GB/T 28103-2011 小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28103—2011

　　小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofwheatstreak mosaicvirus

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28103—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人:郭京泽 、廖芳 、刘跃庭 、张裕君 、刘勇 、崔铁军 、王金成 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28103—2011

　　小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了小麦线条花叶病毒(wheatstreak mosaic virus)检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于禾本科植物种子和苗木中的小麦线条花叶病毒检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 小麦线条花叶病毒基本信息

　　小麦线条花叶病毒 wheatstreak mosaic virus,属于马铃薯 Y病毒科 Potyviridae,小麦花叶病毒属Tritimovirus。缩写:WSMV。

　　小麦线条花叶病毒传播途径有:汁液摩擦传播 ;种传 ;介体传播 。

　　该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散 。该病毒能通过带病小麦种子的调运远距离传播 。该病毒的传毒介体为小麦卷叶螨 Aceriatosichella,成虫和若虫均可带毒传染 ,卵不传病毒 。

　　小麦线条花叶病毒其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　小麦线条花叶病毒的形态学特征 、分子生物学特性和血清学特性是该病毒检疫鉴定方法的主要依据 。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法 、植物病毒免疫电镜检测方法 、反转录聚合酶链式反应检测方法 ,确定样品中带有的小麦线条花叶病毒 。

　　5 仪器设备、用具及试剂

　　5. 1 仪器设备

　　酶标仪 、洗板机 、恒温水浴锅 、普通冰箱(0 ℃ ~ 4 ℃) 、-20 ℃低温冰箱 、-80 ℃超低温冰箱 、植物光照培养箱(温度可调范围为 0 ℃ ~ 50 ℃) 、超净工作台 、电子天平(1/10000g) 、微量榨汁机 、透射电子显微镜 、低速离心机(转速为 3 000 r/min~ 5 000 r/min) 、PCR仪 、纯水仪 、电泳仪 、凝胶成像系统 。

　　5. 2 用具

　　可调微量移液器(2. 5 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL、5 000 μL) 和相应的吸头 、酶联板 、封口膜、pH计或 pH试纸条(广泛试纸和精密试纸) 、1. 5 mL离心管 、PCR反应管 、容量瓶(500 mL、1 000 mL) 、解剖刀片 、镊子 、剪刀 、吸水纸 、白瓷盘 、记号笔 、标签 、一次性手套 。

　　1

　　GB/T 28103—2011

　　5. 3 试剂

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定的检测试剂(见附录 B) 。

　　反转录聚合酶链式反应检测试剂(见附录 C) 。

　　植物病毒免疫电镜检测试剂(见 SN/T 1840) 。

　　6 现场检测

　　按照 SN/T 2122的规定进行检疫并抽取种子和种苗样品 。

　　7 实验室检测

　　对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) ,检验程序见附录 B。

　　对样品进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定 ,检验程序见附录 C。

　　对样品进行植物病毒免疫电镜(IEM)测定 ,检验程序见 SN/T 1840。在电镜下观察到弯曲线状病毒粒子 ,测定其大小为 15nm×700 nm ,病毒粒子周围有抗体晕圈 ,则 IEM测定结果为阳性 。否则 IEM测定结果为阴性 。

　　8 结果判定

　　样品经过 DAS-ELISA、RT-PCR测定或 IEM测定 ,其两种或两种以上测定结果均为阳性 ,则判定该样品带有小麦线条花叶病毒 。否则判定样品不带有小麦线条花叶病毒 。

　　9 样品保存与结果记录

　　9. 1 样品保存

　　在适宜环境中保存已鉴定带有小麦线条花叶病毒的样品 。如叶片应在超低温冰箱中单独保存或冻干保存 ;生长的苗木应在植物光照培养箱中单独培育 ;种子应在干燥条件下保存 。

　　9. 2 结果记录与资料保存

　　记录各项数据 ,包括样品的种类 、来源和样品状况 , 检测的时间 、地点 、方法和结果 ,测定人员的签字 。DAS-ELISA 的测定结果应保存吸光值数据报告 ,RT-PCR测定结果应保存电泳照片 ,IEM 测定结果应保存病毒粒体照片 。

　　2

　　GB/T 28103—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　小麦线条花叶病毒其他信息

　　A. 1 形态学特征

　　病毒粒子形态为弯曲线状 ,无包膜 ,长 690 nm~ 700 nm ,直径 11 nm~ 15 nm。

　　A. 2 地理分布

　　最初报道于美国 , 目前在美洲 、北非 、中东 、中亚 、东亚 、东南亚以及欧洲 、澳大利亚均有发生 。在我国西北的甘肃 、陕西等地区曾有发生 。

　　A. 3 寄主范围及症状

　　小麦线条花叶病毒侵染许多小麦品种以及燕麦 、大麦 、黑麦 、一些玉米品种和黍 ,还侵染多种单子叶杂草 ,但不侵染双子叶植物 。

　　小麦线条花叶病毒引起小麦严重花叶和矮化症状 。在小麦苗期 ,植株叶色变淡 , 叶片变窄 , 叶上出现细小褪绿条点及黄色小点 ,与叶脉平行 ,并逐渐发展成苍白色断续条纹 ,部分组织坏死 。苍白条纹不规则愈合 ,在苍白背景的叶片上有残余绿色条纹 , 叶片是一侧向内纵向卷曲 。新叶片上也有褪色条纹 ,叶脉浊化稍暗 。小麦拔节后 ,节间向下成弧状弯拐 ,节外复又向上 ,各节的向地一侧异常膨大造成全茎呈拐节状 ,此症状在基部 1节 ~ 3节最为明显 。病情严重的植株 ,全株分蘖向四周匍匐 ,穗鞘扭卷 ,不易抽穗或穗而不实 。整个病田表现植株松散 ,外型异常 。小麦线条花叶病毒对小麦产量影响大 ,轻者减产30% ~ 50% ,重者颗粒无收 。

　　诊断寄主:小麦 、大麦 、燕麦的所有品种和部分玉米品种表现系统花叶症状并且矮化 。该病毒的某些分离物侵染高粱(Sorghum bicolor)偶然出现坏死斑症状 。

　　繁殖寄主:冬小麦任何品种都适于做该病毒的繁殖寄主 。

　　测定寄主:没有合适的局部斑测定寄主 。

　　A. 4 分子生物学特性

　　小麦线条花叶病毒的核酸为单分子正义 ssRNA,长为 8. 5 kb,相对分子量为 2. 8×106 ,核酸占病毒粒子质量约为 5% 。

　　小麦线条花叶病毒的基因组为单分体基因组 ,RNA 的 5’端为 VPg,3’端为 Poly(A) 。基因组编码一个 344kDa的多聚蛋白 , 然后切割成 10个产 物 , 分 别 为 40kDa的 P1蛋 白 、44kDa的 HC-Pro蛋 白 、 32kDa的 P3蛋白 、6kDa的 6K1蛋白 、73kDa的柱状内含体解旋酶 、6kDa的 6K2蛋白 、23kDa的 VPg、 26kDa的 NIa蛋白 、64kDa的 NIb蛋白及 30kDa的外壳蛋白 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)方法检测

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被缓冲液(pH9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 )1. 59 g,碳酸氢钠(NaHCO3 )2. 93 g,叠氮化钠(NaN3 ) 0. 20 g,溶解于 900 mL蒸馏水中 ,用盐酸调节 pH 至 9. 6,用蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B. 1. 2 PBST缓冲液(pH7. 4)

　　氯化钠(NaCl)8. 0 g,磷酸二氢钠(KH2PO4 ) 0. 2 g,磷酸氢二 钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g,氯化钾(KCl) 0. 2 g,0. 5 mL Tween-20,叠氮钠(NaN3 )0. 2 g,溶解于 900 mL蒸馏水中 ,用盐酸调节 pH 至 7. 4,蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B. 1. 3 样品抽提缓冲液

　　亚硫酸钠(Na2SO3 )20 g,2. 0 gPVP(MW 24~4000) ,加 PBST缓冲液 1 000 mL。

　　B. 1. 4 酶标抗体缓冲液

　　20 gPVP(MW 24~4000) ,BSA 2. 0 g,加 PBST缓冲液 1 000 mL。

　　B. 1. 5 底物缓冲液

　　二乙醇胺 97 mL,蒸馏水 600 mL,用盐酸调 pH 至 9. 8,然后用蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B. 1. 6 底物 ρNPP(对-硝基苯磷酸钠)

　　B. 1. 7 种子表面消毒液

　　将 30%次氯酸钠(NaClO)100mL溶于 900 mL蒸馏水中 ,制成 3%种子表面消毒液 。

　　B. 1. 8 生物制剂

　　小麦线条花叶病毒检测试剂盒(WSMV特异性抗体和酶标记抗体) 。

　　小麦线条花叶病毒阳性质控 。

　　小麦线条花叶病毒阴性质控 。

　　B. 2 DAS-ELISA检测

　　B. 2. 1 样品制备

　　B. 2. 1. 1 种子类

　　随机抽取或针对性挑选 100粒种子 ,浸入种子表面消毒液中消毒 10 min,用灭菌蒸馏水洗涤种子三次 。将种子摆放于铺 有 湿 润 吸 水 纸 的 白 瓷 盘 内 。 在 植 物 光 照 培 养 箱 中 , 使 种 子 在 适 宜 的 发 芽 温 度(20 ℃ ~ 28 ℃)下催芽长出叶片 。

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　　用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液 ,样品质量与抽提缓冲液体积之比为 1 ∶ 10。研磨的植物汁液盛于离心管中 ,低速离心 2 min,上清液为待检样品液 。

　　B. 2. 1. 2 种苗类

　　随机抽取至少 20株种苗的叶片 0. 2 g,或针对性采集表现症状的病叶 。用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液 ,样品质量与抽提缓冲液体积之比为 1 ∶ 10。研磨的植物汁液盛于离心管中 ,低速离心2 min,上清液为待检样品液 。

　　B. 2. 2 检测步骤

　　B. 2. 2. 1 在酶联板上设定待检样品孔和对照孔孔位 。对照孔包括 2 个阳性质控孔 、2 个阴性质控孔 、 2个 空白对照孔 。每个待检样品设定两个孔位 。

　　B. 2. 2. 2 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释 WSMV 包被抗体 , 每孔加入 100 μL抗体溶液 。用封口膜包好酶联板 ,水浴锅中 37 ℃孵育 2 h或 4 ℃冰箱过夜 。

　　B. 2. 2. 3 洗板机洗板 3 次 ,洗涤液为 PBST缓冲液 。

　　B. 2. 2. 4 每个待检样品孔加入 100 μL待检样品液 。相应的对照孔中加入 100 μL阳性质控 , 100 μL阴性质控和 100 μL样品抽提缓冲液 。用封口膜包好酶联板 ,水浴锅中 37 ℃孵育 4 h或 4 ℃冰箱过夜 。 B. 2. 2. 5 洗板机洗板 4次 ~ 6次 ,洗涤液为 PBST缓冲液 。

　　B. 2. 2. 6 按要求的浓度和需要的体积用酶标抗体缓冲液稀释 WSMV 酶标抗体 , 每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 ,用封口膜包好酶联板 ,水浴锅中 37 ℃孵育 2 h~4 h。

　　B. 2. 2. 7 同步骤 B. 2. 2. 3洗板 。

　　B. 2. 2. 8 按 1 mg/mL的浓度将 ρNPP(对-硝基苯磷酸钠) 溶于底物缓冲液中(现用现配) 。 每孔加入100 μL底物溶液 。室温下避光环境中放置 30 min~ 60 min。

　　B. 2. 2. 9 用酶联仪在 405 nm 波长下测定各孔的吸光值(OD405) 。

　　B. 3 质量控制要求和结果判定

　　B. 3. 1 质量控制要求

　　满足以下条件时 ,检测结果有效 :

　　— 空白对照和阴性质控的 OD405值小于 0. 15;

　　— 阳性质控 OD405/阴性质控 OD405在 3~ 10之间 ;

　　— 重复检测样品 OD值平行允许率(P)小于 20% 。

　　如阴性质控的 OD405值小于 0. 05时 ,按 0. 05计算 。

　　平均允许率按式(B. 1)计算 :

　　P

　　式中 :

　　P — 平行允许率 ;

　　OD1— 重复样品 1;

　　OD2— 重复样品 2。

　　B. 3. 2 结果判定

　　在满足 B. 3. 1 的质量要求后 ,按如下原则作出判定 :

　　— 样品 OD405/阴性质控 OD405值大于 2,DAS-ELISA结果判定为阳性 ;

　　— 样品 OD405/阴性质控 OD405值等于 2,判定为可疑 ,需重做一次或者用其他方法进行验证 ;

　　— 样品 OD405/阴性质控 OD405值小于 2,DAS-ELISA结果判定为阴性 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 饱和酚 、三氯甲烷 、异戊醇 、MgCl2 、3 mol/L醋酸钠(pH5. 2) 、无水乙醇 、DEPC、溴化乙锭 、琼脂糖 、dNTPs、Taq酶 、M-MLV反转录酶 、RNase inhibitor、M-MLV反转录缓冲液 、Trizol-RNA抽提缓冲液 、10×PCR缓冲液 、TAE 电泳缓冲液 、TE缓冲液 、溴酚蓝载样缓冲液 。

　　C. 1. 2 RNA抽提试剂盒 、RT-PCR试剂盒 。

　　C. 1. 3 小麦线条花叶病毒阳性对照 、阴性对照 、DNA ladder marker。

　　C. 2 实验步骤

　　C. 2. 1 RNA提取

　　将 250 mg植物材料置于离心管中 ,液氮冷冻 ,研碎 。悬浮于 750 μL抽提缓冲液中 ,继续研磨 。再加入等体积的饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) ,混匀 。 13000 r/min离心 5 min,取上清液 。加入 1/10体积的 3 mol/L醋酸钠(pH5. 2) , 2. 5 倍体积的无水乙醇 , -80 ℃ 30 min 以上(或 - 20 ℃过夜) 。 13 000 r/min离心 15min, 留沉淀 。加入 300μL的 75%乙醇洗涤 。 13000 r/min离心 2 min,弃上清液 ,重复离心一次 ,风干 。将 RNA溶于 50 μL经 DEPC处理的蒸馏水中 ,作为待检测核酸 。 分别从 WSMV 阳性对照 、阴性对照中提取 RNA。

　　可使用 RNA提取试剂盒并按照说明书进行操作 。

　　C. 2. 2 引物合成

　　依据文献(Deb M & Anderson J M ,2008)所设计的引物序列 :

　　WSMV L2:5’-CGA CAA TCA GCA AGA GAC CA-3’

　　WSMV R2:5’-TGA GGA TCG CTG TGT TTC AG-3’

　　扩增产物大小约为 190 bp。

　　C. 2. 3 RT-PCR检测

　　C. 2. 3. 1 cDNA 的合成

　　反应体系为 20 μL,包括 20μmol/L引物 1 μL,RNase-free H2 O 8. 5 μL,待检测核酸 2 μL,空白对照用 RNase-free H2 O。88 ℃水浴 10 min后 ,置于冰上 ,加入 10 mmol/L的 dNTP 1 μL,40 U/μL的RNaseinhibitor0. 5 μL,5倍 M-MLV反转录缓冲液 4 μL,100 mmol/LDTT2μL,5 U/μLM-MLV反转录酶 1 μL,混匀 ,42 ℃水浴 1 h,合成 cDNA。 同样处理阳性对照 、阴性对照和水空白对照 。

　　C. 2. 3. 2 PCR扩增

　　反应体 系 50 μL, 包 括 10 mmol/L 的 dNTPs 1 μL, 20 μmol/L 引 物 WSMV L2/WSMV R2各1 μL,10倍 PCR缓冲液 5 μL,cDNA 2 μL,5 U/μLTaq酶 1 μL,双蒸水 39μL,进行如下热循环 : 95 ℃ 3 min,然后 95 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,35个循环 ,最后 72 ℃ 10 min,4 ℃保存 PCR产物 。 同

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　　样处理阳性对照 、阴性对照和水空白对照 。

　　C. 2. 4 琼脂糖电泳和凝胶成像

　　制备 2%的琼脂糖凝胶 。取上述 PCR产物 5 μL,加入 1 μL载样缓冲液 ,混匀后移入胶孔 。样品孔两侧分别加入 DNA ladder marker,100 V 电压下电泳 。 电泳后的 凝 胶 在 0. 1%溴 化 乙 锭 溶 液 中 染 色30 min。在凝胶成像仪下进行分析并拍照 ,记录实验结果 。

　　C. 3 结果判断

　　阴性对照和空白对照均无扩增条带 ,待测样品与阳性对照在 190 bp处均有单一条扩增条带 ,则判定结果为阳性 。

　　阴性对照和空白对照均无扩增条带 , 阳性对照在 190 bp处有单一条扩增条带 ,待测样品无扩增条带 ,则判定结果为阴性 。