GB/T 28106-2011 郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28106—2011

　　郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofCurtobacterium

　　flaccumfacienspv. oortiCollins& Jones

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28106—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :郭京泽 、魏亚东 、张裕君 、刘跃庭 、刘鹏 、罗加凤 、廖芳 、王金成 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28106—2011

　　郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了郁金香黄色疱斑病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎 、郁金香植株上郁金香黄色疱斑病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 4789. 28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法 、培养基和试剂

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 郁金香黄色疱斑病菌基本信息

　　中文名 :郁金香黄色疱斑病菌 。

　　学名:Curtobacteriumflaccumfaciens pv. oortii。

　　异名 : Corynebacterium flaccumfaciens pv. oortii(Saaltink & Maas Geesteranus 1969) Dye & Kemp 1977, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. oortii( Saaltink & Maas Geesteranus 1969) Carlson & Vidaver1982,Corynebacterium oortiiSaaltink & Maas Geesteranus1969。

　　病害英文名 :tulip bacterial canker,tulip yellow pustule。

　　属原核生物界 Procaryotes,厚壁菌门 Firmicutes,厚壁细菌纲 Firmibacteria,短小杆菌属 Curtobac- terium。

　　该病菌随带病球茎调运远距离传播 。带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球 。植株间通过带菌病叶扩散传播 。

　　郁金香黄色疱斑病菌其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　从病部样品中分离病菌并纯化 ,然后通过革兰氏染色 、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定 。郁金香黄色疱斑病菌的寄主范围 、病害症状特征 、生物学特性 、生理生化特性(参见附录 A 和附录 B) 是该病菌的检疫鉴定依据 。

　　5 仪器、设备

　　生物显微镜 、超净工作台 、高压灭菌锅 、恒温培养箱 、八道移液器 ,BIOLOG 细菌自动鉴定系统 。

　　6 试剂和培养基

　　无水乙醇 、微量发酵管 、革兰氏染色液 。

　　1

　　GB/T 28106—2011

　　523培养基 :蛋白胨 8 g,酵母粉 4 g,硫酸镁(MgSO4 · 7H2 O)0. 3 g,蔗糖(C12 H22 O11 )10 g,磷酸氢二钾(K2 HPO4 )2 g,琼脂 18 g,水(H2 O)1 000 mL。调整 pH值至 7. 0~ 7. 1,121 ℃湿热灭菌 20 min。

　　BUG培养基 。

　　7 对照菌株

　　已知标准菌株作阳性对照菌 。选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌 。

　　8 检测鉴定

　　8. 1 现场检测

　　按照 SN/T 2122的规定进行检疫并抽取样品 。

　　若发现郁金香病株矮化 , 叶片出现银灰色斑 ,上下表皮开裂 ,茎杆内部变黄 ,球茎最外层鳞片上出现白色斑 ,在球茎储藏后期病斑隆起变黄(参见 A. 3) ,应取样带回实验室做病菌分离鉴定 。

　　8. 2 病原菌分离

　　取带病样品,用脱脂棉蘸取 75%乙醇擦拭表面 , 晾干或用灭菌水冲洗 3 次 。切取病健交界部位组织置于灭菌的培养皿中加少量灭菌生理盐水 ,用玻棒碾碎 ,用接种环蘸取悬液在 523培养基平板上进行划线分离 。每个样品接种不少于 3个平板 。接种后的平板置于 30 ℃培养箱中培养 24h~ 72h,检查出现的菌落情况 。

　　8. 3 分离菌的纯化

　　观察 523培养基平板上产生的菌落 ,有黄色 、有光泽 、圆形 、边缘整齐 、直径 1 mm~ 1. 5 mm 的菌落为可疑菌落 。

　　挑取单个可疑菌落 ,在 523培养基平板上划线 ,接种后的平板置于 30 ℃培养箱中培养 24h~ 72h。一般连续转接 2 次 ~ 3 次可得到纯化的分离菌 。

　　8. 4 革兰氏染色

　　按 GB/T 4789. 28—2003中 2. 2规定的方法进行 。

　　8. 5 生理生化测定

　　从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰氏染色测定后 ,若分离菌为革兰氏染色阳性菌 ,则结合实验条件任选下列一种方法对分离菌进行生理生化测定 :

　　— 应用 BIOLOG 细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定 。按照 BIOLOG 细菌自动鉴定系统规 定 的 操 作 方 法 进 行 , 鉴 定 结 果 为 Curtobacterium flaccumfaciens,则 判 定 该 分 离 菌 的BIOLOG鉴定结果为阳性 ;

　　— 应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定 。测定结果与表 B. 1 结果一致 ,则生理生化测定结果为阳性 。否则生理生化测定结果为阴性 。

　　9 结果评定

　　从郁金香上进行细菌分离纯化 ,若分离菌经过革兰氏染色为阴性菌 ,则判定检测结果为样品不带郁金香黄色疱斑病菌 。

　　2

　　GB/T 28106—2011

　　从郁金香上进行细菌分离纯化 ,分离菌经过革兰氏染色为阳性菌 ,BIOLOG鉴定结果为阳性 ,或用微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性 ,则判定检验样品带有郁金香黄色疱斑病菌 。否则判定检验样品不带郁金香黄色疱斑病菌 。

　　10 菌株和样品的保存

　　分离并鉴定为郁金香黄色疱斑病菌的菌株应转接到 523培养基试管斜面上 ,经登记和经手人签字后置于 4 ℃低温冰箱中保存 ,定期转接 , 以防止病菌死亡 ;必要时冻干后长期保存 。

　　检出郁金香黄色疱斑病菌的样品至少保存 6个月 ;保存期满后 ,需经灭菌处理 。

　　3

　　GB/T 28106—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　郁金香黄色疱斑病菌其他信息

　　A. 1 分布

　　丹麦 、荷兰 、罗马尼亚 、英国 、日本 、韩国 ,在我国台湾和杭州有报道 。

　　A. 2 寄主范围

　　郁金香(Tulipgesneriana) 。

　　A. 3 危害症状

　　郁金香黄色疱斑病菌能系统性侵染郁金香 ,引起郁金香维管束病害 ,造成郁金香植株叶斑和郁金香球茎黄色疱斑 。感染郁金香黄色疱斑病菌的郁金香病株严重时可出现矮化症状 , 叶片出现银灰色斑 ,上下表皮开裂 ,茎杆内部变黄 ,郁金香球茎最外层鳞片上出现白色斑 ,在球茎储藏后期病斑隆起变黄 。在春季温度低时易于发病 。

　　A. 4 生物学特性

　　菌体杆状 ,大小(0. 4 μm~0. 6 μm) × (0. 6 μm~ 3. 0 μm) ;周生鞭毛 ,革兰氏染色阳性 ,最适生长温度为 25 ℃ ~ 30 ℃ 。 能水解酪蛋白 , 能利用乳酸 、苹果酸 、葡萄糖酸 、醋酸盐 ,不能利用阿拉伯糖 、山梨糖 、蔗糖 、丙酸 、甲酸盐 。

　　4

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性

　　表 B. 1 郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性

　　项 目

　　Curtobacterium

　　flaccumfaciens

　　pv. oortii

　　C. albidum

　　C. citreum

　　C. luteum

　　C. plantarum

　　C. pusillum

　　C. flaccumfaciens pv. batae

　　酪蛋白水解

　　+

　　+

　　-

　　+

　　-

　　+

　　-

　　树胶醛糖产酸

　　-

　　-

　　+W

　　+W

　　d

　　+W

　　-

　　山梨糖产酸

　　-

　　-

　　+W

　　-

　　-

　　-

　　-

　　蔗糖产酸

　　-

　　-

　　-

　　-

　　-

　　+W

　　-

　　乳酸同化

　　+

　　+

　　+

　　-

　　ND

　　+

　　+

　　苹果酸同化

　　+

　　-

　　+

　　+

　　d

　　-

　　+

　　葡萄糖酸同化

　　+

　　+

　　+

　　+

　　+

　　-

　　+

　　醋酸盐利用

　　-

　　+

　　注 : + :90%以上菌株为阳性 ; - :90%以上菌株为阴性;d:11% ~ 89%菌株为阳性 ;W :弱反应 ;ND:未测定 。

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