GB/T 31800-2015 李痘病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31800—2015

　　李痘病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPlum poxvirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31800—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :陈先锋、张慧丽、陈定虎、张吉红、徐瑛、郭立新、闻伟刚、杨红霞、杜洪忠、吴品珊 。

　　李痘病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了李痘病毒的免疫学和分子生物学检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于植物材料 ,包括无性繁殖材料 、组培苗 、种子 、花和果实中李痘病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法

　　SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法

　　3 仪器设备和主要试剂

　　3. 1 仪器设备

　　普通 PCR仪 、实时荧光 PCR仪 、酶标仪 、电子天平(1/1 000 g) 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 、水浴锅 、台式高速冷冻离心机 、-80 ℃超低温冰箱 、超净工作台 、高压灭 菌 锅 、制 冰 机 、微 波 炉 、涡 旋 振 荡器 。可调式微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL)及相应的无 RNase 吸头 、无RNase离心管 、PCR管和研钵等 。

　　3.2 主要试剂

　　除特别规定外 ,所有实验用试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。

　　Trizol、焦碳酸 二 乙 酯 (DEPC) 、液 氮 、三 氯 甲 烷 、异 丙 醇 、乙 醇 、β-巯 基 乙 醇 、RNA 反 转 录 酶 、 Taq DNA 聚合酶 、SYBR green I 、DNA相对分子质量标准物 、溴化乙锭 、琼脂糖 、溴酚蓝等 。 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)检测试剂配制方法见附录 B 中 B. 1。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 症状检查

　　仔细检查植株的叶片及花 、果实 、果核是否有褪色 、环斑 、畸形等可疑症状 ,如果出现了典型症状(参见附录 A) ,可采集表现症状的花 、叶片或果实进行后续检测 。

　　4.2 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)

　　DAS-ELISA具体操作步骤见附录 B。

　　4.3 普通 RT-PCR检测方法

　　普通 RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录 C。

　　GB/T 31800—2015

　　4.4 实时荧光 RT-PCR检测方法

　　实时荧光 RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录 D。

　　4.5 免疫电子显微镜观察

　　按 SN/T 1840执行 。

　　4.6 株系鉴定

　　在检出李痘病毒时 ,必要时可对其进行株系鉴定 ,株系鉴定的具体操作步骤见附录 E。

　　5 结果判定

　　采用 DAS-ELISA 进 行 初 筛 , 测 定 结 果 为 阴 性 , 判 定 未 检 出 李 痘 病 毒 ; 测 定 结 果 为 阳 性 , 用 普 通RT-PCR方法或实时荧光 RT-PCR方法进行验证 , 当验证结果也为阳性时 ,则判定检出李痘病毒 。若需进一步鉴定该病毒 ,可采用免疫电子显微镜观察或 PCR产物序列测定等进行复验 。

　　6 样品保存与结果记录

　　6. 1 样品保存

　　经检验确定携带李痘病毒的样品,经登记和标记后保存在 -20℃冰箱中 ,有条件的保存在 -80 ℃冰箱中 ,妥善保存 6个月 , 以备复核 。

　　6.2 结果记录

　　需要保存的记录包括 :样品的种类 、自然状态 、来源 、为害症状及为害程度(无症状也要说明) ,诊断时使用的方法(包括质控物质 , 以及每种方法获得的结果) ,酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值 ,RT-PCR检测应有电泳结果照片 ,实时荧光 RT-PCR 应有扩增曲线图片 , 鉴定实验室的名称 , 负责人和鉴定人的签字等 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　李痘病毒相关信息

　　A. 1 李痘病毒基本信息

　　中文名 :李痘病毒

　　学名 :Plum pox virus

　　异名 :Sharka virus

　　缩写 :PPV

　　分类地位 :马铃薯 Y病毒科(Potyviridae) ,马铃薯 Y病毒属(Potyvirus) 。

　　A.2 方法原理

　　李痘病毒为害症状 、血清学特性和基因组特征是制定本标准的主要依据 。根据李痘病毒免疫原性强 ,可以制备病毒抗血清和外壳蛋白基因保守性强 ,可以设计特异性引物和探针 。采用双抗体夹心酶联免疫吸附反应和逆转录-聚合酶链式反应以及序列测定作为该病毒的检疫鉴定依据 。

　　A.3 寄主范围

　　PPV 能 侵 染 木 本 科 和 草 本 科 寄 主 , 自 然 条 件 下 , PPV 很 容 易 侵 染 李 属植 物 : 杏 ( Prunus armeniaca) 、桃(P. persica) 、油桃(P. persica var. nectarina) 、欧洲李(P. domestica) 、李(P. salicina) 、乌荆子李(P. insititia) 、樱 桃 李(P. cerasifera) 、麦 李(P. glandulosa) 、甜 樱 桃 (P. avium) 、欧 洲 酸 樱 桃(P. cerasus) 。野生的李属寄主 :扁桃(P. amygdalus) 、杏(P. americana) 、西沙樱桃(P. bessey) 、马哈利樱桃(P. mahaleb) 、梅(P. mume) 、矮 樱 桃(P. pumila) 、郝 图 兰 李(P. hortulana) 、山 桃(P. davi- dana) 、毛樱桃(P. tomentosa) 、紫杏(P. nigra) 、滨梅(P. maritime) 、桂樱(P. laurocerasus) 。

　　A.4 病害症状

　　PPV在植株的叶片 、花瓣 、果实和果核都可能引起症状 。

　　叶片 : 叶上症状特别清晰 , 出现带状或环状褪绿斑 , 明脉甚至畸形 ,见图 A. 1 a、b、c。

　　花瓣 :引起花瓣褪色 ,见图 A. 1 d。

　　果实 :果皮上出现褪绿或环斑 ,见图 A. 1 e、f、g。果实受害后有时会变形 ,呈不规则状并在其褪色环内形成褐色或坏死区域 ,果实内部变褐见图 A. 1 i。

　　果核 :染病的果核上产生浅色的环斑 ,见图 A. 1 h。

　　说明 :

　　a — 杏叶上的典型症状 ,带状和环状褪绿斑 ;

　　b — 桃叶上引起明脉 ;

　　c — 李子叶片上的症状 ;

　　d —PPV-M 引起桃花花瓣褪色 ;

　　e —PPV-D在桃果实上引起的症状 ,浅黄色环 ;

　　f —PPV-M在桃果实上引起的症状 ,果皮上出现浅黄色环或线状纹 ;

　　g、h —PPV在杏果实上引起的症状 ,果皮上出现浅黄色环 ,果核上产生浅色的环 ;

　　i — 李果实上的症状 。

　　注: a~h引自 Bulletin OEPP/EPPO Bulletin34, 247~256,i引 自 http://www. forestryimages. org/browse/detail. cfm? imgnum= 0660082。

　　图 A. 1 PPV在寄主植物上的为害症状

　　A.5 地理分布

　　欧洲 :波斯尼亚和黑塞哥违亚 、保加利亚 、罗马尼亚 、塞尔维亚 、克罗地亚 、捷克共和国 、波兰 、匈牙利 、摩尔多瓦 、斯洛伐克 、斯洛文尼亚 、乌克兰 、阿尔巴尼亚 、希腊 、意大利 、葡萄牙 、西班牙 、比利时 、法国 、卢森堡 、奥地利 、德国 、英国 、俄罗斯 、挪威 、前南斯拉夫 、亚速尔群岛 、立陶宛 、荷兰和瑞士 ;

　　亚洲 :塞浦路斯 、印度 、叙利亚 、土耳其 ;

　　非洲 :埃及 ;

　　北美洲 :美国 、加拿大 ;

　　南美洲 :智利 ;

　　大洋洲 :澳大利亚 。

　　A.6 传播途径

　　近距离通过昆虫介体进行传播 ,PPV 至少可以通过 20种蚜虫作非持久性传播 ,其中较重要的有 :蓟短尾蚜(Brachy caudus) 、桃短尾蚜(B. helichrysi) 、忽布疣额蚜(Phorodon humuli) 和桃蚜(Myzus

　　persicae) 。次要的昆虫介体有 :蚜属一种(Aphisarbuti) 、花生蚜(A. craccivora) 、黑豆蚜(A. fabae) 、棉蚜(A. gossypii) 、蚜 属 一 种 (A. hederae) 、绣 线 菊 蚜 (A. spiraecola) 、飞 廉 短 尾 蚜 (Brachycaudus cardui) 、李短尾蚜(B. persicae) 、玫 瑰 苹 果 蚜(Dysaphis plantaginea) 、西 圆 尾 蚜(D. pyri) 、桃 粉 蚜 (Hyalopteruspruni) 、蔷 薇 长 管 蚜(Macrosiphum rosae) 、黄 荊 蚜 属 一 种(Megoura rosae) 、桃 卷 叶 蚜 (M. varians) 、禾 谷 缢 管 蚜(Rhopalosiphum padi) 、悬 钩 子 长 管 蚜(Sitobionfragariae) 、苣 荬 指 管 蚜 (Ureleucon sonchi) ,并易经汁液接种传播 。

　　远距离主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运 。

　　A.7 粒体形态

　　病毒粒体线状 ,长约 700 nm ,直径约 11 nm。

　　注 : 引 自 M Boulila 2004,放大 40 000倍 。

　　图 A.2 李痘病毒粒体形态

　　A. 8 基因组特征

　　PPV基因组为单分体基因 组 , 基 因 组 含 一 条 正 单 链 RNA, 该 RNA 分 子 由 近 10 000个 核 苷 酸 组成 ,并包被在由多达 2 000个亚基构成的单一外壳蛋白中 。

　　A.9 血清学特性

　　根据血清学特性和分子生物学特性 ,PPV 的分离 物 目 前 分 为 7 个 型 : D(Dideron) 型 、M(Marcus)型 、C(Cherry)型 、EA(ElAmar)型 、W(Winona)型 、Rec(Recombinant)型和 T(Turkey)型等 。绝大多数PPV 的分离物均属于 D 型和 M 型 。Rec型是 D 型和 M 型的重组型 ,Rec型血清学特性与 M 型相似 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)

　　B. 1 ELISA所采用的试剂及配制

　　B. 1. 1 酶联板

　　使用质量有保证厂商生产的酶联板 。

　　B. 1.2 包被抗体

　　特异性的李痘病毒抗体 。

　　B. 1.3 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的李痘病毒抗体 。

　　B. 1.4 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP)

　　B. 1.5 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,调节 pH 至 9. 6,定容至 1 000 mL,4 ℃保存 。

　　B. 1.6 洗涤缓冲液(PBST,pH 7. 4)

　　溶于 800 mL 的蒸馏水中 ,调节 pH 至 7. 4,定容至 1 000 mL。

　　B. 1.7 样品提取缓冲液(pH 7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 20. 0 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 800 mL 的 PBST 中 ,调节 pH 至 7. 4,定容至 1 000 mL。

　　B. 1. 8 酶标抗体稀释缓冲液(pH 7. 4)

　　PBST缓冲液 1 000 mL

　　牛血清白蛋白(BSA) 2. 0 g

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 20. 0 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　4 ℃保存 。

　　B. 1.9 底物缓冲液(pH 9. 8)

　　氯化镁(MgCl2 · 6H2 O) 0. 1 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　二乙醇胺(C4 H11NO2 ) 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,调节 pH 至 9. 8,定容至 1 L。4 ℃保存 。

　　B.2 操作步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　用 包被缓冲液将抗体按说明稀释 ,每孔加入 100μL包被抗体溶液 ,37℃孵育 4 h或 4 ℃冰箱过夜 。倒去孔中的包被抗体溶液 ,加 200 μLPBST然后快速甩空 ,重复 2 次 。将酶标板倒置在纸巾上拍去多余的液体 。

　　B.2.2 样品制备

　　B.2.2. 1 种子类

　　随机抽取 100粒种子经 3%次氯酸钠表面消毒 10min后 ,用无菌水洗涤 3 次 ,将种子置于铺有吸水纸的白磁盘中 ,在适宜的发芽温度(20 ℃ ~ 28 ℃) 下催芽 ,直至长出第一对真叶 , 随机抽取 20株苗的叶片 ,每个样品 0. 1 g ~1 g,按 1 ∶ 5~10(质量体积比)加入样品提取缓冲液 ,用研钵研磨匀浆 ,2000 r/min离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行 。

　　B.2.2.2 种苗类

　　对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状的植物组织如 : 叶片 、花 、果皮等 。对于无症状的种苗类样品选取 20株种苗 ,至少应从每株植物的 4个不同的位置采样 。在春季 ,可采集花 、带有完全伸展叶片的新发枝条或果实 。在夏秋季 ,采集成熟叶片或者成熟果实的果皮可用于检测 。冬天可采集休眠芽 、树皮组织或者完整的芽体 。按 1 ∶ 5~10(质量体积比)加入样品提取缓冲液 ,用研钵研磨匀浆 ,2000 r/min离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行 。

　　B.2.3 加入检测样品

　　每孔加入 100 μL检测样品提取液 ,每个样品至少 2 个孔 。并设置阳性 、空白和阴性对照 。在室温孵育 2 h或 4 °C过夜 。倒去孔中的检测样品提取液 ,每孔用 200 μLPBST洗涤 3 次 。

　　B.2.4 酶标抗体稀释

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明书要求稀释酶标抗体 。每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 。在室温下孵育 2 h。倒去孔中的酶标抗体溶液 ,用 PBST洗涤 3 次 。

　　B.2.5 加底物

　　在孵育完成前 15min,将底物加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100 μL/孔 ,

　　加入到酶联板相应的孔中 ,室温避光孵育 30 min~ 60 min。

　　B.2.6 读数

　　用酶标仪检测 405 nm 波长下各孔的吸收值并记录 。

　　B.3 结果判断

　　B.3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　阴性对照孔的 OD405值<0. 15;

　　阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >2;

　　重复检测样品 OD405 值 平 行 允 许 率 (p) 小 于 20% 。 样 品 OD405 值 的 平 行 允 许 率 按 式 (B. 1) 进 行计算 :

　　p

　　式中 :

　　p — 平行允许率 ;

　　OD1 — 重复样品 1 的 OD405值 ;

　　OD2 — 重复样品 2 的 OD405值 。

　　B.3.2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果原则上可判断如下 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值接近阈值 ,判为可疑样品,应重做一次或用其他方法验证 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 。

　　B.3.3 若满足不了 B. 3. 1 质量要求 ,则不能进行结果判断 。

　　B.3.4 如果是采用检测试剂盒 ,则根据试剂盒的说明来判定 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　普通 RT-PCR检测方法

　　C. 1 引物序列

　　PPV通用引物序列见表 C. 1。

　　表 C. 1 RT-PCR 引物序列

　　C.2 总 RNA提取

　　C.2. 1 取 0. 1 g样品,液氮研细 ,加入 1 mL Trizol,混匀 ,转入 1. 5 mL离心管中 。

　　C.2.2 加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,猛烈振荡 15 s,4 ℃ ,12 000 r/min离心 10 min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 。

　　C.2.3 加入等体积异丙醇 ,混匀 ,沉淀 10 min,4 ℃ ,12 000 r/min离心 10 min,弃上清液 。

　　C.2.4 加入 1 mL 75%冷乙醇洗涤沉淀 ,4 ℃ ,8 000 r/min离心 10 min,弃上清液 ,室温放置干燥后溶于 20 μLDEPC处理水中 ,存于 -20℃备用 。

　　注 : 也可按照商品 RNA提取试剂盒进行操作 。

　　C.3 cDNA合成

　　利用提取的 RNA在 PCR管中进行反转录 。反转录体系 20μL,其中 2 μL模板 RNA,1 μL下游引物(10 μmol/L) ,4 μL 5× AMV 酶缓冲液 ,2 μL dNTP(10 μmol/L) ,2 μL AMV 反转录酶(5U/μL) , 0. 5 μL RNA酶抑制剂(40U/μL) ,DEPC处理水 8. 5 μL。42 ℃反应 1 h。 逆转录产物置于 -20 ℃保存 ,应尽快进行检测 。也可采用 RT-PCR一步法试剂盒 ,操作步骤按使用说明进行 。

　　C.4 PCR扩增

　　C.4. 1 PCR反应体系

　　反应体系见表 C. 2,每个样品设 2 个平行处理 。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以含李痘病毒材料的 cDNA 或含有李痘病毒 目标片断的质粒作为阳性对照 , 以健康植物材料的 cDNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 C.2 RT-PCR反应体系

　　C.4.2 PCR反应条件

　　反应条件如下 :94 ℃ 3 min;94℃ 40 s,60℃ 40 s,72℃ 1 min,40个循环 ;最后 72℃延伸 10min。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 。

　　C.5 琼脂糖凝胶电泳检测

　　用 1×TAE配制 1. 5%的琼脂糖凝胶(55℃ ~ 60℃时加入溴化乙锭至终浓度为 0. 5 μg/mL,也可在电泳后进行染色) 。取 5 μL的 RT-PCR 产物与 1 μL 的 6×上样缓冲液混合均匀 , 加入样品孔 。 恒压5 V/cm电泳 20 min~ 30 min。凝胶成像系统中观察电泳结果 ,拍照并记录结果 。

　　C.6 结果判定

　　在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带 、阳性对照产生约 243bp的预期大小条带情况下 :如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阳性 ;

　　如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测方法

　　D. 1 引物及探针序列

　　实时荧光 RT-PCR检测 PPV 的引物与探针见表 D. 1。

　　表 D. 1 实时荧光 RT-PCR检测 PPV 的引物与探针

　　D.2 RNA提取及 cDNA合成

　　操作方法见附录 C。

　　D.3 实时荧光 PCR反应体系及条件

　　D.3. 1 普通 TaqMan探针反应体系及条件

　　反应体系见表 D. 2,每个样品设 2个平行处理 。并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。检测时以含李痘病毒材料的 cDNA或含有李痘病毒目标片断的质粒作为阳性对照 , 以健康植物材料的 cDNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 D.2 实时荧光 PCR反应体系

　　表 D.2 (续)

　　反应条件 :预变性 95℃ 5 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,共 40个循环 。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 。

　　D.3.2 TaqMan MGB探针反应体系及条件

　　反应体系见表 D. 3,每个样品设 2个平行处理 。并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。检测时以含李痘病毒材料的 RNA作为阳性对照 , 以健康植物材料的 cDNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 D.3 TaqMan MGB探针反应体系

　　反应程序为 :42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s;然后 95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共 40个循环 。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 。

　　D.4 结果判断

　　阳性对照的 Ct值应<30,并出现典型的扩增曲线 。 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线 。若不满足该两项条件 ,此次检测无效 ,应重做荧光 PCR扩增 。

　　待测样品的 Ct值为 40时 ,则判定未检测到 PPV。

　　待测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定检测到 PPV。

　　待测样品的 Ct值小于 40且大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值为 40时 ,则判定未检测到 PPV。如果重新测试的 Ct值小于 40且大于 35时 ,则判定检测到 PPV。

　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　株系鉴定

　　E. 1 引物序列

　　PPV株系鉴定引物序列见表 E. 1。

　　表 E. 1 株系鉴定引物序列

　　E.2 RNA提取及 cDNA合成

　　操作方法见附录 C。

　　E.3 PCR扩增及结果判定

　　E.3. 1 D 型和 M 型

　　PCR反应体系及扩增条件见附录 C。P1/PD和 P1/PM均可产生一条 198 bp的条带 ,在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带 、阳性对照产生约 198 bp的预期大小条带 情 况 下 : P1/PD扩 增 出198bp的条带 ,则该 PPV 为 D株系;P1/PM扩增出 198 bp的条带 ,则该 PPV 为 M 株系 ;两对引物均未产生预期大小条带 ,则该 PPV为其他株系 。

　　E.3.2 Rec型

　　PCR反应体系见表 E. 2,反应条件为 :94 ℃ 3 min;94℃ 45 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共 35个循环 ; 72 ℃ 7 min。在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带 、阳性对照产生约 605bp的预期大小条带情况下 :扩增出 605 bp的条带 ,则该 PPV 为 Rec株系 ,未产生预期大小条带 ,则该 PPV为其他株系 。

　　表 E.2 PCR反应体系

　　E.3.3 PPV-C型、PPV-EA型和 PPV-W 型

　　采用 RT-PCR SYBR Green I 熔 点 曲 线 分 析 法 , 反 应 体 系 见 表 E. 3, 反 应 条 件 : 50 ℃ 10 min, 95 ℃ 2 min,29个循环 95℃ 15s,60℃ 60 s 。熔点曲线分析 :通过 60℃ ~95℃以 0. 1 ℃/s的速度进行孵育 ,从而得到平均为 1 点 的 平 滑 曲 线 。PCR 产 物 熔 解 温 度 分 别 为 : PPV-C(74 bp) 79. 84 ℃ , PPV-EA(74bp) 81.27 ℃ ,PPV-W(74bp)80. 68℃ 。Nad5-F和 Nad5-R为假阴性控制引物 ,扩增产物为 181bp。

　　表 E.3 SYBR Green I 荧光定量 RT-PCR反应体系

　　参 考 文 献

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