GB/T 31803-2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31803—2015

　　棉花皱叶病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofCotton leaf crumplevirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31803—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、浙江大学 、浙江出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :张永江 、雷荣 、沈建国 、周雪平 、鲁洁 、张明哲 、李桂芬 、朱水芳 。

　　棉花皱叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了棉花皱叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法 。

　　本标准适用于可能携带棉花皱叶病毒的活体寄主植物叶片组织的检疫鉴定 。

　　2 仪器设备、用具和试剂

　　2. 1 仪器设备

　　电子分析天平(0. 001 g) 、小型离心机 、台式冷冻离心机 、恒温水浴锅 、酶标仪 、普通 PCR 仪 、实时荧光 PCR仪 、电泳系统、pH 计 、凝胶成像系统 、4 ℃冰箱 、超净工作台 、-80 ℃超低温冰箱 、高压灭菌锅 、制冰机 、涡旋振荡器 、微波炉等 。

　　2.2 用具

　　可调移液 器 (2. 5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL) 、吸 头 、离 心 管 、Eppendorf 管 (0. 2 mL、 0. 5 mL、1. 5 mL)和研钵等 。

　　2.3 试剂

　　除有特殊说明外 ,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 。

　　DAS-ELISA、常规 PCR及实时荧光 PCR检测试剂分别见附录 B、附录 C及附录 D。

　　3 检疫鉴定方法

　　3. 1 DAS-ELISA检测

　　DAS-ELISA检测见附录 B。

　　3.2 常规 PCR检测

　　常规 PCR检测见附录 C。

　　3.3 实时荧光 PCR检测

　　实时荧光 PCR检测见附录 D。

　　4 结果判断

　　3. 1、3. 2 及 3. 3 中两种不同原理的检测方法的结果为阳性 , 即可判定样品为 CLCrV 阳性 。 一般是DAS-ELISA检测为阳性后 ,常规 PCR或实时荧光 PCR检测结果为阳性即可判断样品为 CLCrV 阳性 。

　　GB/T 31803—2015

　　5 样品保存与记录结果

　　5. 1 样品保存

　　结果判定为阳性的样品应妥善保存 ,并做好登记和标记 , 以备复核用 。保存期满后 ,需经灭活处理 。

　　5.2 结果记录

　　完整的实验记录要包括 :样品的来源 、种类 、时间 、实验检测时间 、地点 、方法和结果 ,并有实验人员的签字;DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据 ,PCR检测需有电泳结果图片 ,实时荧光 PCR检测需有扩增曲线结果图片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　棉花皱叶病毒背景资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 棉花皱叶病毒基本信息

　　中文名 :棉花皱叶病毒 。

　　学名 :Cotton leafcrumplevirus。

　　缩写 :CLCrV。

　　分类地位 :双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus) 。

　　传播途径 :烟粉虱(Bemisiatabaci)及苗木嫁接传播 ,机械接触 、菟丝子(Cuscuta subinclusa) 、种子及花粉不传播 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据棉花皱叶病毒与抗体之间的特异性反应 ,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测 ;根据该病毒 DNA保守区的特异性进行常规 PCR 或实时荧光 PCR检测 ,通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定 。

　　A.2 寄主范围

　　包括棉属(Gossypium) 、苘麻属(Abutilon) 、蜀葵属(Althaea) 、木槿属(Hibiscus) 、锦葵属(Malva) 、栗豆树属(Castanospermum) 、大豆属(Glycine) 、菜豆属(Phaseolus)及巢菜属(Vicia)的一些植物 。

　　A.3 分布

　　该病毒主要分布在印度 、墨西哥 、美国 、危地马拉及中东地区 。

　　A.4 病害症状

　　该病毒侵染棉花造成叶中脉组织增生 、叶脉坏死或脉明 , 叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点 ,有时形成分散的泡斑 ;苞叶和花常畸形 ; 叶柄弯曲 , 叶片向下卷曲并有明显的花叶 。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体双生 ,无包膜 ,直径为 17 nm~ 20 nm ,二聚体长 30 nm~ 32 nm。

　　A.6 基因组特征

　　该病毒具有 Begomovirus病毒典型的基因组 ,含有 2条大小均为 2. 5 kb~ 3. 0 kb的单链闭合环状DNA分子 , 即 DNA-A 和 DNA-B;二者是棉 花 皱 叶 系 统 感 染 必 需 的 。 A 和 B 共 同 区(commen rigon, CR)的序列同源性相对较低 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B. 1 试剂耗材

　　B. 1. 1 酶联板的要求

　　使用质量有保证厂商生产的酶联板 。

　　B. 1.2 包被抗体

　　特异性的棉花皱叶病毒抗体 。

　　B. 1.3 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的棉花皱叶病毒抗体 。

　　B. 1.4 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP)

　　B. 1.5 10×PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl)80 g、磷酸二氢钾(KH2PO4 )2 g、磷酸氢二钠(Na2 HPO4 )11. 5 g、氯化钾(KCl)2 g、吐温-20(Tween-20)5 mL,用盐酸(HCl)调 pH 至 7. 4,并定容至 1 000 mL,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1.6 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 )1. 3 g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW 24 000~ 40 000,PVP)20 g、叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g、吐温-20(Tween-20)20mL,溶于 800mL 的 1×PBST 中 ,用盐酸(HCl)调 pH 至 7. 4,加 1×PBST定容至 1 000 mL,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1.7 包被抗体缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 )1. 59 g、碳酸氢钠(NaHCO3 )2. 93 g、叠氮化钠(NaN3 )0. 2 g,用盐酸(HCl) 调 pH至 9. 6,加水定容至 1 000 mL,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1. 8 洗涤缓冲液

　　将 1×PBST缓冲液用 HCl调 pH 至 7. 4,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1.9 酶标抗体缓冲液(pH 7. 4)

　　1×PBST缓冲 液 800 mL、牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 2 g、聚 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 (MW 24 000~ 40 000, PVP)20 g、叠氮化钠(NaN3 )0. 2 g,用 1×PBST定容至 1 000 mL,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1. 10 底物(pNPP)缓冲液(pH 9. 8)

　　二乙醇胺(C4 H11NO2 )97 mL、叠氮化钠(NaN3 )0. 2 g,用盐酸(HCl) 调 pH 至 9. 8,用蒸馏水定容至

　　1 000 mL,4 ℃条件下贮存 。

　　B. 1. 11 底物(pNPP)溶液

　　将 4-硝基酚磷酸钠盐(pNPP)100mg溶解于 pNPP底物缓冲液 100 mL 中 ,现配现用 。

　　B. 1. 12 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH)40 g,用蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B.2 样品制备

　　取植物叶片组织 0. 2 g~ 1. 0 g,按 1 ∶ 5(g/mL) 加入样品提取缓冲液 ,用研钵研磨样品 ,4 000 g 离心 5 min后吸取上清液待用 。

　　B.3 操作步骤

　　B.3. 1 包被抗体

　　根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上 ,包括 2个阳性对照孔 、2个阴性对照孔 、2个空白对照孔和多个待检测样品孔 ,每个样品重复 2 次 ;每孔加入 100 μL的包被抗体溶液 ,封口膜包好 ,37 ℃孵育2 h~4 h(或 4 ℃冰箱过夜) 。

　　B.3.2 加样

　　将酶联板孔中溶液控干 ,用 PBST洗涤 3 次 ,每次 3 min,然后在滤纸上扣干 ;将 100μL待测样品溶液加入到待检测孔中 ,对照 孔 中 也 各 加 入 100 μL相 应 的 对 照 。 封 口 膜 包 好 , 37 ℃孵 育 2 h~ 3 h(或4 ℃冰箱过夜) 。

　　B.3.3 加酶标抗体

　　洗涤 ,步骤同 B. 3. 2;用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体 ,每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 ,封口膜包好 ,37 ℃孵育 2 h~4 h。

　　B.3.4 加底物

　　洗涤 ,步骤同 B. 3. 2;每孔加入 100μL底物溶液 ,室温孵育 0. 5 h~ 2 h。必要时每孔加入 50μL的终止液终止反应 。

　　B.3.5 读数

　　酶标仪 405 nm 波长下检测各孔的吸收值并记录 。

　　B.4 结果判定

　　B.4. 1 质量控制要求

　　空白对照孔和阴性对照孔 OD405值 <0. 15; 阳 性 对 照 OD405 值/阴 性 对 照 OD405 值 >2; 同 一 样 品 的OD405值应基本一致 。

　　B.4.2 结果判定

　　若满足不了 B. 4. 1 的质量要求 ,则不能进行结果判定 。

　　在满足了 B. 4. 1 的质量要求后 ,则按如下原则作出判定 :

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显大于 2,结果判定为阳性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重做一次或者用 3. 2 或 3. 3 方法进行验证 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显小于 2,判为阴性 。

　　附 录 C (规范性附录)常规 PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)DNA提取缓冲液

　　十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)4 g,乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H2 O,0. 5 mol/L)8 mL,氯化钠(NaCl)16. 4 g, 1 mol/L Tris-HCl20 mL,巯基乙醇(C2 H6 OS)4 mL,加蒸馏水定容至 200 mL,调pH 至 8. 0,121 ℃高压灭菌 30 min。

　　C. 1.2 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)沉淀液

　　十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) 10 g,氯化钠(NaCl)4. 1 g,加 水 定 容 至 100 mL, 121 ℃高 压 灭 菌30 min。

　　C. 1.3 高盐 TE 缓冲液

　　乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H2 O,0. 5 mol/L)0. 02 mL,氯化钠(NaCl)5. 85 g, 1 mol/L Tris- HCl1 mL,加水定容至 100 mL,调 pH 至 8. 0,121 ℃高压灭菌 30 min。

　　C. 1.4 50× TAE 电泳缓冲液(pH 8. 0)

　　三羟甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 242 g、冰 乙 酸 (C2 H4 O2 ) 57. 1 mL、乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na2EDTA · 2H2 O)37. 2 g,蒸馏水定容至 1 000 mL,用时稀释至 1×TAE。

　　C.2 引物

　　上游引物 CLCrV-Bf:5’-CTCCTATCCTAATCTGGGCAAGACTG-3’;

　　下游引物 CLCrV-Br:5’-CGGTCCAAGAATGTATCAAGAGTAGTTGT-3’;

　　用于扩增棉花皱叶病毒 DNA-B组分保守区域长度约为 636bp的片段 。

　　C.3 核酸提取

　　分别称取阴性(健康) 对 照 、阳 性(染 病) 对 照 及 植 物 叶 片 组 织 0. 5 g 于 液 氮 中 研 磨 , 加 入 1. 5 mL 65 ℃预热的巯基乙醇/CTAB DNA抽提液 ,混匀后转入 2 mL离心管中 , 于 65 ℃温浴 1 h,不时混匀 ;用等体积的三氯甲烷/异 戊 醇(24 ∶ 1) 抽 提 , 室 温 下 10 000 g 离 心 10 min; 回 收 上 清 , 加 入 等 体 积 的CTAB沉淀液 ,颠倒混匀 ,于 65 ℃温浴 1 h;10 000g 离心 5 min,移出上清 ,用 1. 5 mL高盐 TE缓冲液重悬沉淀 ,加 2倍体积无水乙醇沉淀核酸;12 000g 离心 15 min,70%乙醇洗涤;37℃干燥后溶于 100 μL双蒸水中 , -20 ℃保存备用 。

　　注 : 或者按照等效 DNA提取试剂盒进行操作 。

　　C.4 PCR扩增

　　0. 2 mL PCR管中加入 10×PCR buffer(含 Mg2+ )2μL,dNTPs(10 mmol/L)0. 6 μL,CLCrV-Bf及CLCrV-Br(均为 10 μmol/L)各 0. 5 μL,2 U/μLTaq酶 1 μL,模板 2 μL和 ddH2 O 13. 4 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应条件 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 8 min。

　　C.5 琼脂糖凝胶电泳检测

　　制备 1%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子量标记 ,进行电泳分析 。 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性 DNA条带 ,并拍摄记录 。

　　C.6 结果判定

　　如果阳性对照出现约 636bp的条带 ,检测样品 、阴性对照和空白对照未出现特异性条带 ,可判定样品为 CLCrV 阴性 。

　　如果阳性对照及检测样品出现约 636bp的条带 , 阴性对照和空白对照未出现特异性条带 , 可判定样品为 CLCrV 阳性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 PCR检测

　　D. 1 主要试剂

　　DNA提取试剂见 C. 1。

　　TaqMan PCR Mixture。

　　D.2 引物和探针

　　上游引物 CLCrV F1-579:5’-ACAGCCACTGAATGTGAAAAGAGAA-3’;

　　下游引物 CLCrV R1-725:5’-GTTCAGTCTTGCCCAGATTAGGATA-3’;

　　探针 CLCrV Probe:5’-FAM-GGAATTTACAATGGCCCACAACACAG-TAMRA-3’。

　　D.3 核酸提取

　　操作方法见 C. 3。

　　D.4 实时荧光 PCR反应

　　反应体 系 : 0. 2 mL 离 心 管 中 加 入 TaqMan PCR Mixture 10 μL, CLCrV-F1-579( 10 μmol/L) 0. 4 μL,CLCrV-R1-725(10μmol/L)0. 4 μL,CLCrV-Probe(10μmol/L)0. 4 μL,DNA模板 2 μL,补水至20 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :95 ℃ 10min;95 ℃ 15 s,62 ℃ 60 s,共 40个循环 。

　　注 : PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整 ,也可采用等效试剂盒 。

　　D.5 结果判定

　　在空白对照及阴性 对 照 无 Ct值 且 无 扩 增 曲 线 、阳 性 对 照 Ct值 ≤30并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条件下 :

　　— 待测样品的 Ct值 ≥40时 ,判定 CLCrV 阴性 ;

　　— 待测样品的 Ct值 ≤35时 ,判定 CLCrV 阳性 ;

　　— 待测样品的 35≤Ct值 ≤40时 ,应重新进行测试 ;如果重新测试的 Ct值 ≥40时 ,判定 CLCrV阴性 ;如果重新测试的 Ct值<40,且分离曲线明显时 ,则判定 CLCrV 阳性 。