GB/T 31801-2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31801—2015

　　丁香疫霉菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPhytophthorasyringae Kleb.

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31801—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :杜洪忠 、罗加凤 、吴品珊 、严进 。

　　丁香疫霉菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了丁香疫霉菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于针对丁香疫霉菌寄主的苗木 、枝条 、枝叶 、果实及其夹带土壤和介质中丁香疫霉菌的鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　2. 1 仪器

　　生物显微镜 ,超净工作台 ,光照培养箱 , 电子天平(1/1 000 g) ,高压灭菌锅 ,冰箱 ,PCR 扩增仪 ,荧光PCR扩增仪 , 电泳仪 ,凝胶成像仪 ,高速冷冻离心机 ,恒温水浴锅 。

　　2.2 用具

　　烧杯 ,三角瓶 ,量筒 ,试管 ,培养皿 ,酒精灯 ,镊子 ,剪刀 ,解剖刀 ,接种针 ,载玻片 ,盖玻片 ,塑料研杵 ,移液器 ,移液器吸头 ,离心管 ,液氮罐 。

　　3 试剂、材料和培养基

　　3. 1 试剂

　　β-谷甾醇 ,匹马霉素(pimaricin) ,氨苄青霉素钠盐(ampicillin) ,利福平钠盐(rifampicin) , 五氯硝基苯(pentachloronitrobenzene) ,恶霉灵(hymexazol) ,CaCO3,琼脂糖 ,Tris-HCl,MgCl2 , HCl, 乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA) ,NaOH ,NaOAc,KCl,Tris,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ,TAE,无水乙醇(etha- nol) ,三氯甲烷(chloroform) ,异丙醇(isopropanol) ,异戊醇(isoamylalcohol) ,SYBR Green I核酸染料 ,蛋白酶 K,Taq DNA 聚合酶 ,dNTP,通用引物 ITS5和 ITS4,实时荧光 PCR 引物 PS-F和 PS-R及 Taq- Man-MGB探针 PS-Pr。

　　3.2 材料

　　琼脂粉 ,V8汁 ,夏栎叶片或苹果或梨 ,鲜橙皮或杜鹃叶片 。

　　3.3 培养基

　　PDA培养基 ,V8培养基 ,V8鲜橙皮培养基 , V8杜鹃叶片培养基 ,选择性培养基 PARPH-V8。具体配方参见附录 A。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 症状检查

　　检查寄主植物的根 、茎 、叶 、果实等部位 ,对有枯萎 、果腐 、根腐 、颈腐和流胶症状的植物 , 以及根周围

　　GB/T 31801—2015

　　的土壤和介质取样送实验室做进一步检验 。 丁香疫霉菌为害症状参见附录 A。

　　4.2 寄主组织分离培养

　　可疑症状的根 、茎 、叶 、果实用流水冲洗表面约 15 min,取根 、茎 、叶 、果实果皮的病健交界处 ,剪成5 mm×5 mm 小块 ,75%乙醇消毒 30 s,无菌水冲洗 3 次 , 吸干水分 ,置选择性培养基 PARPH-V8上 , 17 ℃黑暗培养 。

　　培养 4 d~ 6 d后 ,组织周围培养基上长出稀疏菌落 ,挑取菌落边缘菌丝块转入 V8培养基或 PDA培养基纯化 ,17 ℃黑暗培养 。

　　4.3 土壤和介质诱集

　　称量土块或介质 25 g,碾碎放入 500 mL灭菌洁净烧杯中 。无菌水将土样或介质润湿(无流动水) ,保鲜膜覆盖封 口 ,置于 17 ℃ ~ 20 ℃黑暗条件下放置 3 d~ 5 d。

　　每份样品加灭菌蒸馏水 ,水面距土表 4. 0 cm ,然后加入 10片左右直径 8 mm~ 10 mm 的新鲜夏栎(Quercusrobur)叶片或未成熟的苹果或梨果实的小切片 ,切片大小以漂浮在水面为宜 ,Parafilm 膜封 口保湿 ,17 ℃ ~ 20 ℃黑暗条件下放置 。

　　4.4 诱集检查和培养

　　诱集 2 d~3 d后 ,观察夏栎叶片或苹果或梨附近是否有棕色病变区 ,从变色的病健交界处取 5 mm× 5 mm小块 ,75%乙醇消毒 30 s,置 V8培养基或选择性培养基 PARPH-V8,17 ℃黑暗培养 。

　　培养 4 d ~ 6 d后 ,组织周围培养基上长出稀疏菌落 ,挑取菌落边缘菌丝块转入 V8培养基纯化或PDA培养基 ,17 ℃黑暗培养 。

　　4.5 孢子囊和菌丝膨大体诱发

　　取纯化后菌落边缘菌丝块 ,置于盛有 10 mL无菌水的培养皿中 ,17 ℃ ~ 20 ℃黑暗条件下诱发孢子囊和菌丝膨大体 ,48h后观察菌丝块周围孢子囊和菌丝膨大体产生情况 。

　　4.6 卵孢子诱发

　　取纯化后菌落边缘菌丝块 ,置于加入 β-谷甾醇(20mg/L) 或植物油(玉米油 、亚麻籽油 、麦芽油) 的V8培养基中 ,黑暗条件下 8 ℃ ~ 10 ℃低温培养 4周 。

　　如果寄主材料是柑橘属的果实 ,则将纯化后菌落边缘菌丝块置于 V8鲜橙皮培养基或 V8杜鹃叶片培养基 ,10 ℃黑暗培养 ,7 d 后观测病菌卵孢子产生情况 。

　　4.7 DNA提取

　　收集分离到的病菌菌丝 ,采用 CTAB法提取核酸 。参见附录 B。

　　4. 8 实时荧光 PCR检测

　　实时荧 光 PCR 引 物 序 列 为 PS-F: 5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'和 PS-R: 5'-AGTGGGC- TACTAGCTCCAGGC-3', TaqMan-MGB 探 针 PS-Pr: 5'-(FAM) TGGCGACCGCTCTGA ( NFQ- MGB)-3',探针 5'端标记的荧光报告基团为 FAM ,3'端标记的非荧光猝灭基团为 MGB。

　　反应体系(25μL) :样品 DNA 1 μL,10×PCR 缓冲液 2. 5 μL,25mmol/LMgCl2 2 μL,2. 5mmol/L dNTPs2 μL,10 μmol/L Primers各 1 μL, 10 μmol/L探针 PH-Pr1. 5 μL, 5 U/μLTaq DNA 聚合酶0. 3 μL,ddH2 O 13. 7 μL。

　　反应循环为 94 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s,56 ℃ 60 s,循环 40次 。

　　4.9 ITS基因检测和序列比对分析

　　可以选择利用真菌通用引物 PCR扩增后测序比对的分子方法 。

　　利 用 真 菌 通 用 引 物 ITS5 ( 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') 和 ITS4 ( 5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3')进行扩增 。

　　反应体系(25μL) :样品 DNA 1 μL,10×PCR 缓冲液 2. 5 μL,25 mmol/LMgCl2 2 μL,2. 5 mmol/L dNTPs2 μL,10 μmol/L Primers各 1 μL,5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0. 3 μL,ddH2 O 15. 2 μL。 同时设置空白对照 , 以 Tris-EDTA缓冲液代替 DNA样品 。

　　PCR 反应条件为 :94 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环 ; 72 ℃ 10 min;4 ℃保存 。

　　PCR产物的检测 ,在 1×TAE 电泳缓冲液中 ,1. 5%琼脂糖(含 SYBR Green I核酸染料)凝胶电泳 , 5 V/cm ,凝胶成像仪分析结果 。如有 900 bp左右大小的条带出现 ,将扩增产物进行序列测定 。

　　将测序 后 的 序 列 与 NCBI 网 站 GenBank 中 公 开 发 表 的 Phytophthora syringae 的 序 列 进 行BLAST分析 。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 生物学特征

　　5. 1. 1 菌落特征

　　丁香疫霉菌在 V8培养基和 PDA培养基上生长较为缓慢 。在 V8培养基上菌落稀疏 ,呈放射状 、星状或菊花花瓣状 ,菌落的花瓣区域较尖 、窄 ,菌落形态图参见附录 C。在 PDA 上菌落边缘约呈花瓣状 ,乳白色 ,菌丝体浓密 ,菌落中央区域皱孔状 。

　　5. 1.2 病菌形态

　　无性生殖阶段孢子囊梗呈单歧聚伞花序状分枝 。孢子囊具有不完全的乳头状突起 ,形状为卵形或倒梨形 ,不易脱落 ,单独生在顶端或整个集结在一个孢子囊梗上 。孢子囊大小为(21. 0 μm~ 75. 0 μm) × (11. 0 μm~42. 0 μm) ,平均 47. 0 μm× 30. 0 μm ,长宽比在 1. 1 ∶ 1 至 2. 1 ∶ 1 之间 。孢子囊不易脱落 ,不增殖 ,但可直接在附近萌发产生一个新的孢子囊 。孢子囊具有平的盖 ,裂开释放游动孢子 ,游动孢子卵形 ,侧生二根鞭毛 。

　　病菌易产生菌丝膨大体 ,念珠状 ,卵形 、球形或不规则形 , 常萌发产生较细的菌丝 ,菌丝膨大体中的内含物最终会逐渐释放殆尽 ,成为空壳 。

　　病菌为同宗配合 ,藏卵器球形 ,直径 23. 4 μm~ 40. 0 μm;卵孢子充满藏卵器 ,通常为圆形 ,黄色 , 大小为 20. 1 μm~ 34. 7 μm;雄器单个或数个 ,平滑 ,多侧生 。

　　丁香疫霉菌的形态图参见附录 C。

　　5. 1.3 与近似种的形态区别

　　与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌(Phytophthorahibernalis) 。 主要区别为丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖 、窄 ,孢子囊不易脱落 ,具有菌丝膨大体 ,雄器多侧生 ;冬生疫霉菌落的花瓣区域较宽 ,孢子囊易脱落 ,无菌丝膨大体 ,雄器多围生 ,参见附录 D。

　　5.2 实时荧光 PCR检测

　　若阴性对照及空白对照的 Ct值 ≥40,供试菌 Ct值 ≤36,可判定为阳性 。

　　5.3 ITS序列比对

　　经 BLAST分析 ,PCR扩增到的 ITS基因序列与 NCBI网站 GenBank 中登录号为 AF380146. 1 的Phytophthora syringae的序列同源性 99% ~ 100% ,则判定为阳性 。

　　6 结果判定

　　病菌的培养性状和形态特征与 5. 1 的描述一致 ,且实时荧光 PCR 检测结果呈阳性 , 或 ITS序列比对 99% ~ 100%同源 ,可判定为丁香疫霉菌 。

　　7 样品和档案保存

　　7. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出丁香疫霉菌的样品应保存于 10℃冰箱中 ,至少保存6个月 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　7.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为丁香疫霉菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 PDA 培养基斜面上 , 20 ℃培养 5 d,10 ℃黑暗条件下保存 ,定期(60d)转接防止病菌死亡 ,至少保存 6 个月 。保存期满后高压灭菌灭活处理 。

　　7.3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并应有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　丁香疫霉菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌的基本信息

　　英文名 :Twig blightof lilac,Fruitrot

　　学名 :Phytophthora syringaeKleb.

　　分类地位 :藻菌界(Chromista) ,卵菌门(Oomycota) ,霜霉纲(Peronosporea) ,霜霉 目 (Peronospora- les) ,霜霉科(Peronosporaceae) ,疫霉属(Phytophthora) 。

　　传播途径 :通过雨水和灌溉近距离传播 ,通过带菌苗木 、果实或土壤进行远距离传播 。

　　近似种 :与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌(Phytophthorahibernalis) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据丁香疫霉菌形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 。

　　A.2 寄主范围

　　欧洲丁香(Syringavulgaris) ,普通赤杨(Alnusglutinosa) ,欧洲板栗(Castanea sativa) , 日本板栗(Castanea crenata) , 火 星 山 影 掌 (Cereus martianus) , 四 角 山 影 掌 (Cereus tetracanthus) , 柑 桔 属(Citrus spp.) ,欧洲榛(Corylusavellana) , 英 国 山 楂(Crataegusoxyacantha) , 巢 荷 包 掌(Echinopsis eyriesii) , 白冬石楠(Erica hiemalis) ,雪石楠(Ericanivalis) ,水青冈(Fagussylvatica) ,小茴香(Foe- niculum vulgare) , 金 钟 花 (Forsythia viridissima) , 迎 春 花 (Jasminum nudiflorum ) , 苹 果 (Malus pumila) ,辐射 松 (Pinus radiata) , 李 属 (Prunus spp.) , 欧 洲 梨 (Pyrus communis) , 栎 树 (Quercus sp.) ,椴树(Tilia sp.)等 。

　　A.3 病害症状

　　丁香疫霉菌可为害多种植物 ,引起寄主的根 、茎 、叶 、果实的多种病害 。 丁香受害小枝 、嫩枝枯萎 ,引起丁香的枝枯病(twig blight) ;苹果 、梨及其他蔷薇科果树受害 , 引起果腐病(fruit rot)和颈腐病(collar rot) ;西洋栗和山毛榉受害 ,导致根部腐烂症状 , 引致板栗和山毛榉树的根腐病(root rot) ; 柑橘属植物受害 , 出现果实褐腐 、嫩枝和花瓣枯萎症状 ;茴香受害 , 叶片枯萎 ;仙人掌受害 ,茎部腐烂 ;豆科灌木受害 ,树干和树枝上的树皮出现损伤 ,并呈现伤流溃疡 。

　　病菌引发的根腐 、茎腐及茎溃疡 ,导致植株长势衰弱 ,甚至死亡 。受侵染果实最初并不变软或溃烂 ,仍保持原形 ,只表皮有些变色 ,之后病部很快发展呈各种不同程度的黄色至褐色 。病斑不规则 , 与健康组织交界处界限不清晰 ,病斑处果皮呈皮革状 ,在潮湿的条件下 ,果皮上着生稀疏乳白色霉状物 ,病情继续发展 ,病果变成一团浆果 。 图 A. 1~ 图 A. 5 为部分病害症状 。

　　图 A. 1

　　图 A.2 海棠症状

　　图 A.4 苹果果实症状

　　A.4 分布

　　柑橘属果实症状

　　图 A.3 石楠症状

　　图 A.5 梨果实症状

　　美国 、加拿大 、秘鲁 、德国 、意大利 、瑞士 、英国 、比利时 、丹麦 、法国 、希腊 、爱尔兰 、荷兰 、葡萄牙 、罗马尼亚 、瑞典 、捷克 、立陶宛 、前南斯拉夫 、澳大利亚 、新西兰 、摩洛哥 、南非 。

　　A.5 培养基

　　PDA培养基 :去皮马铃薯 200 g,切碎 ,加适量蒸馏水煮沸 20 min左右 ,双层纱布过滤 ,在滤汁中加入葡萄糖 20 g、琼脂 18 g,继续煮至琼脂完全溶化后 ,加蒸馏水补足 1 000 mL,121 ℃ ,灭菌 20 min。

　　V8培养基 :V8汁 100 mL,加入 2. 5 g CaCO3 ,15g琼脂 ,900 mL蒸馏水 ,121 ℃ ,灭菌 20 min。

　　V8鲜脐橙培养基 :V8培养基灭菌前加入 10 g~ 15g切碎的鲜橙皮 ,121 ℃ ,灭菌 20 min。

　　V8杜鹃叶片培养基 :V8培养基灭菌前加入 5 g左右切碎的新鲜杜鹃叶片 ,121 ℃ ,灭菌 20 min。

　　选择性培养基 PARPH-V8:V8汁 50 mL,加入 1. 25 g CaCO3 , 15 g琼脂 , 950 mL蒸馏水 , 121 ℃ ,灭菌 20 min后 ,冷却到 50 ℃ ,加入匹马霉素 0. 005 g、氨苄青霉素钠盐 0. 25 g、利福平钠盐 0. 01 g、五氯硝基苯 0. 025 g、恶霉灵 0. 05 g。

　　附 录 B (资料性附录) DNA提取方法

　　刮取菌落上的菌丝体 ,放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　离心管加入 300 μL~ 500 μLCTAB缓冲液(其中含 0. 1 g蛋白酶 K)混匀 ,65 ℃水浴 1 h;13000g离心 5 min~ 10 min,保留上清液 ;加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000 g 离心5 min~ 10 min, 保 留 上 清 液 ; 再 加 500 μL三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(体 积 比 为 24 ∶ 1) 混 匀 , 13 000 g 离 心5 min~ 10 min,保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -20 ℃过夜;13000g 离心 30min,可见 DNA沉淀 ;70%乙醇洗 DNA沉淀 ,室温干燥 ;用 30 μL~ 50 μLTris-EDTA缓冲液溶解 DNA,待用 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　丁香疫霉菌形态图

　　图 C. 1 V8培养基上菌落形态

　　图 C.2 孢子囊

　　图 C.3 菌丝膨大体

　　图 C.4 藏卵器、雄器和卵孢子

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　丁香疫霉菌与近似种冬生疫霉菌的形态区别

　　表 D. 1 丁香疫霉菌与近似种冬生疫霉菌的形态区别

　　参 考 文 献

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