GB/T 40457-2021 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40457—2021

　　咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofcolletotrichumkahawaeJ.M.waller& Bridge

　　2021-08-20 发布 2022-03-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

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　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津海关。

　　本文件主要起草人：段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、张慧丽、赵鹏、廖芳、陈先锋。

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　　咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了咖啡浆果炭疽病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法。

　　本文件适用于携带咖啡浆果炭疽病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭疽病菌的检测。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 分类信息

　　中文名：咖啡浆果炭疽病菌

　　学名：colletotrichum kaha∞aeJ.M. Waller & Bridge

　　分类地位：真菌界(Fungi) ,子囊菌门(Ascomycota) ,盘菌亚门(Pezizomycotina) ,粪壳菌纲(Sordar- iomycetes),肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae) ,小丛壳 目(Glomerellales) ,小丛壳科(Glomerellaceae) ,刺盘孢属(colletotrichum)。

　　分布、寄主、传播途径等信息见附录 A。

　　5 鉴定原理

　　根据咖啡浆果炭疽病菌在寄主植物上的症状，抽取可疑样品进行病原菌分离培养，按照病原菌的形态特征和实时荧光 PCR 特异性反应进行鉴定。

　　6 仪器设备、器具、试剂和培养基

　　6 . 1 仪器设备和器具

　　高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、冰箱、生化培养

　　箱、实时荧光 PCR仪、紫外分光光度计、微量移液器(0. 1 μL~ 2. 5 μL、1 μL~ 10 μL、10 μL~ 50 μL、 20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL)、研钵、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片、灭菌滤纸。

　　6 . 2 试剂

　　十六烷基三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB) 提 取 液 ( 2% CTAB, 1 . 4 mol/ L NaCl, 20 mmol/ L EDTA, 100 mmol/L Tris · HCl pH 8.0)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75% 乙醇、RNA 酶、超纯水、实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR) 反应预混液：2 × TaqMan Universal

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　　PCR Master Mix(宜使用，亦可自行配制)。

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

　　6 . 3 培养基

　　麦芽汁培养基(MEA)：麦芽汁 20 g,蛋白胨 3 g,琼脂 20 g,加蒸馏水配制 1 L。配成溶液后 121 ℃下灭菌 20 min。

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂粉 20 g,加蒸馏水配制 1 L。配成溶液后 121 ℃下灭菌 20 min。

　　7 检疫鉴定

　　7 . 1 分离培养

　　切取发病材料病健交界处的植物组织(约 0 .3 cm×0 .3 cm) ,用 75%乙醇浸泡 1 min进行表面消毒，

　　无菌水冲洗 3 次后置于灭菌滤纸上，吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基(MEA)的培养皿中。 培养皿

　　放置在温度为 25 ℃条件下光照培养箱中培养(光照和黑暗各 12 h 交替)。培养 4 d~6 d 后，挑取可疑

　　菌落边缘的菌丝进行纯化培养。

　　7 . 2 形态学观察

　　显微镜观察孢子的形态特征、产孢方式。 观察记录菌落的直径、颜色、分生孢子和附着胞的形成情况等(见图 A. 2) 。

　　7 . 3 DNA 制备

　　DNA制备按照附录 B 的方法提取。

　　7 . 4 DNA纯度与浓度的测定

　　用紫外分光光度计测定 DNA 的纯度与浓度，分别读取 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，计为 OD260 、OD280 。DNA 的纯度 OD260/OD280 比值应为 1.7~1.9 , DNA 的浓度为 50 倍的 OD260(μg/mL)。 DNA 的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测的要求。

　　7 . 5 实时荧光 PCR检测

　　实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法按照附录 C 的方法检测。

　　8 鉴定特征

　　8 . 1 症状

　　该病害可以发生在咖啡树生长的所有阶段，主要危害咖啡浆果，造成果实脱落，偶尔侵染叶片。 浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物。 病叶上可见褐色炭疽状病斑，其上有许多黑色小点(病原菌的分生孢子)排列成同心轮纹(见图 A. 1) 。

　　8 . 2 鉴定特征

　　在温度为 25 ℃下，咖啡浆果炭疽菌培养物在 2 %麦芽汁培养基(MEA)平板上生长 7 d 后，菌落直

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　　径可达 14 mm~28 mm,正面灰色至深橄榄灰色，背面深绿色。继代培养的菌落的颜色发生变化，多为灰白色或棕色。分生孢子着生 于菌丝上，直立，圆柱形，无分 隔，两端钝 圆，( 12. 5 μm~ 19 μm) × (4 μm~5 μm)。附着胞浅褐色至褐色，圆形或不规则，( 8 μm~ 9. 5 μm) × ( 5. 5 μm~ 6. 5 μm)(见

　　图 A. 2) 。

　　8 . 3 实时荧光 PCR鉴定

　　在阴性对照、空白对照正常的情况，则有如下判定：

　　— 样品无 Ct值并且无扩增曲线，判定为阴性;

　　— 样品 Ct值≤35.0,且出现典型的扩增曲线，判定为阳性;

　　— 样品 Ct值在 35.0~40.0 之间时，应重新提取样品 DNA进行扩增检测。重做 Ct值大于 40,判为阴性;否则判为阳性;

　　— 样品 Ct值大于 40 时，判定为阴性。

　　9 结果判定

　　若症状明显符合 8 . 1 鉴定特征，且培养物培养特征符合 8 . 2 鉴定特征，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。

　　若症状不明显，但培养物培养特征符合 8 . 2 鉴定特征，且实时荧光 PCR 检测结果为阳性，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。

　　10 样品保存、记录与复核

　　10 . 1 样品保存、记录

　　保存样品应置于 2 ℃ ~8 ℃冰箱妥善保存，对检出咖啡浆果炭疽病菌的样品应至少保存 6 个月。菌株保存于 4 ℃冷藏箱，核酸样品保存于-20 ℃或-80 ℃冰箱。以备复检、谈判和仲裁。

　　分离到的咖啡浆果炭疽病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中妥善保存。

　　记录包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有试验人员的签字。 实时荧光 PCR要有检测阳性结果照片。

　　10 . 2 复核

　　由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光 PCR结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　咖啡浆果炭疽病菌基本信息

　　A.1 地理分布

　　非洲：安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非共和国、刚果(金)、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺达、南非、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦。

　　中美洲：古巴。

　　欧洲：意大利。

　　A.2 寄主

　　咖啡，包括小粒种 coffeaarabica、中粒种 coffeacanephora和大粒种cofealiberica。

　　A.3 传播途径

　　染病浆果为初侵染源，也可借助人类耕作活动、鸟类、昆虫、雨水等进行传播，远距离传播通过带病植株相关贸易进行传播。

　　A.4 危害情况

　　咖啡浆果炭疽病是一种毁灭性的病害，主要危害小粒种咖啡的绿色浆果和叶片，极易造成果实脱

　　落，并可使咖啡果实产量损失 50%~80%。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，

　　暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物(见图 A. 1) 。

　　图 A.1 咖啡浆果炭疽病菌危害咖啡叶片和浆果的病害症状(引自 walleretal.1993)

　　A.5 形态特征

　　咖啡浆果炭疽病菌培养物形态特征图见图 A. 2 。

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　　说明：

　　A~B — 附着胞;

　　C — 分生孢子;

　　D~F — 不同菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养 10 d 的菌落形态，上为正面、下为反面。注：C上标尺为 20 μm,适用于 A~B。

　　图 A.2 咖啡浆果炭疽病菌的形态特征(引自 weiretal.2012)

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取 DNA方法

　　B.1 收集培养分离得到的菌丝或植物材料放入 1.5 mL离心管中，加入 0.2 g石英砂或 4 粒~5 粒玻璃珠和 100 μL 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)抽提液，用破碎仪或无菌玻璃杵碾碎菌丝体或植物材料。

　　B.2 加入 500 μL 65 ℃预热的 CTAB抽提液，颠倒混匀后于 65 ℃水浴 0.5 h~1 h。

　　B.3 冷却至室温后，12 000 r/min 离心 10 min,取上清液至另一离心管中。

　　B.4 加入 1/2 体积(300 μL)的三羟甲基氨基甲烷(Tris)饱和酚及 1/2 体积(300 μL)的氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1) ,颠倒混匀后静置至其开始分层。

　　B.5 12 000 r/ min 离心 10 min,取上清液至另一离心管中。

　　B.6 可重复 B.4 至 B.5 步 2 次~3 次，视两相界面处杂质的多少而定。

　　B.7 加入等体积氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1) ,轻轻颠倒混匀。

　　B.8 12 000 r/ min 离心 10 min,取上清液至另一离心管中。

　　B.9 向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于 4 ℃或-20 ℃沉淀 1 h。

　　B.10 12 000 r/min 离心 10 min,弃去上清液，加 500 μL 70%乙醇悬浮沉淀。

　　B.1 1 12 000 r/ min 离心 5 min,弃上清，室温干燥。

　　B.12 加 50 μL无菌水或三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris EDTA, TE) 缓冲液[配方：1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 1 mL, 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 0.2 mL,加超纯水定容至 100 mL]溶解沉淀， -20 ℃贮存备用。

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　实时荧光 PCR方法

　　C.1 引物及探针序列

　　正向引物 CK-GF: 5′-CTGCATCTGGTAGACAAGAAGGT-3 。

　　反向引物 CK-GR: 5 -AGAGCGAGTCAGTAAATGTGACAG-3′。

　　探针 CK-GP: 5′-CCCATGATTTCAATTCACATCAAGTCAAG-3′。

　　TaqMan探针(CK-GP)采用 5′末端 FAM(6-carboxy-fluorescein)标记作为荧光报告染料，3′末端TAMRA(6-carboxy-tetramethhylrhodamine)标记作为荧光淬灭染料。

　　C.2 反应体系

　　PCR扩增反应体系(总体积为 25 μL) :2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 μL、引物 CK- GF/CK-GR各 0.4 μmol/L、探针 CK-GP 0.2 μmol/L, DNA模板 2 μL,加入去离子水补齐 25 μL。将反

　　应体系混合均匀后置于荧光 PCR仪中进行反应。

　　以咖啡浆果炭疽病菌 DNA作阳性对照、不含咖啡浆果炭疽病菌的 DNA 作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置 3 个重复。

　　C.3 扩增条件

　　反应条件为：95 ℃ 10 min;然后 94 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s,共 40 个循环。

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　　参 考 文 献

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