3 μL总 RNA,1 μL下游引物 CPSMV-356r(浓度为 20 pmol/μL) , 65 ℃温浴 7 min,然后冰浴 5 min, 瞬时离心 ,再向 PCR 管中加入下列试剂 :M-MLV RT(200U/μL) 0. 5 μL、5×RT 缓冲液 2. 5 μL、dNTP (10 mmol/L) 0. 5 μL、RNasin(40U/μL) 0. 5 μL、 DEPC处理的 ddH2 O 4. 5 μL。反应参数 :42 ℃ 60min,95 ℃ 10min。合成的 cDNA 于 -20℃冰箱保存备用 。

　　C.2.2.3 PCR扩增

　　PCR反应体系见表 C. 2。反应参数 :94 ℃ 3 min; 94 ℃ 45 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,35个循环 ; 72 ℃延伸 7 min。

　　表 C.2 PCR反应体系

　　C.2.3 琼脂糖电泳

　　C.2.3. 1 制备凝胶

　　将 1×TAE和电泳级琼脂糖按 1. 5% (质量 ∶ 体积)配好 ,在微波炉中熔化混匀 ,冷却至 55 ℃左右 ,加入溴化乙锭(浓度为 0. 5 μg/mL) , 混匀 ,倒入已封好的凝胶平台上 ,插上样品梳 。待凝胶凝固后 ,从制胶平台上除去封带 ,拔出梳子 ,加入足够量的 TAE(缓冲液没过凝胶表面约 1 mm) 。

　　C.2.3.2 加样

　　取 8 μLPCR产物与加样缓冲液按规定比例混匀 ,加入到琼脂糖凝胶孔中 ,使用的 DNA 标准分子量应与目的片段大小相匹配 。

　　C.2.3.3 电泳

　　接通电源 , 以 5 V/cm(正 、负极之间的距离)的电压进行电泳 , 当指示剂迁移至足够分离 DNA 片段时 ,关闭电源 。将整个胶置于凝胶成像仪上观察 。

　　C.3 结果判定

　　如果阳性对照出 现 356 bp的 条 带 , 检 测 样 品 、阴 性 对 照 和 空 白 对 照 未 出 现 条 带 , 可 判 定 样 品 为阴性 。

　　如果阳性对照及检测样品出现约 356bp的条带 , 阴性对照和空白对照未出现条带 , 可判定样品为阳性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　IC-RT realtimePCR检测

　　D. 1 试剂

　　CPSMV抗体 、包 被 缓 冲 液 和 PBST 试 剂 见 B. 1; RNA 提 取 和 cDNA 合 成 试 剂 见 C. 1. 1; 2 × FastStartUniversalProbe Mast(rox) 。

　　D.2 实验步骤

　　D.2. 1 包被抗体

　　根据检测试剂说明 ,将 包 被 抗 体 用 包 被 缓 冲 液 稀 释(如 1 ∶ 200) , 取 25 μL稀 释 好 的 包 被 溶 液 于PCR管中 。25 ℃中放置 3 h或 4 ℃冰箱中过夜 ,用 PBST缓冲液洗涤 3 次 ~ 5 次 ,去除残留溶液 。

　　D.2.2 抗原捕捉

　　向每个已包被抗体的离心管中加入检测样品上清液 25μL,25 ℃下放置 2 h~ 3 h或 4 ℃冰箱中放置过夜 ;加入 PBST缓冲液洗涤 3 次 ~ 5 次 ,灭菌双蒸水洗涤 2 次 ,去除残留溶液 。

　　注 : 如果是用于验证 DAS-ELISA 的检测结果 ,可直接使用血清学检测样品的剩余提取液 。

　　D.2.3 cDNA合成

　　在已制备好的免疫捕获 PCR 管中加入 :特异性下游引物 CPSMVR(20 μmol/L)0. 5 μL及无 RNA酶 ddH2 O 8. 5 μL,在 PCR 仪上 95 ℃处理 5 min,迅速冷却后 ,再向 PCR 管中加入下列试剂 : M-MLV RT(200U/μL) 0. 5 μL、5×RT 缓冲液 2. 5 μL、dNTP (10 mmol/L) 0. 5 μL、RNasin(40U/μL) 0. 5 μL。反应参数 :42 ℃ 60 min,95 ℃ 10 min,加入剩余反转录(RT) 反应液进行反转录 ,42 ℃ , 60 min。反转录总体积 10 μL。

　　D.2.4 Real-timePCR检测

　　D.2.4. 1 引物与探针

　　引物和探针序列见表 D. 1。

　　表 D. 1 引物和探针序列及其在基因组中的位置

　　D.2.4.2 反应体系

　　实时荧光 PCR反应体系见表 D. 2。

　　表 D.2 实时荧光 PCR反应体系

　　D.2.4.3 反应参数

　　反应条件为 :94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,45个循环 。

　　D.3 结果判定

　　检测样品的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定豇豆重花叶病毒阴性 。

　　检测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定豇豆重花叶病毒阳性 。

　　检测样品的 Ct值小于 40而大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定豇豆重花叶病毒阴性 ;如果重新测试的 Ct值小于 40,则判定豇豆重花叶病毒阳性 。

　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　生物学测定

　　E. 1 鉴别寄主

　　苋色藜(Chenopodium amaranticolor) 、菜 豆 (Phaseolus vulgaris) 品 种 Pinto 、豇 豆 (Vigna un- guiculata)品种 Blackeye Early Ramshorn。

　　E.2 方法

　　E.2. 1 研磨

　　样品按 1 ∶ 2 ~ 1 ∶ 10 (质量 ∶ 体积)加入 0. 01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7. 2)研磨 ,在研钵中研碎 。研碎后放入硅藻土(浓度为 0. 5%)并与病汁液混匀 。

　　E.2.2 接种

　　苋色藜接种苗龄 :4 片 ~ 6 片真叶 ; 菜豆(Phaseolusvulgaris) 品种 Pinto接种苗龄 : 子叶期或第 一片真叶出现 ;豇豆(Vignaunguiculata)品种 Blackeye Early Ramshorn接种苗龄 :子叶期或第一片真叶出现 。先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记 ,然后用手将样品汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面 , 用 蒸 馏 水 冲 洗 叶 表 面 。 做 好 标 签 , 置 于 隔 离 温 室 中(在 自 然 光 照 下 , 温 度 控 制 在20 ℃ ~ 30 ℃) ,及时观察记载寄主反应 。

　　E.3 鉴别寄主症状

　　苋色藜 :接种叶出现坏死斑症状 ,没有系统症状 。

　　菜豆(品种 Pinto) :接种叶出现坏死斑症状 ,没有系统症状 。

　　豇豆(品种 Blackeye Early Ramshorn) :接种叶出现褪绿斑症状 ,并且通常有红色坏死斑 ,有的主要叶脉变成红色和坏死 ,系统症状为花叶 、黄脉 、畸形 、坏死 。