GB/T 31802-2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31802—2015

　　番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofTomatospottedwiltvirus

　　2015-07-03发布 2015-11-20实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31802—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :李桂芬 、鲁洁 、马洁 、孔君 、王秀芬 、杜智欣 、张永江 、魏梅生 。

　　番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了植物检疫中番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于植物种子 、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 仪器设备及试剂

　　3. 1 仪器设备

　　酶标仪 、天平(感量 1/10 000 g)、pH 计 、微量榨汁机 、PCR 仪 、实时荧光 PCR 仪 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 、隔离温室 、恒温水浴 、低温冰箱等 。

　　微量移液器(2 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL) 、酶 联 板 、研 钵 、离 心 管 、花 盆 、灭 菌土等 。

　　3.2 试剂

　　酶联免疫吸附测定 试 剂 见 附 录 B, RT-PCR 检 测 试 剂 见 附 录 C, 实 时 荧 光 RT-PCR 检 测 试 剂 见附录 D, 生物学测定试剂参见附录 E。

　　4 抽样与样品制备

　　4. 1 抽样

　　抽样按照 SN/T 2122的规定进行 。

　　4.2 种子样品制备

　　将种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中 ,于 25 ℃生长并进行症状观察 。待长出 3 片 ~ 4片叶后 ,将表现症状的植株编号 ,未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号 。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实时荧光 RT-PCR检测及生物学测定 。

　　4.3 苗木样品制备

　　将苗木种植于隔离温室中 ,于 25℃生长并进行症状观察 。有症状的苗木单独检测 。没有症状的分组检测 ,分组方法和检测方法同 4. 2。

　　GB/T 31802—2015

　　5 检疫鉴定方法

　　5. 1 酶联免疫吸附测定

　　见附录 B。

　　5.2 RT-PCR检测

　　见附录 C。

　　5.3 实时荧光 RT-PCR检测

　　见附录 D。

　　5.4 生物学测定

　　参见附录 E。

　　6 结果判定

　　样品经酶联免疫吸附测定为阴性或 RT-PCR检测为阴性或实时荧光 RT-PCR检测为阴性 ,判断待检样品不携带番茄斑萎病毒 。

　　样品经酶联免疫吸附测定为阳性 , RT-PCR 检测或实时荧光 RT-PCR 检测为阳性 , 即可判断待检样品携带番茄斑萎病毒 。必要时可进行生物学测定 。

　　7 样品保存与结果记录

　　7. 1 样品保存

　　经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存 , 种子可在 4 ℃保存 1 年 ,病株可在-20 ℃或 -80℃冰箱中保存 1 年 ,做好标记和登记工作 。

　　7.2 结果记录

　　完整的记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并应有经手人和实验人员的签字 。 酶 联 测 定 应 有 酶 联 板 反 应 的 原 始 数 据 , RT-PCR 检 测 需 有 电 泳 结 果 图 片 , 实 时 荧 光RT-PCR应有反应原始数据 ,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　番茄斑萎病毒相关资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 基本信息

　　番茄斑萎病毒学名 :Tomato spotted wiltvirus,缩写 :TSWV。

　　分类地位 :布尼亚病毒科(Bunyaviridae) ,番茄斑萎病毒属(Tospovirus) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据番茄斑萎病毒与抗体之间的特异性反应 ,对植物样品进行 ELISA 检测 ;根据该病毒核酸的序列进行 PCR特异性检测 ,通过电泳条带大小进行结果判定 ;根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和荧光探针 ,通过检测的荧光信号进行结果判定 。条件允许的情况下 ,根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状特点 ,进行生物学检测 。

　　A.2 寄主范围

　　番茄斑萎病毒寄主范围非常广泛 ,包括温带 、亚热带和热带的 80多个科近千种双子叶和单子叶植物 ,可引起许多重要的园 艺 植 物 和 农 作 物 的 严 重 病 害 , 如 花 生 、莴 苣 、番 木 瓜 、豌 豆 、烟 草 、甜 椒 、番 茄 、秋海棠 、菊花 、大丽花等 。

　　A.3 病害症状

　　番茄斑萎病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同 , 常见症状为叶片上产生黄色或褐色的环斑或线纹斑 ,有的叶片上形成坏死斑 ,在叶柄和茎秆上产生黑色条纹 。发病植株通常矮化或顶枯 ,有的萎蔫而最终死亡 。

　　A.4 分布

　　番茄斑萎病毒是一种 分 布 广 泛 且 具 有 经 济 重 要 性 的 植 物 病 毒 , 分 布 于 欧 洲 和 地 中 海 地 区 、亚 洲 、非洲 、北美洲 、中美洲和加勒比海 、南美洲和大洋洲 。

　　A.5 传播方式

　　番茄斑萎病毒容易通过介体 — 蓟马以持久性方式进行自然传播 ,机械接种和嫁接也可传播 ,还可以随寄主植物种子 、苗木等进行国际间传播 ,特别是这些寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒 。

　　A.6 粒体形态

　　病毒粒子球形 ,表面有一层膜包裹 ,膜外面由厚 5nm、几乎连续的突起层组成 ,粒体直径 80nm~120nm。

　　A.7 基因组特征

　　三分体基因组 ,基因组总长为 16 600 nt。ssRNA-L长 8 897 nt,为负义 ;ssRNA-M 长 4 821 nt, 为双义 ;ssRNA-S长 2 916 nt,为双义 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的番茄斑萎病毒抗体 。

　　B. 1.2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的特异性的番茄斑萎病毒抗体 。

　　B. 1.3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP)

　　B. 1.4 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 20 g

　　蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.5 PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　吐温-20(Tween-20) 0. 5 mL

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　蒸馏水定容至 1 L。

　　B. 1.6 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　PBST 1 L

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　PVP(MW24000~40000) 20. 0 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 20 g

　　4 ℃储存 。

　　B. 1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH 7. 4)

　　PVP(MW24000~40000) 20. 0 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　4 ℃储存 。

　　B. 1. 8 底物缓冲液(pH 9. 8)

　　二乙醇胺 97 mL

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,用盐酸调 pH 至 9. 8,然后用蒸馏水定容至 1 L。4 ℃储存 。

　　B.2 试验步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体 ,每孔加 100 μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好 ,放在 37 ℃孵育 2 h 。 清空孔中溶液 ,用 PBST 加满各孔 ,3 min后倒掉孔中溶液 ,在吸水纸上拍干 。再重复 2 次上述洗板过程 。

　　B.2.2 样品制备和加样

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液 ,在研钵中研磨 ,2 000 r/min离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。 阴性对照 、阳性对照作相应处理或按说明书进行 。 向酶联板中加入制备好的检测样品 、阴性对照 、阳性对照 ,100μL/孔 ,酶联板加盖或用保鲜膜包好 ,放在 4 ℃孵育过夜 。酶联板用自来水彻底冲洗 ,再用 PBST洗涤 3 次 ,每次 3 min。

　　B.2.3 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液 ,按说明将酶标抗体稀释至工作浓度 ,加入到酶联板中 , 100 μL/孔 ,酶联板加盖或用保鲜膜包好 , 放 在 37 ℃孵 育 4 h。 酶 联 板 用 自 来 水 彻 底 冲 洗 , 再 用 PBST 洗 涤 3 次 , 每 次3 min。

　　B.2.4 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,100 μL/孔加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B.2.5 读数

　　在不同的时间内如 30 min、60 min、90 min、120 min或更长时间 ,用酶联仪在 405 nm 处读 OD值 。

　　B.3 结果判定

　　对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照孔及阳性对照孔) 应该在质量控制范围内 , 即 :缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 ; 阳性对照 OD405值 / 阴性对照 OD405值 >5;同一样品的重复性基本一致 。

　　在满足了上述的质量要求后 ,结果原则上可判断如下 :样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显 >2,判为阳性 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值在 2左右时 ,判为可疑样品,需重新做一次 ,或用其他方法加以验证 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显<2,判为阴性 。

　　若满足不了上述的质量要求 ,则不能进行结果判断 。

　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 试剂

　　核酸提取试剂为 TRIzol试剂 。

　　C. 1.2 TAE缓冲液

　　40 mmol/LTris-HAc;

　　1 mmol/LEDTA, pH 8. 0。

　　C. 1.3 6×加样缓冲液

　　0. 25%溴酚蓝 ;

　　40%(质量分数)蔗糖水溶液 。

　　C. 1.4 引物序列

　　所扩增的序列片段来自 TSWV 的 NP基因(GeneBank Accession No. JQ692106. 1) ,长度为 441bp。引物序列如下 :

　　TSWV-F: 5'-AGGATTGGAGCCACTGAC-3' (位置 226 nt~ 243nt)

　　TSWV-R: 5'-GCTGGAGCTGAGTATAGCAG-3' (位置 647 nt~ 666nt)

　　C.2 试验步骤

　　C.2. 1 总 RNA提取

　　取 0. 1 g样品,液氮研磨成粉末状 ,加入 1 mL TRIzol试剂 ,混匀 ,倒入 1. 5 mL离心管中 。在 4 ℃以12 000 r/min离心 5 min,将上清液移入一新离心管中 。加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,剧烈振荡 15 s,在 4 ℃以 12 000 r/min离心 15 min。小心吸取上层无色水相到新离心管中 ,加入等体积预冷异丙醇 ,颠倒混匀 , -20 ℃静置 10min。在 4 ℃以 12000 r/min离心 10min,倒掉上清液 ,保留沉淀 。加入 1 mL 70%预冷乙醇 ,悬浮沉淀 ,在 4 ℃ 以 12 000 r/min离心 10 min。倒掉乙醇 ,待沉淀充分干燥后 ,加入 20 μL DEPC水溶解沉淀 ,存于 -80℃备用 。

　　C.2.2 反转录反应

　　按表 C. 1 配制反转 录 反 应 体 系 20 μL 。 反 转 录 反 应 条 件 为 : 25 ℃ 10 min, 50 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 min。

　　表 C. 1 反转录反应体系

　　C.2.3 PCR扩增

　　按表 C. 2 配制 PCR反应体系 20μL。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时 以 含 TSWV 的 植 物 材 料 的 DNA 或 含 有 TSWV 目 标 片 段 的 质 粒 作 为 阳 性 对照 , 以健康植物材料作为阴性对照 , 以水代替 DNA模板作为空白对照 。

　　PCR反应条件 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 5 min延伸 。

　　表 C.2 PCR反应体系

　　C.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测

　　用 1×TAE配制 1%琼脂糖凝胶 ,加热溶化后冷却至 55 ℃左右 。将凝胶倒入凝胶槽中 ,插上样品梳子 。冷却凝固后拔掉梳子 ,在电泳槽内加入 1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约 1 mm。

　　将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔 , 同时设计 PCR 的阴性对照和阳性对照 ,并加入 DNA 相对分子质量标准物 。接通电源 , 以 3 V/cm~ 5 V/cm 电场强度进行电泳 ,0. 5 h后观察结果 。

　　电泳结束后 ,将凝胶放入 0. 5 μg/mL 的溴化乙锭(EB)染色液中染色 10min~ 15min。将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察 ,记录结果 。

　　C.3 结果判定

　　如果阳性对照出现约 441 bp的条带 ,检测样品 、阴性对照和空白对照未出现 条 带 , 可 判 定 样 品 为阴性 。

　　如果阳性对照及检测样品出现约 441 bp的条带 , 阴性对照和空白对照未出现条带 , 可判定样品为阳性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测方法

　　D. 1 试剂

　　D. 1. 1 RNA提取试剂

　　TRIzol试剂 、三氯甲烷 、异丙醇 、70%乙醇 。

　　D. 1.2 试剂

　　Taq Man One-Step RT-PCR Mixture。

　　D. 1.3 引物和探针

　　所扩增的序列片段来自 TSWV 的 NP基因(GeneBank Accession No. JQ692106. 1) ,引物和探针序列如下 :

　　引物序列 :TSWV-F: 5'-CTCTTG ATG ATG CAA AGT CTG TGA-3' (位置 398 nt~421 nt)

　　TSWV-R: 5'-TCT CAA AGC TAT CAA CTGAAG CAA TAA-3' (位置 455 nt~481nt)

　　探针序列 :TSWV-P: 5'-FAM-AGG TAA GCT ACC TCC CAG CAT TAT GGC AAG-BHQ1-3' (位置 424 nt~453 nt)

　　D.2 试验步骤

　　D.2. 1 总 RNA提取

　　操作方法见 C. 2. 1。

　　D.2.2 实时荧光 RT-PCR反应

　　实时荧光 RT-PCR反应体系见表 D. 1。检测时以含 TSWV 的植物材料的 RNA 作为阳性对照 ; 以健康植物材料作为阴性对照 ; 以水代替 RNA模板作为空白对照 。

　　表 D. 1 实时荧光 RT-PCR反应体系

　　反应条件 :48 ℃ 30min,95℃ 10min;然后 95℃ 15 s,60℃ 1 min,共 40个循环 。点击运行 ,进行PCR反应 ,保存文件 ,打开分析软件 ,仪器自动分析试验结果 , 给出 ΔRn (荧光信号增加值) 与循环数之间关系的图像 。

　　D.3 结果判定

　　在阳性对照 Ct值小于 30,水空白对照 Ct值大于或等于 40 的条件下(若不满足该两项条件 ,此次检测无效 ,应重做荧光 PCR扩增) :

　　a) 待测样品的 Ct值等于 40时 ,则判定样品为阴性 。

　　b) 待测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定样品为阳性 。

　　c) 待测样品的 Ct值大于 35而小于 40时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值等于 40时 ,则判定样品为阴性 。如果重新测试的 Ct值小于 40时 ,则判定样品为阳性 。

　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　生物学测定

　　E. 1 试材

　　E. 1. 1 鉴别寄主

　　黄瓜(Cucumissativus) 、矮牵牛(Petunia hybrida) 、克利夫兰烟(Nicotianan clevelandii) 、心叶烟(Nicotianaglutinosa) 、普通烟(Nicotianatabacum) 、黄花烟(Nicotianarustica) 、曼陀罗(Daturastra- monium) 、番茄(Lycopersiconesculentum) 、本生烟(Nicotianabenthamiana) 。

　　E. 1.2 试剂

　　接种缓冲液 :0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 0) , 含 0. 001 mol/L EDTA(乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠) , 0. 005 mol/LDIECA(二乙基二硫代氨基甲酸钠) ,0. 1%巯基乙醇(使用时加入) 。

　　E.2 方法

　　E.2. 1 机械接种方法

　　E.2. 1. 1 研磨

　　病样加 1 ∶ 5(质量 ∶ 体积) 的磷酸盐缓冲液 ,在研钵中研碎 。研碎后放入硅藻土或金刚砂 ,浓度为0. 5% ,与病汁液混匀 。

　　E.2. 1.2 接种

　　用手将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面 。

　　E.2. 1.3 冲洗

　　用自来水冲洗叶表面 。

　　E.2.2 蓟马自然传播

　　在具有隔离的条件下 ,可采用蓟马进行自然传播 。

　　E.2.3 观察

　　每天观察记载寄主反应 ,连续观察 1个月 。

　　E.3 鉴别寄主症状

　　E.3. 1 黄瓜 :子叶上表现有坏死中心的褪绿斑 ,无系统侵染 。

　　E.3.2 矮牵牛 :局部坏死斑 。

　　E.3.3 克利夫兰烟 、心叶烟 、普通烟 、黄花烟 :局部坏死斑 ,系统坏死症状和叶畸形 。

　　E.3.4 曼陀罗 :接种叶褪绿斑和坏死斑 ,系统花叶和斑驳 。

　　E.3.5 番茄 :接种叶褪绿到坏死斑和环 ,系统花叶 、系统褪绿和坏死斑 。

　　E.3.6 本生烟 :系统花叶症状 ,新生叶扭曲 、畸形 。