GB/T 31799-2015 银毛龙葵检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31799—2015

　　银毛龙葵检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofSolanum elaeagnifolium Cav.

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31799—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、山东大学 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :邵秀玲 、张伟 、林超 、范晓虹 、厉艳 、宋涛 、尼秀媚 、甘琴华 。

　　银毛龙葵检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了银毛龙葵(Solanum elaeagnifolium Cav. )的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于所有植物原粮 、种子及其他产品中混杂的银毛龙葵以及杂草监测工作中银毛龙葵的检疫鉴定 。

　　2 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　2. 1

　　星状毛 stellatehair

　　茄属植物鉴定的重要特征 ,指从着生点分裂 ,散生出多个分枝而呈放射状的毛 。

　　2.2

　　互生 altenate

　　茎上每个节上着生一个叶片 。

　　2.3

　　花药 anther

　　雄蕊顶端产生花粉的膨大部位 。

　　2.4

　　浆果 berry

　　由单个雌蕊发育成的肉质果实 ,具有几个或多个种子 ,有时也泛指通体多汁或肉质的果实 。 2.5

　　近缘种 relativespecies

　　一群亲缘关系相近的物种 。

　　2.6

　　外类群 outgroup

　　研究者为正确推断内群的系统发育关系 ,在其研究对象之外选取的与内群有密切联系的分类单元 。外类群是推断系统 关 系 的 “参 照 系 ”, 用 于 比 较 的 目 的 , 通 常 参 与 判 断 一 对 或 一 系 列 同 源 性 状 的 相 对极向 。

　　2.7

　　DNA 条形码 DNA barcoding

　　通过一段或几段 DNA 片段而建立起来的物种准确快速识别的分子方法 。

　　2. 8

　　单系 monophyly

　　包括最近共同祖先及其全部后裔种在内的一个类群 。在这个类群内 ,物种相互之间比类群外的任何物种有更近的亲缘关系 。

　　2.9

　　散点图 scatterdiagram

　　不同的自变量(x,y)在坐标系中形成的二维图称散点图 。从散点图中可以直观地看出变量间是否

　　GB/T 31799—2015

　　存在相关关系 。

　　2. 10

　　条形码间隔 barcodinggap

　　对于一段或几段 DNA 片段 ,若种间的遗传差异大于种内的遗传差异 ,两者之间形成了一个明显的间断称为条形码间隔 。

　　2. 11

　　Levin的茄亚属系统 Levin’sSolanum subgenusLeptostemonum system

　　Levin R. A. 等人 2006年使用 GBSSI、ITS 和 trnS-trnG DNA 区段构建的茄亚属分子分 类 系 统 。该系统对茄属植物中茎和叶通常具刺的 400多个物种进行了分类界定 ,认定该类植物的范围包括 Old WorldClade、Elaeagnifolium Clade和 Carolinense Clade 等十大支系 ,讨论了各支系间的亲缘关系 ,其中银毛龙葵属于 Elaeagnifolium Clade 支系 ,这为了解银毛龙葵的所在系统位置及其近缘种 ,制定其分子鉴定的取样策略提供了科学依据 。详见参考文献 。

　　3 仪器和用具

　　3. 1 仪器设备

　　3. 1. 1 体视显微镜(10× ~40× ;具测微尺) 。

　　3. 1.2 PCR仪 、高速冷冻离心机 、微型涡旋混合仪 、微波炉 、低温冰箱 。

　　3.2 实验用具

　　3.2. 1 电子秤(精确到 0. 01 kg) 、放大镜 、白瓷盘 、样品袋 、套筛 、直尺 、镊子 、小毛笔 、培养皿 、指形管 、标签 、记录纸 、标本瓶 、标本盒 。

　　3.2.2 微量移液器 、PCR薄皮管 、离心管 、枪头 。

　　4 现场检疫

　　在现场检疫时 ,根据银毛龙葵鉴定特征 ,如发现可疑植物 ,应拍摄照片并采集植物样本送实验室检验 。植物样本应尽量保持完整 ,形态学特征完好 。

　　5 实验室检验和鉴定

　　5. 1 植株样本的检验

　　用肉眼 、放大镜或体视显微镜观察 ,按照 6. 2、6. 3进行鉴定 。

　　5.2 原粮和种子样品的检验

　　5.2. 1 样品制备

　　视样品多少 ,取平均样品的 1/2~ 3/4作为检验样品 ; 种子等样品可根据种类 、数量等实际情况决定 ,样品不足 1. 0 kg的全检 。称取并记录检验样品的质量(精确到 0. 01 kg) ,剩余平均样品加贴标签作为保存样品保存 。发现可疑植株残体的参照 8进行植株种类鉴定 。

　　5.2.2 过筛检验

　　根据检验样品个体的大小确定套筛的规格 ,人工筛检套筛孔径至少应包括 4 mm、2. 5 mm ,按照孔

　　径从大到小依次套上套筛并加上筛底 ,将检验样品倒入最上层的套筛内 ,盖上筛盖 , 以回旋法过筛 ,或用电动筛振荡 ,使样品充分分离 。把过筛的筛上物和筛下物分别倒入白瓷盘内进行人工挑选 ,种子鉴定用样品,要求发育成熟 、外形完整 。

　　5.3 镜检鉴定

　　观察浆果外部形态特征 ,符合 6. 2. 5、6. 3鉴定特征者对种子进一步鉴定 ;剥开浆果或直接将种子放在体视显微镜下观察 ,按照 6. 2. 6、6. 3进行鉴定 。

　　5.4 分子鉴定

　　符合 6. 2鉴定特征的种子或疑似银毛龙葵的植物体 , 可种植后根据植株的形态特征进行鉴定或通过分子鉴定方法进行鉴定 ,银毛龙葵的分子鉴定方法见附录 B。

　　6 形态特征

　　6. 1 茄属(Solanum L. )主要形态特征

　　草本或灌木 ,有时攀援状 ,有些种类有刺 ,常被星状毛 ; 叶互生 ,单叶或复叶 ;花组成顶生或侧生的各种聚伞花序或总状花序 ,很少单生 ,两性 ,全部能孕或仅生花序下部的为能孕花 ,上部的雌蕊退化而趋于雄性 ;萼 4~ 5(10) ,常在果期增大 ,但不包被果实 ,齿裂 ;花冠辐状或浅钟状 , 白色 、黄色 、蓝色或紫色 ,开放前常折叠 , (4) ~ 5 裂或几不裂 ;雄蕊 5,稀 4,着生于花冠筒喉部 ,花丝短 , 间有一枚较长 ,花药靠合成一圆锥体 ,顶孔开裂 ;子房 2 室 ,有胚珠多数 ;果为浆果 。

　　6.2 银毛龙葵的形态特征

　　6.2. 1 植株

　　直立多 年 生 灌 木 状 草 本 , 高 30 cm ~ 80 cm , 茎 、叶 处 常 具 橘 红 色 刺 , 被 星 状 毛 (参 见 附 录 C 中图 C. 1) 。

　　6.2.2 叶

　　单叶 ,互生 ,长椭圆形 ,银白色 ,长可达 15 cm ,宽 0. 5 cm~2. 5 cm ,边缘常呈波状 , 叶脉上常具刺(参见图 C. 2) 。

　　6.2.3 茎

　　茎直立 ,分枝 ,表面有稠密的银白色绒毛 ,覆盖着许多细长的橘色刺 ,幼嫩的茎刺相对较少 ,成熟的茎刺会更多 、更密集(参见图 C. 3) 。

　　6.2.4 花序

　　花蓝色至蓝紫色 ,稀白色 ,通常直径在 2. 5 cm~ 3. 5 cm 左右 ,但也可到 4. 0 cm ,花瓣 5,合生 ; 花药5,黄色 ,靠合 ,长 5 cm~ 9 cm(参见图 C. 4) 。

　　6.2.5 果实

　　果实为浆果 ,光滑 ,球状 , 直 径 1. 0 cm ~ 1. 5 cm , 绿 色 带 暗 条 纹 , 成 熟 时 呈 黄 色 带 橘 色 斑 点(参 见图 C. 5) 。

　　6.2.6 种子

　　种子轻且圆 ,两侧压扁 ,平滑 , 暗棕色 ,直径在 2. 5 mm~4 mm 之间(参见图 C. 6) 。

　　6.3 银毛龙葵近似种的形态特征

　　6.3. 1 S.ellipticum R. Br.

　　近似种 S. ellipticum R. Br. 叶片宽椭圆形 ,嫩叶呈紫色 ,花药长约 2. 5 cm(参见附录 D 中 D. 1. 1) 。

　　6.3.2 S.esuriale Lindl.

　　近似种 S.esuriale Lindl. 常与银毛龙葵相混淆 ,前者具椭圆形叶片 ;浆果浅黄色或淡黄褐色 ,直径1. 0 cm~ 1. 5 cm;花药粗短 ,长约 4 cm~ 5 cm;种子 2 mm~ 3 mm ,浅黄褐色(参见 D. 1. 2) 。

　　6.3.3 北美刺龙葵(S.carolinenseL. )

　　银毛龙葵与检疫性杂草北美刺龙葵植株差异较大 ,后者叶片常具叶裂 , 叶片疏被星状毛 ,具刺 ;浆果黄色 ,直径约 1. 2 cm~ 1. 8 cm;花冠白色至紫色 ;种子 2 mm~ 3 mm ,倒卵形 ,扁平 ,有光泽 ,表面颗粒状 ,黄色至淡黄色 ,而银毛龙葵种子较大 ,颜色略深(参见 D. 1. 3) 。

　　7 结果判定

　　符合 6. 2鉴定特征的植株可判定为银毛龙葵 ;符合 6. 2 鉴定特征的浆果 、种子且分子鉴定结果为阳性的可判定为银毛龙葵 ;否则判定所鉴定样本非银毛龙葵 。

　　8 样品保存

　　8. 1 对已鉴定的银毛龙葵植物 ,应压制标本 ,连同植株照片一起登记保存 。

　　8.2 对已鉴定的银毛龙葵种子 ,装入标本瓶登记保存在干燥 、防鼠 、防虫处 。

　　8.3 登记保存时应至少标明样品的中文名称 、学名 、科别 、产地 、日期 、鉴 定 人 等 。样 品 至 少 保 存 6 个月 ,有特殊需求保存期可适当延长 。保存期满 ,经灭活后妥善处理 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　银毛龙葵相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 银毛龙葵基本信息

　　中文名 :银毛龙葵

　　学名 :Solanum elaeagnifolium Cav.

　　俗 名 : silverleaf nightshade, bull-nettle, prairie-berry, silverleaf bitter-apple, silverleaf-nettle, tomato-weed,whitehorse-nettle,satansbos,arrebenta-cavalo等

　　分类 地 位 : 被 子 植 物 门 ( Angiospermae) , 双 子 叶 植 物 纲 ( Dicotyledoneae) , 合 瓣 花 亚 纲(Sympetalae) ,管花目(Tubiflorae) ,茄亚目(Solanineae) ,茄科(Solanaceae) ,茄属(Solanum L. ) 。

　　传播途径 :短距离靠营养体传播 ,远距离靠种子传播 。种子可由风 、水 、机械 、鸟类 、动物(或内部或外部)携带传播 。

　　A. 1.2 方法原理

　　通过观察被检对象中发现的疑似银毛龙葵的植株 、果实或种子 ,根据银毛龙葵形态特征与分子生物学鉴定方法进行种类鉴定 。

　　A.2 基本信息

　　茄属全世界有 1 400余种 ,其中有 4种已被列入我国进境检疫性杂草 。我国茄属分布种类很少 ,包括栽培的蔬菜等仅约 40种 ,银毛龙葵属于茄亚属分支(Leptostemonum) ,该分支有 350种 ~ 450种 ,在进化关系树上分属于 10个亚支 ,银毛龙葵属于银毛龙葵亚支(Elaeagnifolium Clade) 。本标准近似种的选择主要为有报道易与银毛龙葵混淆种 。

　　A.3 生物学特性

　　多年生草本 ,10月 ~ 11月可从根上进行营养繁殖 。植物在 11月或 12月 到 4 月 开花 、结果 。死亡的茎带有浆果 ,通常会保留几个月 。 种子秋季萌发 , 幼小的植株在几个月内就可形成庞大的根系 。 根深 ,分支多 ,垂直和水平的根一般超过 2 m。银毛龙葵生命力极强 , 即使经过收割 ,仍会重新生长出来 。甚至处在收割后 2周 ~ 3周干燥环境下 ,仍不能阻止花的形成 。

　　A.4 分布

　　原产南北美洲 ,能适应不同的气候带 ,1901年 ,首次记录于澳大利亚新南威尔士州(NSW) ,现已遍布各大洲 。在维多利亚 ,银毛龙葵分布于年降雨量在 300 mm~ 560 mm 的许多地区 。 目前在美国 、墨西哥 、阿根廷 、澳大利亚 、巴西 、智利 、希腊 、法国 、西班牙 、印度 、南非 、印度 、中国台湾均有分布 。

　　A.5 传播途径

　　短距离传播靠营养体 ;可由风 、水 、机械 、鸟类 、动物(或内部或外部)携带种子进行长距离传播 ,种子经绵羊的消化道后大约 10%依然可以保持活力 。带有成熟果实的死亡植株 ,种子从母体脱落后 , 常由风传播 。根的各个部分都能形成枝芽 ,1 cm 左右的根 ,就可生出新枝 。

　　A.6 危害

　　银毛龙葵能和众多农作物竞争水分和营养 ,严重侵害棉花 、苜蓿 、高粱 、小麦和玉米等农作物生产 ,这种侵害对于干旱地带更加严重 。在摩洛哥如果不经任何防治措施 ,该物种可造成玉米减产 64% ,棉花减产 78% ;在澳大利亚被其侵染的小麦可减产 12% ~ 50% ,在沙质土地或者在旱季减产更加严重 ;在美国水分充沛的地区 ,高粱和棉花可分别减产 4% ~ 10%、5% ~ 14% ,在半干旱条件下可造成棉花减产75% 。银毛龙葵还显示出化感作用 ,对农作物特别是棉花和牧草造成很大的危害 。银毛龙葵植物体所有部分 ,特别是成熟后的果实对动物有毒害作用 。其作用原理是果实内的生物碱和糖类结合成的糖苷生物碱在消化道内水解生成神经毒素 。 中毒的典型症状是呼吸困难 、流鼻涕 、颤抖和腹泻 。牲畜对于该毒素的抵抗力也不一致 ,一般牛比绵羊更易受到毒害 ,而山羊受到的影响很小 。该物种口感一般 ,牲畜通常在食物短缺的时候才会取食 。 除此之外 ,该糖苷生物碱还和化感作用相关 ,有学者发现棉花和莴苣种子的萌发率和根的生长都受到银毛龙葵植物体水提液的抑制 。银毛龙葵是很多植物病原体的寄主 ,比如烂根病菌(Rhizoctonia solaniKuehn) 和枯萎病菌(Verticillium albo-atrum Reinke& Berth) ; 在突尼斯 ,它被报道是 Potato virus Y (PVY) 繁殖和传播的重要媒介 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　银毛龙葵分子鉴定方法

　　B. 1 PCR反应

　　B. 1. 1 样品

　　待测疑似银毛龙葵样品 ;不同来源的标准的银毛龙葵样品不少于 3 份 ;银毛龙葵近缘种样品不少于3种 ,每种不少于 3份 ;外类群样品不少于 1种 1份 ;根据 Levin的茄亚属系统选取近缘种和外类群 。[银毛龙葵的 waxy序列在 Genbank上公布(序列号 :KC469867-KC469870) ,另外根据最近的茄属系统学资料 ,银毛龙葵近缘种为 S.hindsianum 和 S.tridynamum,其 waxy序列号分别为 AY996424,AY996474。]

　　B. 1.2 DNA模板的制备

　　无菌操作下 ,取新鲜叶片 100 mg或取经硅胶干燥的植物叶片 20 mg或种子 3 粒 ~ 5 粒 ,用液氮研磨后使用植物基因组 DNA提取试剂盒提取总 DNA,测定 DNA浓度 , -20 ℃保存备用 。

　　B. 1.3 引物

　　WAXYS:5'-ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATCG-3'

　　WAXYA2:5'-TGG AACCAA CAT AAA ATCAGC-3'

　　B. 1.4 反应体系与反应条件

　　反应体系为 25μL:去离子水 16μL,10×缓冲液 2. 5 μL, 10× dNTP 2. 0μL, 引物 (5 μmol/L) 各1. 25μL, Taq酶 0. 125 μL, DNA 模板(底物)2μL(50 ng~ 200 ng) 。

　　PCR反应条件 :94 ℃预变性 3 min; 94 ℃ , 30 s; 52 ℃ , 30 s; 72 ℃ , 1. 5 min;进行 36个循环 ; 最后72 ℃延伸 10 min。

　　B.2 数据分析

　　序列使用 ContigExpress (Informax,Inc. )检测峰图 ,去除两端低质量的序列区并将正反序列拼接 。利用 ClustalX进行多序列比对 ,并辅以 Bioedit version 7 人工调整 。使用 Mega4. 0 计算序列的变异信息和 K2P遗传距离并构建 NJ系统发生树 ,1 000个重复 。根据 Levin的茄亚属系统 ,选择在演化关系上与 S. elaeagnifolium 所 在 的 支 系 (Elaeagnifolium Clade) 最 为 近 缘 的 支 系 (如 Androceras Clade、 Acanthophora Clade、Lasiocarpa Clade、Robustum Clade)中的 1个 ~ 2 个物种作为外类群 。外类群所使用的 DNA序列与内群相同 。根据 NJ树系统发育关系结果采用 Taxon DNA 软件对银毛龙葵以及和它亲 缘 关 系 最 近 的 几 个 物 种 进 行 种 间 和 种 内 变 异 统 计 分 析 , 分 别 使 用 EXCEL 和 MVSP (http://www. kovcomp. co. uk/mvsp/index. html)构建种间和种内变异的柱状图和散点图。

　　B.3 PCR 结果判定

　　完全符合下列鉴定结果的可以判定待测样品为银毛龙葵 ,否则判定为未检出银毛龙葵 :

　　a) 待测种与银毛龙葵标准种在 NJ树上聚为单系 ;

　　b) 待测种与银毛龙葵标准种在散点图上聚一起 ,而与其他种距离较远 ;

　　c) 待测种与银毛龙葵组成的样本与其他物种之间存在明显的条形码间隔 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　银毛龙葵形态特征图

　　图 C. 1 银毛龙葵植株形态特征图

　　图 C.2 银毛龙葵叶片形态特征图

　　图 C.3 银毛龙葵茎形态特征图

　　图 C.4 银毛龙葵花形态特征图

　　图 C.5 银毛龙葵浆果形态特征图

　　图 C.6 银毛龙葵种子形态特征图

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　银毛龙葵近似种基本信息及形态特征图表

　　D. 1 银毛龙葵近似种基本信息及形态特征图

　　D. 1. 1 S.ellipticum R. Br. 的基本信息

　　多年生的小灌木或草本植物 ,主要发生在春夏季 ,广泛分布于澳大利亚中部的干旱地区 。植株高约30 cm ,茎部带刺 , 叶卵形至椭圆形 ,长 4 cm~ 8 cm ,宽 2 cm~ 3 cm , 叶缘常呈扇形 , 叶面通常绿色 、叶背面呈灰绿色 , 叶柄长 1 cm~ 8 cm。 紫色花冠直径约 2 cm~ 3 cm , 黄色花药长约 25 mm , 花梗通常 长15 mm~ 20 mm ,浆果直径 15 mm~ 20 mm ,浅黄色 ,往往略带紫色 。形态特征图见图 D. 1。

　　注: 引自 http://florabase.dec.wa.gov. au。

　　图 D. 1 S.ellipticum 植株

　　D. 1.2 S.esuriale Lindl. 的基本信息

　　多年生草本 ,花期 3 月 ~ 7月 ,喜砂质黏土 ,分布于沿海 、平原和盐碱地 。植株高约 10 cm~ 45 cm ,灰绿色 ,密布星状毛 ,花蓝紫色 , 叶片椭圆形或批针状椭圆形 ,长 2 cm~ 8 cm , 宽 5 mm~ 15 mm ,微扇形 ,基部叶片长达到 10 cm , 宽 3 cm , 浅 裂 , 叶 柄 长 5 mm~ 10 mm , 有 时 达 20 mm;花 序 梗 长 1 cm~ 4 cm ,花药粗短 ,长约 4 cm~ 5 cm。球状浆果 ,直径 10 mm~ 15 mm ,浅黄色或淡黄褐色 ,种子 2 mm~ 3 mm ,浅黄褐色 。形态特征图见图 D. 2。

　　注: 引自 http://florabase.dec.wa.gov. au。

　　图 D.2 S.esuriale Lindl.植株

　　D. 1.3 北美刺龙葵(S.carolinenseL. )的基本信息

　　多年生草本 ,株高达 1 m ,全株被刺 ,疏被星状毛 ,茎绿色或紫色 ,根状茎粗壮 。 叶片形态变异较大 ,典型的为披针形状卵形 ,常具 叶 裂 , 长 达 20 cm , 宽 达 7 cm , 叶 脉 具 刺 , 叶 片 疏 被 星 状 毛 , 具 叶 柄 , 长 约2 cm ,具刺 。浆果黄色 ,球 形 , 直 径 1. 2 cm ~ 1. 8 cm。 花 冠 白 色 至 紫 色 , 花 药 5, 黄 色 。 种 子 2 mm ~ 3 mm ,倒卵形 ,扁平 ,有光泽 ,表面颗粒状 ,黄色至淡黄色 。形态特征图见图 D. 3 和图 D. 4。

　　图 D.3 北美刺龙葵植株

　　图 D.4 北美刺龙葵种子

　　D.2 银毛龙葵及近似种形态对照表

　　银毛龙葵及近似种形态对照见表 D. 1。

　　表 D. 1 银毛龙葵及近似种形态对照表

　　参 考 文 献

　　[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志第 67(1)卷[M] . 北京 :科学出版社 ,1978:64.

　　[2] 詹姆斯 · 吉 · 哈里斯等 . 图解植物学词典[M] . 王宇飞等译 . 北京 :科学出版社 ,2001.

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　　[4] 可从以下网址获得:。

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