GB/T 40455-2021 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40455—2021

　　蓝莓休克病毒检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofBlueberryshockvirus

　　2021-08-20 发布 2022-03-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40455—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院果树研究所、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学、中华人民共和国厦门海关。

　　本文件主要起草人：沈建国、谢丽雪、张永江、蔡伟、陈细红、李韬、高芳銮、李敏、廖富荣。

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　　蓝莓休克病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件规定了蓝莓休克病毒(Blueberryshock℃irus)的检疫鉴定方法。

　　本文件适用于可能携带蓝莓休克病毒的蓝莓检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 蓝莓休克病毒分类信息

　　中文名：蓝莓休克病毒。

　　学名：Blueberryshock℃irus，缩写：BlShV。

　　分类地位：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilar℃irus)。

　　蓝莓休克病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录 A。

　　5 方法原理

　　蓝莓休克病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 根据 BlShV 与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、免疫层析试纸条检测;根据 BlShV基因组特征进行巢式 RT-PCR、免疫捕获巢式 RT-PCR、实时荧光 RT-PCR检测;通过这些方法的有效组合，判断样品是否携带 BlShV。

　　6 仪器、用具及试剂

　　6 . 1 仪器

　　高速冷冻离心机、高压灭菌锅、电子天平(感量 0 . 001 g)、酶标仪、PCR仪、实时荧光 PCR仪、水平电泳系统、常规冰箱、超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH 计、恒温水浴锅等。

　　6 . 2 用具

　　研钵、酶联板、离心管、PCR反应管、各种量程的可调移液器(2.5 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL,

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　　1 000 μL)和可调移液器枪头等。

　　6 . 3 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 DAS-ELISA检测试剂应符合附录 B 的要求;免疫层析试纸条检测试剂应符合附录 C 的要求;巢式 RT-PCR 检测试剂应符合附录 D 的要求;免疫捕获巢式 RT-PCR检测试剂应符合附录 E 的要求;实时荧光 RT-PCR 检测试剂应符合附录 F 的要求。

　　7 抽样和样品制备

　　7 . 1 抽样

　　尽量抽取有 病 毒 危 害 症 状 的 植 物 材 料，BlShV 的 危 害 症 状 描 述 参 见 附 录 A;抽 样 方 法 按 照SN/T 2122中规定执行。

　　7 . 2 样品制备

　　称取 0.5 g~1.0 g待测样品按 1 ∶ 10(w/v)加入抽提缓冲液研磨，4 ℃下 8 000 g离心10 min,上清

　　即为样品提取液，用于 DAS-ELISA、免疫层析试纸条、巢式 RT-PCR、免疫捕获巢式 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR检测。

　　8 检测鉴定

　　8 . 1 DAS-ELISA检测

　　以含 BlShV材料作为阳性对照，以不含 BlShV 的健康植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品一致)作为阴性对照，同时以样品抽提缓冲液作为空白对照，具体检测方法见附录 B。

　　8 . 2 免疫层析试纸条检测

　　免疫层析试纸条检测的对照设置同 8 . 1,具体检测方法见附录 C。

　　8 . 3 巢式 RT-PCR检测

　　巢式 RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同 8 . 1,同时以 ddH 2 O代替模板作为空白对照，具体检测方法见附录 D。 如采用商品化一步法试剂盒，则 cDNA合成和第 1 轮 PCR按照试剂盒说明进行。

　　8 . 4 免疫捕获巢式 RT-PCR检测

　　免疫捕获巢式 RT-PCR检测的对照设置同 8 . 1,具体检测方法见附录 E。 如采用商品化一步法试剂盒，则 cDNA合成和第 1 轮 PCR按照试剂盒说明进行。

　　8 . 5 实时荧光 RT-PCR检测

　　实时荧光 RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同 8 . 1,同时以 ddH 2 O代替模板作为空白对照，具体检测方法见附录 F。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。

　　8 . 6 序列测定与比对

　　PCR产物纯化后，直接测序或者克隆测序，利用 NCBI 网站上的 BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知 BlShV序列进行比对。

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　　9 结果判定

　　样品检测时，检测结果判定按下述原则进行：

　　— 样品血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析试纸条)初筛结果为阳性，且任一种分子生物学方法(巢式 RT-PCR、免疫捕获巢式 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR)检测结果为阳性，则判定为检出 BlShV。

　　— 样品巢式 RT-PCR或免疫捕获巢式 RT-PCR检测结果为阳性，且序列测定结果经比对分析为BlShV,则判定为检出 BlShV。

　　— 样品巢式 RT-PCR或免疫捕获巢式 RT-PCR检测结果为阳性，且实时荧光 RT-PCR检测结果为阳性，则判定为检出 BlShV。

　　10 样品保存与结果记录

　　10 . 1 样品保存

　　经检测确定检出 BlShV 的样品应保存在适合的条件下以备复核。 活的种苗在隔离温室或光照培养箱中培养，组织、叶片等样品保存在 -80 ℃冰箱中，做好登记和标记工作，保存期限至少 1 年 。

　　10 . 2 结果记录

　　记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。 DAS-ELISA 检测应有反应原始数值;免疫层析试纸条应有试纸条检测图片;巢式 RT-PCR 和免疫捕获巢式 RT-PCR 检测应有电泳图片;实时荧光 RT-PCR检测应有实时荧光结果图片;序列测定应有测序报告。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　蓝莓休克病毒相关资料

　　A.1 寄主范围

　　已报道的自然寄主为越橘属的蓝莓(vaccinium spp.) 。

　　A.2 病害症状

　　典型症状是花和叶片在开花期时突然完全坏死，导致不结果。 据统计，该病毒侵染蓝莓造成的损失可达 34%~90% 。BlShV几乎可侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状(见图 A. 1) 。

　　图 A.1 Blshv侵染蓝莓后引起的症状

　　(引 自 https://ncipmc.bugwoodcloud.org/projects/pest-alerts1/blueberry-shock-virus-bromoviridae-harvirus)

　　A.3 分布地区

　　主要分布于美国、加拿大等国家。

　　A.4 传播途径

　　主要通过蜜蜂携带感染的花粉传播。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体呈等轴对称球状，直径约 27 nm。

　　A.6 病毒基因组

　　正义单链 RNA。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B.1 试剂

　　B.1 . 1 包被抗体

　　特异性的蓝莓休克病毒抗体。

　　B.1 . 2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的蓝莓休克病毒抗体。

　　B.1 . 3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP) 。

　　B.1 .4 1 ×PBST缓冲液(PH 7.4)

　　氯化钠(NaCl)

　　磷酸二氢钾(KH 2 PO4)

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4)

　　氯化钾(KCl)

　　吐温-20(Tween-20)

　　8 . 0 g

　　0 . 2 g

　　1 . 15 g

　　0 . 2 g

　　0 . 5 mL

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 .5 抽提缓冲液(PH 7.4)

　　亚硫酸钠(Na2 SO3) 1.3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮(PVP, MW 24 000-40 000) 20.0 g

　　溶于 900 mL 的 1 × PBST 中，并用 1×PBST定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 .6 包被缓冲液(PH 9.6)

　　碳酸钠(Na2 CO3) 1.59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93 g

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 . 7 酶标抗体稀释缓冲液(PH 7.4)

　　牛血清白蛋白(BSA) 2 . 0 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮(PVP, MW 24 000-4 0000) 20.0 g

　　溶于 900 mL 1 × PBST 中，并用 1 × PBST定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 .8 底物缓冲液(PH 9.8)

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　　溶于 800 mL灭菌双蒸水中，用浓盐酸(HCl)调 pH 至 9 . 8,定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.2 程序

　　B.2 . 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入到酶联板的孔中，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2 h 或 4 ℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST洗涤 4~6 次，每次 1 min。

　　B.2 . 2 加样

　　加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照和空 白对照，并且至少一个重复，100 μL/孔，加盖，

　　37 ℃孵育 2 h 或 4 ℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST洗涤 4~6 次 ，每次 1 min。

　　B.2 . 3 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板的孔中，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2 h,倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST洗涤 4~6 次，每次 1 min。

　　B.2 . 4 加底物

　　将底物 ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用)，按 100 μL/孔，加入到酶联板的孔中，室温避光孵育。

　　B.2 . 5 读数

　　在不同的时间如 30 min、60 min、90 min、120 min或更长时间，用酶标仪在 405 nm处读 OD值。

　　B.3 结果判定

　　B.3 . 1 质量控制要求

　　满足阴性对照孔的 OD405 值<0 . 15、阳性对照孔的 OD405 值/阴性对照孔的 OD405 值 >5;同一样品的重复性基本一致，数值差别<0 . 05 。

　　B.3 . 2 结果判定

　　在满足 B. 3 . 1 的质量控制要求下，若样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值 >2,判定为阳性;样品 OD405值/阴性对照 OD405 值在阈值附近，判定为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证;样品 OD405值/阴性对照 OD405 值<2,判定为阴性。

　　注：若不满足 B. 3 . 1 的质量控制要求，则不能进行结果判定。

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　免疫层析试纸条检测方法

　　C.1 试剂

　　样品抽提缓冲液配制方法见 B. 1 . 5 。

　　C.2 试纸条保存

　　试纸条应密封干燥保存于 2 ℃ ~8 ℃冰箱内。

　　C.3 检测步骤

　　C.3 . 1 样品准备

　　待测样品按 6 . 2 步骤制备，取 300 μL样品提取液至 1 . 5 mL 的离心管中。

　　C.3 . 2 样品检测

　　检测前先将试纸条恢复至室温。

　　将试纸条 T线一端垂直插入到样品液中，样品液高度不要超过试纸条上的 MAX线。 测试观察的时间以 5 min~10 min 为宜。 对于病毒浓度低的样品，测试观察的时间可适当延长。

　　C.4 结果判定

　　— 质控 C线显红色，测试 T线显红色，则判定为阳性;

　　— 质控 C线显红色，测试 T线未显色，则判定为阴性;

　　— 质控 C线和测试 T线均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。

　　C.5 试纸条是否有效的判断方法

　　— 用阳性对照进行测试，测试 T线显红色，质控 C线显红色，说明整个系统工作正常;

　　— 用阳性对照进行测试，测试 T线显红色，质控 C线未显色，说明羊抗兔失效;

　　— 用阳性对照进行测试，测试 T线未显色，质控 C线显红色，说明测试 T线的特异性抗体失效;

　　— 用阳性对照进行测试，测试 T线未显色，质控 C线也未显色，说明整个测试纸条失效。

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　　附 录 D

　　(规范性)

　　巢式 RT-PCR检测方法

　　补充蒸馏水至 1 000 mL。 用时加蒸馏水稀释至 0 . 5 × TBE。

　　D.1 . 3 6×加样缓冲液

　　0 . 25% 溴酚蓝

　　40%(W/V)蔗糖水溶液。

　　D.1 . 4 引物序列

　　根据 GenBank 已 报 道 的 BlShV 基 因 序 列，设 计 2 对 用 于 特 异 性 扩 增 的 巢 式 引物，引 物 序 列见表 D. 1 。

　　表 D.1 引物序列

　　D.2 巢式 RT-PCR检测

　　D.2 . 1 总 RNA提取

　　取样品提取液 200 μL 放入 1 . 5 mL 离心管中，再加入 1 mL TrizoL 试剂，剧烈振荡摇匀 3 min; 4 ℃ , 12 000 g离心 10 min,取上清;加入氯仿 300 μL,剧烈振荡 15 s, 室温静置 5 min, 4 ℃ , 12 000 g离心 15 min,取上层水相;加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置 15 min, 4 ℃ , 12 000 g 离心10 min,弃上清;加入 1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 4°C, 7 500 g离心 3 min,弃上清;RNA沉淀干燥后，用 20 μL~40 μL 经 DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的 ddH 2 O 溶解，-80 ℃保存备用。

　　注：总 RNA 的提取也可以采用等效的其他提取方法或商品化试剂盒。

　　D.2 . 2 CDNA合成

　　在 PCR管中加入 3 μL 总 RNA、1μL外侧反向引物 BlShV-R( 10 μmol/L)、7 μL ddH2 O, 70 ℃水

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　　浴 10 min,迅速冰浴 5 min,再加入下列试剂：5 × RT缓冲液 5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 2 μL、M-MLV RT(200 U/μL) 1 μL、RNasin(40 U/μL) 1 μL。42 ℃水浴 60 min, 70 ℃水浴 10 min, 自然冷却至室温， -20 ℃保存备用。

　　D.2 . 3 第 1 轮 PCR扩增

　　第 1 轮 PCR反应体系见表 D. 2,每个反应设置 2 个重复。

　　PCR反应条件：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 51 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35 个循环，最后一个循环结束后72 ℃延伸 10 min。

　　表 D.2 PCR反应体系

　　D.2 . 4 第 2 轮 PCR扩增

　　取第 1 轮 PCR产物 0 . 5 μL 作为模板，进行第 2 轮 PCR 扩增。 PCR 反应体系为：内侧正向引物 BlShV-1 (10 μmol/L) 1 μL、内侧反向引物 BlShV-2 ( 10 μmol/L) 1 μL、2 × Taq PCR mix 12. 5 μL、 ddH2 O 10 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 共 30 个循环，最后一轮循环结束后 72 ℃延伸 10 min。

　　D.2 . 5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5%的琼脂糖凝胶，对 PCR产物进行电泳，电压 3 V/cm~5 V/cm,缓冲液 0 . 5 × TBE。 电泳

　　结束后，在溴化乙锭(EB,质量浓度为 0 . 5 μg/mL)溶液染色 10 min后，再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带，拍照并做记录。

　　注：也可以采用其他核酸染料替代 EB。

　　D.3 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品第 1 轮 PCR扩增出与阳性对照一致的 目的片段(746 bp)或第 2 轮 PCR扩增出与阳性对照一致的 目的片段(486 bp),则判定为阳性。

　　如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品第 1 轮 PCR、第 2 轮 PCR均未扩增出与阳性对照一致的 目的片段(746 bp、486 bp),则判定为阴性。

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　　附 录 E

　　(规范性)

　　免疫捕获巢式 RT-PCR检测方法

　　E.1 试剂

　　E.1 . 1 BlShV抗体：见 B.1.1。

　　E.1 .2 抽提缓冲液(pH 7.4)：见 B.1.5。

　　E.1 .3 包被缓冲液(pH 9.6) ：见 B.1.6。

　　E.1 . 4 引物序列：见 D. 1 . 4 。

　　E.2 免疫捕获巢式 RT-PCR检测

　　E.2 . 1 免疫捕获

　　将 BlShV抗体用包被缓冲液按说明稀释，取 100 μL加入 PCR管中，37 ℃孵育 2 h;倒去 PCR管中溶液，用 PBST洗涤 3 次;待测样品按 6 . 2 步骤制备，取 100 μL样品提取液加入 PCR 管中，4 ℃包被过夜或 37 ℃孵育 2 h。

　　E.2 . 2 CDNA合成

　　倒去 PCR管中溶液，先后用 PBST洗涤 3 次、DEPC-H 2 O 洗涤 2 次，短暂离心后吸去管底余液，在

　　PCR管中进行反转录。先向 PCR 管中加入外侧反向引物 BlShV-R(10 μmol/L) 1 μL、ddH2 O 10 μL, 70 ℃水浴 10 min后立即冰浴 5 min,再加入下列试剂：5 × RT缓冲液 5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 2 μL、 M-MLVRT(200 U/μL) 1 μL、RNasin(40 U/μL) 1 μL。42 ℃水浴 60 min, 70 ℃水浴 10 min。

　　E.2 . 3 第 1 轮 PCR扩增

　　见 D. 2 . 3 。

　　E.2 . 4 第 2 轮 PCR扩增

　　见 D. 2 . 4 。

　　E.2 . 5 琼脂糖凝胶电泳

　　见 D. 2 . 5 。

　　E.3 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品第 1 轮 PCR扩增出与阳性对照一致的 目的片段(746 bp)或第 2 轮 PCR扩增出与阳性对照一致的 目的片段(486 bp),则判定为阳性。

　　如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品第 1 轮 PCR、第 2 轮 PCR均未扩增出与阳性对照一致的 目的片段(746 bp、486 bp),则判定为阴性。

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　　附 录 F

　　(规范性)

　　实时荧光 RT-PCR检测方法

　　F.1 试剂

　　F.1 . 1 核酸提取试剂：见 D. 1 . 1 。

　　F.1 .2 TaqMan PCR mix。

　　F.1 . 3 引物及探针序列

　　根据已报道的 BlShV外壳蛋白(CP)和依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶(RdRp)基因序列设计特异性引物及探针，引物和探针序列见表 F. 1 。

　　表 F.1 引物和探针序列

　　F.2 实时荧光 RT-PCR检测

　　F.2 . 1 总 RNA提取见 D. 2 . 1 。

　　F.2 . 2 CDNA合成

　　在 PCR管中加入 3 μL总 RNA、1 μL随机引物(100 μmol/L)、7 μLddH2 O, 70 ℃水浴 10 min,迅速冰浴 5 min,再加入下列试剂：5 × RT缓冲液 5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 2 μL、M-MLVRT(200 U/μL) 1 μL、 RNasin(40 U/μL)1 μL。42 ℃水浴 60 min,70 ℃水浴 10 min。

　　F.2 . 3 实时荧光 PCR反应

　　反应 体 系：在 荧 光 定 量 PCR 管 中 加 入 cDNA 2 μL、BlShV-f1 ( 10 μmol/L) 1 μL、BlShV-r1 (10 μmol/L) 1 μL、BlShV-P1 ( 10 μmol/L) 1 μL、BlShV-f2 ( 10 μmol/L) 1 μL、BlShV-r2 ( 10 μmol/L)

　　1 μL、BlShV-P2(10 μmol/L) 1 μL、2×TaqMan PCR mix 12.5 μL、ddH2 O 4.5 μL。每个反应设置 2 个

　　重复。

　　反应程序：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 共 40 个循环。

　　F.3 结果判定

　　如果阳性对照 Ct 值 <35,且出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照的 Ct 值 ≥40, 且无扩增

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　　曲线：

　　待测样品 Ct值 ≤35 时，且出现典型的扩增曲线，则判定为阳性;

　　待测样品 Ct值 ≥40 时，且无扩增曲线，则判定为阴性;

　　待测样品 Ct值介于 35 和 40 之间时，应重新提取样品 RNA进行测试，若重新测试的 Ct值 ≥40,且无扩增曲线，则判定为阴性;否则判定为阳性。

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　　参 考 文 献

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　　[6] Spak J, Pribylova J , Kubelkova D, Petrzik K, Spakova V. Detection of viruses and phytoplas- ma in Vaccinium sp. in the Czech Republic. Acta Horticulturae, 2012 , 926 : 631-635.

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