GB/T 40626-2021 杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40626—2021

　　杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofxanthomonaspopuli(exRidi1958)

　　Ridi&Ridi1992

　　2021-10-1 1 发布 2022-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40626—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：天津海关动植物与食品检测中心、南京农业大学。

　　本文件主要起草人：胡佳续、姜一、刘鹏、魏亚东、田艳丽、胡白石。

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　　杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了杨树细菌性溃疡病菌的症状检查、分离培养、生化特征测定和分子鉴定的方法。

　　本文件适用于进出境杨树苗木等植物材料中携带杨树细菌性溃疡病菌的检疫、检测和鉴定，以及田间调查和病害监测工作。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

　　SN/T 2601 植物病原细菌常规检测规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 病菌分类信息

　　中文名：杨树细菌性溃疡病菌

　　学名：xanthomonaspopuli (ex Ridé1958) Ridé& Ridé1992

　　异名：Aplanobacterpopuli Ridé1958

　　Aplanobacterium populi Ridé

　　xanthomonaspopulisubsp . populi英文名：bacterial canker of poplar

　　分类地 位：变 形 菌 门 ( Proteobacteria) , 变 形 菌 纲 (Gammaproteobacteria) , 黄 单 胞 菌 目 ( Xan- thomonadaceae) ,黄单胞菌科(Xanthomonadaceae) ,黄单胞菌属(xanthomonas)。

　　杨树细菌性溃疡病菌的相关资料参见附录 A。

　　5 方法原理

　　杨树细菌性溃疡病菌的危害症状、菌落形态特征、烟草过敏性反应、生理生化特性，分子生物学特性以及致病性测试是本文件检疫鉴定方法的原理。

　　6 检测流程

　　检测流程见图 1 。

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　　图 1 检测流程

　　7 仪器及用具

　　电子天平(分度值：1/10 000 g)、恒温培养箱、高速冷冻离心机、掌上离心机、纯水仪、生物显微镜、

　　高压灭菌器、聚合酶链反应核酸扩增仪(PCR 仪)、电泳仪、凝胶成像仪、超低温冰箱、紫外分光光度计、

　　加样枪(量程：10 μL、100 μL、1 000 μL)、培养皿、离心管( 1. 5 mL)、PCR 管(0. 2 mL)、一次性注射器(2 mL)、烧杯、三角瓶、镊子、量筒、酒精灯、封口膜、接种环等。

　　8 主要试剂及培养基

　　8 . 1 试剂和材料

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为灭菌蒸馏水。

　　琼脂粉、乙二胺四乙酸(EDTA)、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、氯化钾、葡萄糖、蔗糖、硫酸镁

　　(MgSO4 ·7H2 O)、磷酸氢二钾 (K2 HPO4)、溴酚蓝 (C19 H10 Br4 O5 S)、七叶灵( C15 H16 O9)、柠檬酸铁

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　　(FeC6 H5 O7)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、冰醋酸(C2 H4 O2)、氯化镁(MgCl2)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA 聚合酶(Taq酶)，氧化酶试纸条、细菌微量生化鉴定管、溴化乙锭(C21 H20 N3 Br)、琼脂糖、分子标记(DNA Marker)、氢氧化钾(KOH)等。

　　8 . 2 培养基

　　蔗糖蛋白胨培养基、营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)配制按照附录 B操作。

　　9 检疫鉴定方法

　　9 . 1 症状观察

　　杨树的病害调查或进出境杨树苗木的现场检疫中，若发现枝条皮层产生裂缝，从裂缝中流出灰褐色细菌菌液，或树干出现肿大的、瘤状溃疡斑(见 A. 2 危害情况)，取样带回实验室做进一步分离鉴定。

　　9 . 2 寄主组织分离培养

　　按照 SN/T 2601 要求进行操作。取疑似溃疡病症状的树段进行病原菌的分离培养，表面用 75%酒精消毒后，去除树皮，把内部变色木材切成长度和厚度 3 mm~4 mm 的小块，用无菌水清洗三次。在

　　灭菌离心管中加入少量无菌水，将小块病组织放入无菌水中，并用灭菌研磨棒对小块病组织进行碾压研

　　磨，10 min 后用加样枪吸取 80 μL病组织浸出液，在蔗糖蛋白胨培养基或 NDA 培养基平板上涂布分离，做不少于 5 个平板。平板置于 25 ℃下培养 4 d~5 d后观察，若发现可疑菌落(特征为直径 3 mm~ 4 mm,圆形，轻微凸起，边缘整齐，黄色奶油状)，则挑取单菌落进行纯化培养。

　　若发现染病苗木皮层裂缝流出菌液，可直接用接种环蘸取并在蔗糖蛋白胨培养基或 NDA 培养基

　　平板上划线分离，置于 25 ℃恒温培养箱中进行培养，每份样品做不少于 5 个平板，培养 4 d~5 d后挑取

　　单菌落进行纯化培养。

　　9 . 3 分离菌的鉴定

　　9 . 3 . 1 革兰氏染色反应

　　进行革兰氏染色试验，要设置阳性菌的对照。 若染色结果为革兰氏阴性菌，应进行鞭毛染色试验。

　　革兰氏染色应采用 3%氢氧化钾(KOH)溶液进行检测判断。用牙签挑取新鲜待测菌落放在载玻片上，与 1 滴氢氧化钾溶液混匀，30 s 后用牙签慢慢拉出，有拉丝现象的为革兰氏阴性菌，无拉丝现象为

　　革兰氏阳性菌。

　　9 . 3 . 2 鞭毛染色反应

　　若分离菌经生物显微镜观察发现有鞭毛并且鞭毛极生，继续进行生化指标的检测。

　　9 . 3 . 3 烟草过敏性反应

　　取分离的菌株用无菌水配制成约 108 CFU/mL 菌悬液，用灭菌注射器接种烟草叶片背面，置于25 ℃ 光照培养，24 h~48 h 观察烟草叶片是否出现过敏性坏死反应。若叶片出现枯斑情况则为阳性

　　反应，若出现黄斑或不明显变化则为阴性反应。 同时接种阳性菌株悬液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照。

　　9 . 3 . 4 生化特征测定

　　采用微量生化鉴定管对可疑菌株和杨树细菌性溃疡病菌标准菌株进行生化指标检测，该步骤也可

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　　使用细菌自动鉴定系统等自动化生化指标检测设备。

　　杨树细菌性溃疡病菌的生化指标测定结果若为七叶灵水解阴性，明胶液化阴性，D-木糖、蜜二糖、棉子糖不产酸，能从甘露糖、半乳糖和果糖产酸，则继续进行分子方法鉴定步骤。 生化指标测定方法按照附录 B操作。

　　9 . 3 . 5 分子特异性检测

　　9 . 3 . 5 . 1 DNA模板

　　采用试剂盒提取细菌 DNA。 按照 SN/T 1193 要求进行分子实验的操作。

　　9 . 3 . 5 . 2 PCR特异性检测

　　根据杨树细菌性溃疡病菌 RNA 聚合酶σ-70 因子的编码基因(rp狅D)设计特异性引物，扩增片段大小为 160 bp,检测方法及步骤按照附录 C操作。

　　9 . 3 . 6 致病性测试

　　采用杨树感病品种的离体枝条，试验在控温的室内或培养箱中进行，温度控制在 20 ℃ ~25 ℃。将培养 48 h 的供试菌株用无菌水配制成约 108 CFU/mL菌悬液，将枝条截成约 40 cm 长的段，在枝条中

　　部切割韧皮部形成伤口，用无菌纱布蘸取菌悬液放置于伤口上，并用保鲜膜包裹，起到保湿的作用，同时

　　接种阳性菌株悬浮液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照。5 d 后观察伤口处情况，若发现韧皮部

　　具有软腐症状且有变色情况出现，且在发病组织处分离到供试菌株，则证明供试菌株对杨树有致病性。

　　10 结果判定

　　分离得到的细菌菌株经过初筛试验(菌落形态、革兰氏染色、鞭毛染色、烟草过敏性试验、生化特征测定)步骤检测，若 PCR特异性检测为阴性，则判定未检出杨树细菌性溃疡病菌。 若 PCR 特异性检测为阳性，且致病性测试为阳性，则判定检出杨树细菌性溃疡病菌。

　　1 1 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为杨树细菌性溃疡病菌的菌株，应妥善保存。 将菌株接种于营养葡萄糖

　　琼脂培养基(NDA)斜面上，23 ℃培养 1 d后转入 4℃低温冰箱中保存，定期(约 30 d )转接防止病菌死亡;或用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80 ℃下长期保存。

　　12 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括：样品的种类、来源地、接样(或采样)时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字记录。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　杨树细菌性溃疡病菌相关资料

　　A.1 寄主植物

　　杨属(populus)、银 白杨(populusalba L.)、大叶钻天杨(populusbalsamifera L.)、加拿大杨(populuscanadensis Moench)、美洲黑杨(populusdeltoides Marsh)、黑杨(populusnigra L.)、欧洲山杨(populustremula L.)、白杨(populustremuloides Michx)、毛果杨(populustrichocarpa)、新疆杨(populus alba var. pyramidalis Bunge)、柳 属(salix)、白 柳(salix alba L.)、垂 柳(salix babylonica L.)、黄花柳(salixcaprea L.)、爆竹柳(salixfragilis L.)等。

　　A.2 危害情况

　　杨树细菌性溃疡病最早是于 1934 年在英国首次发现的，随后很快传播至几乎整个欧洲，一直是欧洲杨树生产中普遍而严重的病害。 该病害可严重削弱树木生长，发病严重时可造成树木死亡，病树死亡

　　率一般可达 12.0%~14.2% ,感病树种甚至可达 37% 。病树主干的溃疡斑使木材的加工利用价值大

　　大降低。 该病害还限制了某些栽培性状优良但感病严重的杨树品种和无性系的发展。

　　杨树细菌性溃疡病主要危害 10 年生大树，幼树少见，1~2 年生幼苗不会发生此病，主要危害主干

　　和主枝。 在感染初期，使树干形成椭圆形、光滑的小瘤，肿瘤增大成明显后，其韧皮部和木质部出现变色，夏季开裂流出棕褐色黏液，有臭味。 病菌进入树体后，在寄主的细胞间隙扩散，溶解细胞壁和中胶层，使细胞离解、崩溃，最终形成溃疡斑，枝条皮层产生裂缝，从裂缝中流出灰褐色细菌菌液。 树木生长旺盛期，在病斑周围产生愈伤组织，包围病斑。 病斑发展越过愈伤组织，进一步扩大，如此反复多次在树干出现肿大的、有纵裂的瘤状溃疡斑，剖开病部，可见其下的皮层变褐、腐烂，大型溃疡斑下面木质部的表面也往往变褐，病害发展到后期，形成增生的梭形瘤或长圆柱形瘤，最终木材变色，中心腐烂，整个植株呈秃顶状。 病害主要由雨水、昆虫等传播，经皮孔、伤口侵入危害，发病杨树产生的黏液是重要的侵染源。

　　A.3 症状

　　杨树细菌性溃疡病菌引起的症状见图 A. 1 。

　　图 A.1 杨树细菌性溃疡病菌危害症状

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　　A.4 形态特征

　　杨树细菌性溃疡病菌为革兰氏阴性菌，短杆形或卵圆形，(0.4 μm~0.7 μm) × (0.7 μm~1.8 μm)。单生，不产生聚 β-羟基丁酸盐颗粒，没有鞘或附属物。未知有休眠期。具单根极生鞭毛，以单极毛运动，严格好氧，以分子氧为终端电子受体。不能反硝化或硝酸盐还原反应。最适生长温度 24 ℃ ~26 ℃。

　　在含有葡萄糖的培养基上产生一种多糖黏液，即荚膜。 在多种培养基上可产生黄色色素，色素是极具特征的溴化芳基多烯黄单胞菌素。

　　A.5 生化特性

　　接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，有机化能营养，不还原硝酸盐。 能利用不同的糖和有机酸盐作为唯一的碳源。 可利用多种糖产生少量酸，石蕊牛奶中不能产酸，能使甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖发酵产酸，不能液化明胶，可利用乳酸钙而不能利用谷氨酰胺生长，不能利用天门冬酰胺作为唯 一

　　的碳源和氮源。0.1%(通常为 0.02%)氯化三苯四唑能抑制生长。通常必需的生长因子包括蛋氨酸、谷氨酸、核酸或其混合物。DNA 的碱基(G+C) 摩尔分数为 62.1%~65.6% 。

　　A.6 分布情况

　　杨树细菌性溃疡病是杨树重要检疫性细菌病害，主要危害杨树枝干，产生溃疡斑，降低木材品质，导致树木死亡。 该病害在欧洲、北美、亚洲、大洋洲均有分布，在我国未见报道。

　　A.7 传播途径

　　病菌溃疡斑内越冬，春季病斑内细菌开始活动，细菌溢流出树皮外，借风雨、流水、昆虫和人为活动传播，远距离传播主要是带菌苗木、接穗等。 昆虫能携带病菌，在传病过程中也起了重要作用。 人工接

　　种病菌的蚜虫和其他昆虫的传病试验已得到证实。从蛀虫(cypsonomaaceriana)的虫瘿上和取食幼树的白杨透翅蛾(sciapterontabaniformis)的消化道里及排出的粪便上均检查出该病菌，因而推断，这些

　　昆虫很可能是传病的媒介，而土壤可能是病菌的 自然栖息场所。

　　A.8 种以下阶元分类

　　目前杨树细菌性溃疡病菌[xanthomonaspopuli (ex Ridé1958) Ridé& Ridé1992]存在两个亚种，即 xanthomonaspopulisubsp. populi和 xanthomonaspopulisubsp. salicis，其中后者是 1977 年M. De Kam 在荷兰的一种柳树(salixdasyclada)上发现的病原菌，根据国际细菌命名法规，作为一个亚种并入杨树细菌性溃疡病菌(xanthomonaspopuli)，两个亚种可以通过寄主植物、菌落形态、有无运

　　动性、耐盐性高低及生化指标等加以区分。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　培养基的配制和生化指标测定方法

　　B.1 培养基

　　B.1 . 1 蔗糖蛋白胨培养基

　　蛋白胨 5 g,硫酸镁 0.25 g,蔗糖 20 g,磷酸氢二钾 0.5 g,琼脂粉 18 g,蒸馏水 1 000 mL。调整 pH值至 7.2~7.4 , 121 ℃湿热灭菌 15 min。

　　B.1 . 2 营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)

　　牛肉浸膏 3 g,蛋白胨 5 g,酵母膏 2 g,葡萄糖 10 g,氯化钠 5 g,琼脂粉 18 g,蒸馏水 1 000 mL。调整 pH 值至 7.2~7.4 , 121 ℃湿热灭菌 15 min。

　　B.1 . 3 营养琼脂培养基(NA)

　　牛肉浸膏 3 g,蛋白胨 10 g,氯化钠 5 g,琼脂粉 18 g,蒸馏水 1 000 mL。调整 pH 值至 7.2~7.4 , 121 ℃ 湿热灭菌 15 min。

　　B.1 . 4 休和利夫森二氏培养基

　　蛋白胨 2 g,氯化钠 5 g ,葡萄糖 10 g,磷酸氢二钾 0.2 g,琼脂粉 6 g,溴酚蓝(先用少量 95%乙醇溶解后，再加水配成 1%水溶液)3 mL,蒸馏水 1 000 mL。调整 pH 值至 7.2 , 121 ℃湿热灭菌 15 min。

　　B.1 . 5 明胶蛋白胨培养基

　　蛋白胨 5 g,明胶 12 g,蒸馏水 1 000 mL。调整 pH 值至 7.2~7.4 , 121 ℃湿热灭菌 20 min。

　　B.2 生化指标测定

　　B.2 . 1 七叶灵水解

　　在营养琼脂培养基中添加 0. 1%的七叶灵和 0.05%的柠檬酸铁。分装试管斜面，121 ℃湿热灭菌20 min。取培养 24 h 的菌种接种后，25 ℃下培养 5 d 后观察，若有黑褐色色素产生为阳性，否则为

　　阴性。

　　B.2 . 2 明胶液化

　　取培养 24 h 的菌种穿刺接种明胶蛋白胨培养基，25 ℃下培养 7 d 后观察是否有明胶液化情况出

　　现 。若有液化出现则为阳性，无液化为阴性。

　　B.2 . 3 产酸试验

　　以休和利夫森二氏培养基为基础，使用 1% D-木糖、1%蜜二糖、1%棉子糖、1%甘露糖、1%半乳糖和 1%果糖分别代替葡萄糖配制成相应培养基，取分离物菌株分别穿刺接种于上述培养基中，24 ℃下培养 1 d、3 d、5 d后观察，如指示剂变黄，表示产酸，即为阳性;不变或变蓝(紫)为阴性。

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　分子方法鉴定

　　C.1 PCR特异性引物序列

　　F: 5’-AGCGGCGGACAACGACGACGCG-3’

　　R: 5’-TTTATGCGCTTGGTAATCGGCG-3’

　　C.2 反应程序

　　PCR 扩增条件为：95 ℃ , 5 min ; 94 ℃ , 30 s ; 60 ℃ , 30 s ; 72 ℃ , 30 s ; 35 个循环;72 ℃ , 5 min。 用 2%

　　琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像观察目的条带。扩增片段大小为 160 bp。