GB/T 40472-2021 柱锈菌科实时荧光PCR检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40472—2021

　　柱锈菌科实时荧光 PCR检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofCronartiaceaeusingreal-timePCR

　　2021-08-20 发布 2022-03-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40472—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌鲁木齐海关。

　　本文件主要起草人：段维军、蔡磊、赵鹏、郭立新、刘芳、李雪莲、张永江、张慧丽、王狮、陈先锋。

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　　柱锈菌科实时荧光 PCR检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了植物病原真菌柱锈菌科的实时荧光聚合酶链式反应(以下简称实时荧光 PCR) 检疫鉴定方法。

　　本文件适用于携带柱锈菌科病菌的植物及其产品中柱锈菌科病菌的检测筛查。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 基本信息

　　学名：Cronartiaceae

　　中文学名：柱锈菌科

　　分类地位：隶属于真菌界 (Fungi), 担子菌门 (Basidimycota), 柄锈菌纲 (Pucciniomycetes), 柄锈菌目 (Pucciniales)。

　　传播途径：柱锈菌科主要由种苗或病残体等传播，也可经风、雨水和昆虫传播。

　　柱锈菌科基本信息参见附录 A。

　　5 鉴定原理

　　根据柱锈菌科病菌的 DNA序列特征，采用实时荧光 PCR 方法，应用所设计引物和探针对柱锈菌科病菌进行检测鉴定。

　　6 仪器和试剂

　　6 . 1 仪器设备、实验用具

　　天平、研钵、水浴锅、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、冰箱、实

　　时荧光 PCR仪、微量移液器(0.1 μL~2.5 μL, 1 μL~10 μL, 10 μL~50 μL, 20 μL~200 μL, 100 μL~ 1 000 μL)。

　　6 . 2 试剂

　　十六烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB) 提 取 液 ( 2% CTAB, 1. 4 mol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/ L Tris · HCl pH 8 . 0)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙

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　　醇、次 氯 酸 钠、核 糖 核 酸 酶 ( RNase)、实 时 荧 光 PCR 反 应 预 混 液：2 × Taq Man Universal PCR

　　Master Mix。

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

　　7 检疫鉴定

　　7 . 1 样品的采集与处理

　　挑取感病材料放置在 2 mL 离心管内，加入 100 μL 左右无菌水混匀并震荡 1 h, 获得疑似植物样品。

　　7 . 2 核酸的制备

　　DNA提取方法按照附录 B 中 B. 1 的要求执行。

　　7 . 3 DNA纯度与浓度的测定

　　用紫外分光光度计测定 DNA 的纯度与浓度，分别读取 260 nm 和 280 nm 处 的 吸 收 值(计 为OD260 和 OD280)。DNA 的 纯 度 OD260/OD280 比 值 应 为 1. 7 ~ 1. 9 , DNA 的 浓 度 为 50 倍 的

　　OD260(μg/mL) 。DNA 的浓度与纯度应符合实时荧光 PCR检测的要求。

　　7 . 4 实时荧光 PCR检测

　　实时荧光 PCR按照 B. 2~B. 4 的方法检测。

　　8 结果判定

　　以疑似样品的实时荧光 PCR检测结果作为鉴定依据。

　　阳性、阴性和空白对照正常，出现典型扩增曲线，且 Ct 值 ≤35,判定为阳性;35≤Ct 值 ≤40,增加DNA用量 2 倍 ~10 倍再次测试，出现典型扩增曲线，且 Ct值≤35,判定为阳性;其余情况判定为阴性。

　　9 样品保存与复核

　　9 . 1 样品保存与结果记录

　　保存植物样品应烘干之后置于 2 ℃ ~8 ℃冰箱妥善保存，对送检的样品应至少保存 6 个月，以备复检、谈判和仲裁。

　　记录包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。 保存实时荧光 PCR检测阳性结果的照片。

　　9 . 2 复核

　　由指定的单位或人员负责，主要考察实验原始数据记录及实时荧光 PCR检测结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　柱锈菌科基本信息

　　柱锈菌科现有有效种 20 种 。为转主寄生真菌，具有全循环生活史，其性孢子阶段和锈孢子阶段寄生在松树上，而夏孢子阶段和冬孢子阶段主要寄生于双子叶植物的八个科，即虎耳草科(Saxifagaceae) ,

　　玄参科(Scrophulariaceae), 萝蘼科 (Asclepiadaceae), 龙胆科 (Gentianaceae), 芍药科 (Paeoniaceae), 壳斗科(Fagaceae), 杨梅科(Myricaceae) 和檀香科(Santalaceae)。

　　柱锈菌科内共有 6 种检疫性真菌，包括油松疱锈病菌(C.coleosporioides Arthur)、北美松疱锈病菌(c.comandrae Peck)、松球果锈病菌 [C.conigenum (Pat.) Hedgc. & N. R. Hunt]、松纺锤瘤锈病菌 (C.fusiformeHedgc. & N. R. Hunt ex Cummins)、松疱锈病菌 (C.ribicolaA. Dietr.) 以及松瘤锈病菌 [C.harknessii，synonym of Endocronartiumharknessii(J.P.Moore) Hirats.]。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　DNA提取方法及实时荧光 PCR检测方法

　　B.1 DNA提取方法

　　将灭菌的钢珠放在收集样品的 2 mL 离心管中，将处理过的疑似植物样品加入 400 μL 2 × CTAB (60 ℃),置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温 60 min,偶尔震荡混匀;加入 400 μL三氯甲烷和异戊醇混合液(24 ∶ 1),均匀混合 3 min 后，12 000 r/ min 离心 15 min,取上清液至另一离心管中;加入等体积三氯甲烷和异戊醇混合液(24 ∶ 1),轻轻颠倒混匀，12 000 r/min离心 10 min,取上清液至另一离心管中;向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于 4 ℃或- 20 ℃沉淀 1 h, 12 000 r/ min离心10 min,弃去上清液，加 500 μL 70%乙醇悬浮沉淀;12 000 r/min离心 5 min,弃上清，窒温干燥，加

　　50 μL无菌水或 TE 缓冲液( 10 mmol/L Tris. HCl, 1 mol/L EDTA pH 8. 0) 溶解沉淀，- 20 ℃贮存

　　备用。

　　B.2 引物及探针序列

　　正向引物 Cro-F: 5′-GCACTTTATTGTGGCTCTAAACCTT-3′;

　　反向引物 Cro-R: 5′-AACGTACTGTTGAGATGCTATACCAAA-3′;

　　探针 Cro-P: 5′-FAM-CAAAGTTGTTATGTGTGCCTT-MGB-3′;

　　探针 5′端含有 FAM报告荧光染料，3′端含有不发荧光的淬灭基团并具有 MGB分子。

　　B.3 扩增体系

　　实时荧光 PCR 扩增反应体系为：2 × TaqMan Universal PCR Master Mix12. 5 μL、引物 Cro-F/ Cro-R各 0.4 μmol/L、探针 Cro-P 0.2 μmol/L,加水补足后反应总体积为 25 μL。将反应体系混合均匀

　　后置于荧光 PCR仪中进行反应。 以含柱锈菌科的 DNA 作阳性对照、不含柱锈菌科的 DNA 作阴性对照，以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置 3 个重复。

　　B.4 扩增反应条件

　　扩增反应条件为：95 ℃ 10 min;然后 94 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s,共 40 个循环。

　　注：DNA模板的取量根据 DNA 的提取浓度纯度而调节。 不同仪器可根据仪器要求将反应参数做适当调整。

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　　参 考 文 献

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