GB/T 31804-2015 苹果锈果类病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31804—2015

　　苹果锈果类病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofApplescarskinviroid

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31804—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中国农业科学院植物保护研究所 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、青岛市农业科学研究院 、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :张永江、廖力、廖富荣、辛言言、邓丛良、李世访、马荣群、李明福、李桂芬、魏梅生、张成标、吴兴海 。

　　苹果锈果类病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于可能带有苹果锈果类病毒的植物材料的检测鉴定 。

　　2 仪器设备、用具及试剂

　　2. 1 仪器设备

　　电子分析天平(0. 001 g) 、垂直电泳槽 、小型离心机 、台式冷冻离心机 、普通 PCR 仪 、实时荧光 PCR仪 、电泳系统、pH 计 、凝胶成像系统 、4 ℃冰箱 、超净工作台 、-80 ℃超低温冰箱 、高压灭菌锅 、制冰机 、涡旋振荡器 、微波炉等 。

　　2.2 用具

　　可调移液器(2. 5 μL,10μL,20μL,100μL,1000μL) 、吸头 、离心管(0. 2 mL,0. 5 mL,1. 5 mL)及研钵等 。

　　2.3 试剂

　　除有特殊说明外 ,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂 。

　　R-PAGE试剂见附录 B;RT-PCR试剂见附录 C;实时荧光 RT-PCR试剂见附录 D。

　　3 检测方法

　　3. 1 R-PAGE测定

　　R-PAGE测定见附录 B。

　　3.2 RT-PCR检测

　　RT-PCR检测见附录 C。

　　3.3 实时荧光 RT-PCR检测

　　实时荧光 RT-PCR检测见附录 D。

　　4 结果判定

　　样品经第 3 章中任意两种不同原理的方法检测为阳性 , 即可判定样品带有 ASSVd。

　　GB/T 31804—2015

　　5 样品保存与结果记录

　　5. 1 样品保存

　　结果判定为阳性的样品应妥善保存 ,并作好登记和标记 , 以备复核用 。保存期满后 ,需经灭活处理 。

　　5.2 结果记录

　　完整的试验记录要包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,试验检测时间 ,地点 、方法和结果 ,并有试验人员的签字;R-PAGE测定应有银染色结果图片 ,RT-PCR检测应有电泳结果图片 ,实时荧光 RT-PCR 检测应有扩增曲线结果图片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　苹果锈果类病毒相关资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 苹果锈果类病毒基本信息

　　中文名称 :苹果锈果类病毒 。

　　学名 :Applescar skinviroid。

　　缩写 :ASSVd。

　　异名 :苹果斑纹类病毒(Dapple apple viroid) 、梨锈皮类病毒(Pearrusty skin viroid) 、Japanese pear fruitdimple viroid、Apple sabi-ka virus和 Manshu ringo sabi-kabyo。

　　分类地位 :马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae) ,苹果锈果类病毒属(Apscaviroid) 。

　　传播途径 :可通过嫁接 、病健根系自然接触及带毒繁殖材料传播 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据 ASSVd在寄主植物上的症状进行初步判定 ;根据 RNA 自然状态和变性后的不同结构分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差 异 进 行 往 复 双 向 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳(return-polyacrylamide gel electrophoresis,R-PAGE)检测 ;根据其核酸序列的特异性进行常规 PCR 或实时荧 光 PCR 检 测 , 通 过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定 。

　　A.2 寄主范围

　　仅限于蔷薇科(Rosaceae)的苹果属(Malus)和梨属(Pyrus)植物 。

　　很多苹果栽培品种能用作该类病毒的繁殖寄主 。

　　A.3 地理分布

　　世界 :美国 、印度 、日本 、加拿大 、英国 、意大利 、阿根廷及波兰等国家和地区 。

　　中国 :江苏 、安徽 、山东 、辽宁 、新疆和陕西等苹果主产区 。

　　A.4 基因组特征

　　ASSVd为一共价闭合环状的单链 RNA分子 ,长约 330 bp,分子质量为 1. 1×105 u。

　　A.5 症状

　　A.5. 1 锈果型症状 :先从幼果果顶部出现淡绿色水渍状斑块 ,而后向果梗扩展成木栓化锈斑与纵纹(见图 A. 1) 。

　　A.5.2 花脸型症状 :病果在着色前无明显变化 ,着色后果面表现红绿相间的花脸状(见图 A. 2) 。

　　A.5.3 锈果-花脸复合型症状 :呈现既有锈斑又有花脸的复合型症状(见图 A. 3) 。

　　图 A. 1

　　图 A.2

　　图 A.3

　　注: 图 A.2和图 A.3引自 http://www-intranet.angers.inra.fr/dossiers/virus/。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE)

　　B. 1 试剂与材料

　　B. 1. 1 研磨缓冲液

　　异硫氰酸胍(GITC) 4 mol/L;0. 5%十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠(C15 H28 NNaO3 ) ;0. 1% 曲 通-100(Triton- 100) ;氯化钠(NaCl)10 mmol/L;25 mmol/L柠檬酸钠(C6 H5Na3 O7 ) 缓冲液(pH 7. 0) ;2%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) ;共沉淀剂(Carrier RNA)15μg/mL。

　　B. 1.2 0. 5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(Na2EDTA · 2H2 O,pH 8. 0)

　　称取乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H2 O) 186. 1 g,溶 于 700 mL水 中 , 用 氢 氧 化 钠(NaOH) 调pH 至 8. 0,加水定容至 1 000 mL。

　　B. 1.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水

　　在 100 mL水中 ,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,室温过夜 ,121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B. 1.4 5×三羟基甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)电泳缓冲液

　　称取三羟基甲基氨基甲烷(Tris)27 g,硼酸(H3BO3 )13. 75 g,量取 0. 5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(Na2EDTA · 2H2 O,pH 8. 0)10 mL,加灭菌双蒸水 400 mL溶解 ,定容至 500 mL。

　　B. 1.5 30%胶贮液

　　称取丙烯酰胺(C3 H5NO)29 g,N ,N'-亚甲基双丙烯酰胺(C7 H10N2 O2 )1 g,加水定容至 100 mL,过滤除菌 ,4 ℃储存 。

　　B. 1.6 10%过硫酸胺溶液(现用现配)

　　称取 0. 1 g过硫酸铵[(NH4 ) 2S2 O8] ,加水定容至 1 mL。

　　B. 1.7 四甲基乙二胺(TEMED) 。

　　B. 1. 8 固定液

　　量取无水乙醇(C2 H5 OH)30mL及冰乙酸(C2 H4 O2 )3 mL,加水定容至 300 mL。

　　B. 1.9 染色液

　　称取硝酸银(AgNO3 )0. 6 g,加水溶解 ,定容至 300 mL。

　　B. 1. 10 显色液(现配现用)

　　在 300 mL水中 ,加入氢氧化钠(NaOH)3g及甲醛(HCHO)1 mL,混合均匀 。

　　B. 1. 11 终止液

　　称取碳酸钠(Na2CO3 )3. 7 g,加水溶解 ,定容至 300 mL。

　　注 : 电泳中用到的丙烯酰胺(C3 H5 NO)是神经毒剂 ,避免接触皮肤 ,操作时要带手套 。

　　B. 1. 12 纳米磁珠 。

　　B.2 试验步骤

　　B.2. 1 样品 RNA 的提取

　　取 0. 1 g样品,加入 2. 5 mL 的研磨缓冲液 ,充分研磨后移入 5 mL 的离心管 ,4 ℃ , 5 000 r/min,离

　　心 5 min, 留上清液备用 。取 2 mg纳米磁珠于 1. 5 mL 的离心管中 ,离心管置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,弃上清液 。 向含有纳米磁珠的离心管中加入 800 μL备用上清液 ,用枪反复吹打至没有明显结块 。 再向离心管中加入 400μL无水乙醇 ,颠倒混匀 ,室温放置 5 min~ 10min,放置期间颠倒混匀几次 。将离心管瞬离后 ,置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,弃上清液 。 向离心管中加入 150 μL70%的乙醇 ,用枪吹打混匀 ,将离心管置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,弃上清液 ,并重复 2 次 ~ 5 次 , 至上清液没有明显颜色 。将离心管瞬离后 ,置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,完全弃除上清液 。 向离心管中加入约50μL无 RNase的水 ,用枪反复吹打重新悬浮纳米磁珠 ,室温放置 2 min~ 5 min。将离心管置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,将含有 RNA 的上清液转移至一无 RNA 酶污染的离心管中 , -80 ℃冰箱保存备用 。

　　注 : 或者选择市售商品化 RNA提取试剂盒完成 RNA 的提取 。

　　B.2.2 电泳

　　B.2.2. 1 凝胶制备

　　聚丙烯酰胺凝胶浓度为 5% 。在小烧杯中按顺序加入双蒸水 18. 77mL,30%凝胶储备液 5 mL,5× TBE缓冲液 6 mL,TEMED 20 μL,10%过硫酸铵(现配现用)210μL,充分混匀后灌胶 。然后插入样品梳 。待胶完全凝聚后在电泳槽内加入 1×TBE 电级缓冲液 ,然后轻轻拔掉梳子 。

　　B.2.2.2 第一向电泳

　　常温下进 行 , 电 泳 缓 冲 液 为 1× TBE, 电 泳 方 向 从 负 极 到 正 极 , 恒 压 200 V。 上 样 量 为 6 μL~ 10 μL。 当二甲苯腈示踪染料迁移到离凝胶底部 3 cm~4 cm 处停止电泳 。

　　B.2.2.3 第二向电泳

　　将正向电泳缓冲液倒出 ,然后把电泳槽放到 70 ℃ ~ 80 ℃的烘箱中预加热,样品变性 30min。 同时将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到 80℃ 。倒入电泳槽中 ,变换电极进行反向电泳 。 当二甲苯腈示踪染料迁移到凝胶板顶部时 ,停止电泳 ,进行凝胶染色 。

　　B.2.3 染色

　　B.2.3. 1 固定

　　将凝胶浸泡在盛有 300 mL 固定液的容器中 ,轻缓振荡 20 min后 ,倒掉固定液 ,用蒸馏水洗胶2次 ,每次 1 min。

　　B.2.3.2 染色

　　向容器中加入 300 mL染色 液 , 轻 缓 振 荡 20 min后 , 倒 出 染 色 液 。 用 蒸 馏 水 冲 洗 胶 板 , 反 复 冲 洗4次 。

　　B.2.3.3 显色

　　加入 300 mL核酸显色液 ,轻缓振荡 ,直至显现清晰的核酸带 ,然后用自来水冲洗 ,反复冲洗 4次 。

　　B.2.3.4 终止

　　将胶板放入 300 mL终止液中终止反应 。

　　B.3 结果判定

　　在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带 ,与上部寄主核酸带之间有一定距离 ,二者可明显分开 。 以电泳时载入的阴阳性样品作为对照 ,进行结果判定 :满足前面条件 ,并出现与阳性对照一致的条带则判定为阳性 ;没有相应条带出现为阴性 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测方法

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 RNA提取试剂

　　研磨缓冲液同 B. 1. 1。

　　C. 1.2 5× TBE 电泳缓冲液

　　同 B. 1. 4。

　　C.2 引物

　　上游引物 ASSVdF:5'-CCGGATCCGGTAAACACCGTGCGGTCCC-3'

　　下游引物 ASSVdR:5'-CCGGATCCGGGAAACACCTATTGTGTTT-3'

　　扩增产物长度为 330 bp。

　　C.3 核酸提取

　　方法同 B. 2. 1。

　　C.4 cDNA合成

　　0. 2 mL PCR管中加入 总 RNA 1 μL, dNTPs(10 mmol/L) 1 μL, DEPC处 理 水 10 μL, ASSVdR (20 μmol/L)2μL,70℃保温 5 min,冰上放置 5 min;再加入 5×缓冲液 4 μL, RNasin(40U/μL)1μL, M-MLV(200U/μL)1μL,42 ℃保温 1 h,得到 cDNA后用作 PCR 的模板 。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　C.5 PCR扩增

　　0. 2 mL PCR管中加入 10×PCR缓冲液(含 Mg2+ )2μL,dNTPs(10 mmol/L) 0. 6 μL,ASSVdF及ASSVdR(均为 20 μmol/L)各 0. 5 μL,2 U/μLTaq酶 1 μL,模板 2 μL和 DEPC处理水 13. 4 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,20个循环;72 ℃ 7 min。

　　C.6 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子

　　量标记 ,进行电泳分析 。 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性 DNA条带 ,并拍摄记录 。

　　C.7 结果判定

　　C.7. 1 阳性对照在 330 bp左右处有扩增片段 , 阴性对照和空白对照无特异性扩增 ,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 ,可判定为阳性 。

　　C.7.2 阳性对照在 330 bp左右处有扩增片段 , 阴性对照 、空白对照及待测样品无特异性扩增 , 可判定结果为阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测方法

　　D. 1 主要试剂

　　研磨缓冲液同 B. 1. 1。

　　TaqMan One-step RT-PCR Mixture。

　　D.2 引物探针

　　上游引物 ASSVdF2-144:5'-GTTCCGCTGTGGGTTCGCCTAC-3'

　　下游引物 ASSVdR2-246:5'-CACCCGGAGTCCGCTCGACTAG-3'

　　探针 ASSVdProbe-196:5'-FAM-CGCTGCGCTGCCACCTACTCT-TAMRA-3'

　　D.3 核酸提取

　　方法同 B. 2. 1。

　　D.4 实时荧光 RT-PCR反应

　　反应体系 :0. 2mL 离 心 管 中 加 入 2× One Step RT-PCR 缓 冲 液 Ⅲ 10 μL, Ex Taq HS(5U/μL) 0. 4 μL,PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅱ 0. 4 μL, ASSVdF2-144(10 μmol/L)0. 4 μL, ASSVdR2-246 (10 μmol/L) 0. 4 μL,ASSVdProbe-196(10μmol/L)0. 6 μL,ROX ReferenceDye Ⅱ 0. 4 μL,模板 RNA 2 μL,补 DEPC-H2 O 至 20 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :42 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s;95 ℃ 15 s,62 ℃ 60 s,共 40个循环 。

　　注 : PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整 ,也可采用商业化试剂盒 。

　　D.5 结果判定

　　在空白对照及阴性 对 照 无 Ct值 且 无 扩 增 曲 线 、阳 性 对 照 Ct值 ≤30并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条件下 :

　　a) 待测样品的 Ct值 ≥40时 ,判定 ASSVd阴性 。

　　b) 待测样品的 Ct值 ≤35时 ,判定 ASSVd阳性 。

　　c) 待测样品的 35≤Ct值 ≤40时 ,应重新进行测试 ; 如果重新测试的 Ct值 ≥40时 ,判定 ASSVd阴性 ;如果重新测试的 Ct值<40,则判定 ASSVd阳性 。