GB/T 28062-2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28062—2011

　　柑桔黄龙病菌实时荧光 PCR检测方法

　　Detection ofCandidatusLiberibacterasiaticususingthe

　　real-time fluorescentPCR

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28062—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 :重庆 大 学 、农 业 部 农 业 技 术 推 广 服 务 中 心 、中 华 人 民 共 和 国 北 京 出 入 境 检 验 检疫局 。

　　本标准主要起草人 :殷幼平 、王中康 、王玉玺 、高文娜 、夏玉先 、曹月青 、彭国雄 、李正国 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28062—2011

　　柑桔黄龙病菌实时荧光 PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter asiaticus)实时荧光 PCR检测的样品制备 、检测操作方法及结果判定标准 。

　　本标准适用于对芸香科和非芸香科植物罹病植株和传播媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检测和病害鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB 5040 柑桔苗木产地检疫规程

　　GB/T 19495. 2 转基因产品检测实验室技术要求

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　柑桔黄龙病 CitrusHuanglongbing

　　一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害 。 主要侵染柑桔属 、金柑属和枳属等柑桔类植株重 。 由带菌种苗远距离传播 , 田间主要由柑桔木虱取食传播 。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化 ,枝梢黄化 ,果实畸形 ,种子败育 ,严重时可引起植株死亡 。

　　3. 2

　　实时荧光 PCR real-time fluorescentPCR

　　实时荧光聚合酶链式反应 ,一种在体外扩增微量的特殊 DNA 片段的方法 ,在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速 、灵敏地检出模板 DNA 的存在 。

　　3. 3

　　扩增引物 primer

　　人工合成的寡核苷酸序列 ,其序列与待扩增的 目标 DNA 序列中的一段相同 ,用于引导 DNA体外扩增 。

　　3. 4

　　扩增模板 templet

　　DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列 。

　　3. 5

　　Ct值 cycle threshold value

　　实时荧光 PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数 。

　　3. 6

　　亚洲韧皮杆菌重组质粒 DNA recombinantplasmid DNA

　　利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板 ,获得的亚洲韧皮杆菌特异性 DNA 扩

　　1

　　GB/T 28062—2011

　　增序列 ,经构建重组质粒 、转入大肠杆菌 JM109菌株中繁殖培养后 ,重新提取获得的质粒 DNA。 用于作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光 PCR检测的阳性对照 。

　　4 柑桔黄龙病菌基本信息

　　学名 :亚洲韧皮杆菌 CandidatusLiberibacter asiaticus。

　　病害名称 :柑桔黄龙病 ,常用英文名 :Citrus Huanglongbing。

　　分类地位 :α-朊 细 菌 亚 纲 、根 瘤 细 菌 目 (Rhizobiales) , 根 瘤 细 菌 科 (Rhizobiaceae) , 韧 皮 杆 菌 属Liberibacter的 G- 细菌 。是一种难培养细菌 。

　　引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为 3 种 , 即分布于非洲的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌 CandidatusLiberibacterafricanus, 分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌 Can- didatusLiberibacter americanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 Candidatus Liberi- bacter asiaticusJagoueix etal。

　　柑桔黄龙病菌其他信息参见附录 A。

　　本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法 。对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验 ,可参见附录 B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌 ;对来自美洲的柑桔材料 , 除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌外 ,可参见附录 C检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌 。

　　5 方法原理

　　本标准采用的实时荧光 PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法 。其原理是 ,利用病菌特有 DNA序列设计引物 ,在 PCR扩增时加入荧光染料 ,荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法) ,或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针 ,探针 5’端和 3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团 ,如果反应体系中存在待测 目标 DNA模板 ,引物和探针则 与 模 板 上 的 序 列 配 对 而 特 异 性 结 合 , 当 PCR 扩 增 延 伸 到 探 针 结 合 部 位 时 ,Taq DNA 聚合酶将探针水解成单核苷酸 ,使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法) 。 由于初始模板量的不同 ,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的 Ct值不同 , 因此 Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量 。

　　6 实验室设置

　　参照 GB/T 19495. 2。实验室应至少分为三个相对独立的工作区域 :样本制备区 、反应试剂配制区和检测区 ;每个工作区域应有明确标记 ,避免不同工作区域内的设备 、物品混用 。

　　7 主要仪器设备和试剂

　　7. 1 仪器设备

　　7. 1. 1 实时荧光 PCR仪 。

　　7. 1. 2 高速台式离心机 。

　　7. 1. 3 生物安全柜或超净工作台 。

　　7. 1. 4 冰箱(冷藏室 4 ℃和冷冻室 -20℃) 。

　　7. 1. 5 涡旋混匀仪 。

　　7. 1. 6 紫外灭菌灯 。

　　2

　　GB/T 28062—2011

　　7. 1. 7 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10μL、10μL~ 100μL、100μL~ 1000μL) 。

　　7. 1. 8 带滤芯 Tip头 。

　　7. 1. 9 PCR反应管(0. 2 mL 八联管) 。

　　7. 1. 10 微滤柱 。

　　7. 1. 11 高压灭菌锅 。

　　7. 2 试剂

　　7. 2. 1 次氯酸钠 (NaClO3 ) 。

　　7. 2. 2 十二烷基硫酸钠(SDS) 。

　　7. 2. 3 蛋白酶 K (ProteinaseK) 。

　　7. 2. 4 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 。

　　7. 2. 5 乙二胺四乙酸(EDTA) 。

　　7. 2. 6 盐酸胍(Guanidinge HCl) 。

　　7. 2. 7 无水乙醇(ethanol) 。

　　7. 2. 8 实时荧光 PCR混合试剂(Real-time PCR Master Mix) 。

　　8 取样及样品处理

　　8. 1 取样用具

　　8. 1. 1 样品袋 :牛皮纸袋或信封(一次性使用) 。

　　8. 1. 2 枝剪 。

　　8. 1. 3 剪刀 ,镊子 ,打孔器 。

　　8. 1. 4 研钵 。

　　8. 1. 5 塑料离心管(1. 5 mL) 。

　　8. 1. 2~ 8. 1. 5 的取(制)样用工具应经 121℃ ±2℃ , 15min高压蒸汽灭菌 。 田间采样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后 ,工具应用 70%酒精棉球擦拭 2 次以上 , 以避免样品间相互污染 。

　　8. 2 取样方法

　　8. 2. 1 实地取样

　　产地检疫田间实地取样参照 GB 5040。

　　8. 2. 2 叶片样品

　　疑似病树按树冠东南西北四方采集 ,每点取中下部成熟叶片各 5 片 ,每棵树共采集叶片 20张 。

　　种苗抽取显现疑似症状 植 株 或 随 机 抽 取 植 株(无 症 材 料) 10株 , 每 株 取 中 下 部 成 熟 叶 片 5 片 , 共50片 。

　　接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品 。

　　黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录 D。

　　8. 2. 3 果实样品

　　幼果期采样 ,切取果柄和果蒂 ,每样品采集 4份 ;商品鲜果每批果实随机抽取 10个果实 ,切取果柄和果蒂 。

　　3

　　GB/T 28062—2011

　　8. 2. 4 传病媒介柑桔木虱

　　在柑桔新梢抽发期 ,每株树采集 1 头 ~ 10头成虫 ,每园采集 50头以上 ; 口岸或调运种苗 、接穗等材料中发现的木虱则直接收集 。用 75%乙醇浸泡固定 30min。放入 1. 5 mL离心管封装 。

　　样品采集后立即装入样品袋(木虱用 75%乙醇杀死固定后装入微量离心管) ,并按照要求填写采样记录 ,记载样品来源 、样品品种 、目测症状 、采样人 、采样地 、采样时间等 ,及时送指定检测实验室 。

　　8. 3 样品贮运与保存

　　采集的植株样品按上面要求用样品袋分装 , 乙醇固定的柑桔木虱控干乙醇后用塑料离心管分装 ,与采集记录一并寄送指定实验室检测 。检测后余下的植物材料可置于 4 ℃条件下保存 7d, 以备复测的需要 。不需保存的样品应立即进行无害化灭菌处理以防止病害扩散 。

　　8. 4 样品 DNA 制备操作(在检测实验室样品制备区进行)

　　样品 DNA制备在检测实验室样品制备区进行 。制备好的 DNA 样本在 4 ℃条件下保存应不超过7 d,在 -20℃冻存不超过 30d,避免反复冻融 。

　　样品 DNA制备的具体操作过程见附录 E。

　　9 PCR扩增

　　PCR扩增反应体系为 25μL。准备 PCR扩增反应管 ,分别加入反应液 23μL,最后加入制备的待测样品 DNA 2 μL。每个样品设置 3 次 重 复 。 每 次 PCR 检 测 应 设 立 相 应 的 阳 性 对 照 、阴 性 对 照 和 空 白对照 。

　　扩增过程中 ,设置在每次循环的延伸阶段采集荧光 。

　　荧光染料法检测须在扩增结束后立即进行熔解曲线分析 , 以验证扩增的特异性 。熔解曲线的反应程序为 :95℃ ,1 min; 55℃ ,1 min;然后从 55℃开始每升高 0. 5 ℃保持 10 s,连续升高 80次(到 95℃为止) 。

　　检测结束后 ,根据采集的荧光曲线和 Ct值判定结果 。

　　PCR扩增的准备及扩 增 具 体 操 作 过 程 见 附 录 F(使 用 不 同 PCR 仪 具 体 扩 增 程 序 参 数 可 能 稍 有调整) 。

　　推荐使用柑桔黄龙病菌亚洲种实时荧光 PCR检测试剂盒 。试剂盒组成 、功能及使用注意事项参见附录 G。

　　10 结果判定与表述

　　10. 1 结果分析条件设定

　　直接读取检测结果 。检测阈值设定应根据仪器噪声情况进行调整 , 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 。

　　10. 2 质控标准

　　10. 2. 1 阴性对照及空白对照应无 Ct值并且无扩增曲线 。否则 ,此次检测视为无效 。

　　10. 2. 2 阳性对照的 Ct值应<28. 0,并出现典型的扩增曲线 。否则 ,此次检测视为无效 。

　　4

　　GB/T 28062—2011

　　10. 3 结果判定

　　10. 3. 1 阴性反应

　　测试样品检测 Ct值 ≥40或者无 Ct值并 且 无 扩 增 曲 线 , 且 阴 性 对 照 、阳 性 对 照 、空 白 对 照 结 果 正常 ,判定该样品为阴性 ,表示该样品中不带可检出的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 。

　　10. 3. 2 阳性反应

　　荧光探针法检测时 ,样品 Ct值 ≤35, 出现典型的扩增曲线 ,且阴性对照 、阳性对照 、空白对照结果正常 ,判定该样品为阳性 ,表示该样品中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 。

　　荧光染料法检测时 ,Ct值 ≤35, 出现典型的扩增曲线 ,且阴性对照 、阳性对照 、空白对照结果正常 ;熔解曲线为单峰 ,并且熔解曲线与预期目标扩增产物熔解曲线一致 ,或熔解曲线出现双峰 ,其中一个峰为引物二聚体 ,另一个峰的熔解曲线与预期目标产物熔解曲线一致 ,则判定该样品为阳性 ,表示该样品中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 。

　　10. 3. 3 特殊情况

　　实时荧光 PCR检测样品 Ct值大于 35的样品但小于 40,建议用同一样品模板量加倍(相应减少加入灭菌超纯水量)进行实时荧光 PCR复测 。复测的结果按上述判定标准判定是否带柑桔黄龙病菌 ;如果 Ct值仍大于 35,判定为阴性 。

　　5

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　柑桔黄龙病菌其他信息

　　A. 1 寄主及分布

　　主要分布在亚洲地区的印度 、日本 、菲律宾等东南亚国家以及中国的部分地区 。 寄主为柑桔类植物 ,柑桔属 、金柑属和枳属植物受害严重 。也可低度浸染芸香科的九里香 、黄皮 ,特殊情况下也可侵染长春花等非芸香科植物 。

　　A. 2 传播方式

　　带菌种苗 、接穗及其上附着的传播媒介昆虫柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayamd)是远距离传播的主要途径 , 田间则主要由柑桔木虱取食传播以及嫁接传播 。

　　6

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌常规 PCR检测(Hocquellet, 1999)

　　B. 1 采样及样品制备

　　同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 PCR检测 。

　　B. 2 PCR扩增

　　B. 2. 1 引物名称及序列

　　LafA2: 5’-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3’

　　LafJ5: 5’-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’

　　B. 2. 2 PCR反应体系

　　PCR反应体积为每管 25μL。25μL的反应体系中含有终浓度为 1×PCR缓冲液 、1μmol/L引物对LafA2/LafJ5(序列见 B. 2. 1)以及适量模板进行 PCR扩增 。预期扩增片段大小为 669bp。

　　B. 2. 3 PCR反应程序

　　预变性 94℃/5min;然后 92℃变性 20 s, 62℃退火 20 s, 72℃延伸 45 s共 35个循环 ; 72℃延伸7 min,4 ℃保温 。PCR扩增结束后 , 以 2%的琼脂糖凝胶电泳 ,然后通过紫外成像系统成像 。保存成像图片作为结果判定依据 。

　　B. 3 结果判定与描述

　　B. 3. 1 质控标准

　　扩增结果经电泳在阴性对照和空白对照泳道无扩增条带 , 阳 性 对 照 泳 道 有 669bp大 小 的 预 期 片段 ,结果视为有效 。否则检测无效 ,应重新进行检测 。

　　B. 3. 2 阴性反应

　　在电泳图片中样品泳道不出现 669bp大小的预期扩增片段 , 阴性对照 、阳性对照和空白对照正常 ,判定为阴性 ,表示样品中无可检出的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌 。

　　B. 3. 3 阳性反应

　　在电泳图片中样品泳道有 669bp大小的预期扩增片段 , 阴性对照 、阳性对照和空白对照正常 ,判定为阳性 ,表示样品中存在柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌 。

　　7

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌实时荧光 PCR检测

　　C. 1 采样及样品制备

　　同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光 PCR检测 。

　　C. 2 PCR扩增

　　C. 2. 1 引物和探针(依据美洲韧皮杆菌 16S rRNA基因特异序列设计的引物对及探针)

　　C. 2. 1. 1 引物名称及序列

　　HLBLamF:5’-GAGCGAGTACGCAAGTACTAG-3’

　　HLBLamR:5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’

　　C. 2. 1. 2 探针名称及序列

　　HLBLamP:5’FAM/AGACGGGTGAGTAACGCG/BHQ-3’

　　C. 2. 2 PCR反应体系

　　PCR反应体积为每管 25μL。25μL的反应体系中含有终浓度为 1×PCR MasterMix、0. 6μmol/L引物对 HLBLam F/HLBLam R、探针 HLBLam P 0. 3 μmol/L以及适量模板 。

　　C. 2. 3 PCR反应程序

　　预变性 95℃/20s;然后 95 ℃变性 1s,58℃退火 40s,共 40个循环 ,仪器设置在每个循环的退火延伸阶段自动采集荧光 。验证检测结束后 ,根据采集的荧光曲线和 Ct值判定结果 。

　　C. 3 结果判定

　　C. 3. 1 结果分析条件设定

　　直接读取检测结果 。 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整 , 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 。

　　C. 3. 2 质控标准

　　C. 3. 2. 1 阴性对照和空白对照无 Ct值并且无扩增曲线 。检测结果有效 ,否则此次实验视为无效 。

　　C. 3. 2. 2 阳性对照的 Ct值<28,并出现典型的扩增曲线 。否则 ,此次实验视为无效 。

　　C. 3. 3 结果判定及描述

　　C. 3. 3. 1 阴性反应

　　样品无 Ct值并且无扩增曲线 ,且阳性对照 、阴性对照和空白对照结果正常 ,判定为阴性 ,表示样品中无可检出的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter americanus,Lam) 。

　　8

　　GB/T 28062—2011

　　C. 3. 3. 2 阳性反应

　　Ct值 ≤35,并出现典型的扩增曲线 ,且阳性对照 、阴性对照和空白对照结果正常 ,判定为阳性 ,表示样品中存在柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter americanus,Lam) 。

　　C. 3. 3. 3 其他情况

　　若实时荧光 PCR检测的 Ct值大于 35,建议同一样品加大样品量(加倍)重新进行荧光 PCR。 复测的结果按上述标准判定 ,若 Ct值仍大于 35,判定为阴性 。

　　9

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　柑桔黄龙病的症状鉴定

　　D. 1 柑桔黄龙病症状

　　D. 1. 1 叶片症状(图 D. 1)

　　当年抽生的春梢叶片转绿后 ,沿叶脉附近 、叶片基部或边缘不均匀的黄化 ,形成黄绿相间的斑驳症状 。而柑桔叶片缺锌 、缺锰症状的黄化沿叶脉间均匀分布 。

　　图 D. 1 柑桔黄龙病叶片初期斑驳症状

　　D. 1. 2 枝梢症状(图 D. 2)

　　夏秋梢 :5 月 ~ 8 月抽生的夏梢与 8月 ~ 10月抽生的秋梢症状表现基本相同 ,病梢一般出现在树冠顶部 ,多数仅 1 梢 ~ 2 梢或少数几梢出现 。感病的夏秋梢在叶片老熟过程中往往叶脉先变黄 , 随后叶肉由淡黄绿变成黄色 ,均匀黄化 ,形成黄梢 。 当年感病的黄梢落叶成秃枝 ,翌年春季重新萌发的新梢短而纤弱 , 叶片窄小 。

　　图 D. 2 柑桔树冠黄梢症状

　　D. 1. 3 果实症状(图 D. 3, 图 D. 4)

　　柑桔病果外形变小 、畸形 ,果内维管呈黄褐色(正常果实维管束为绿白色) ,种子变褐败育 ,有的品种病果可以形成下部青色 ,上部橙红色的 “红鼻果 ”。

　　10

　　GB/T 28062—2011

　　图 D. 3 柑桔黄龙病芦柑“红鼻果”病果 图 D. 4 柑桔黄龙病病果剖面不对称症状

　　D. 2 柑桔黄龙病鉴定步骤

　　D. 2. 1 通过症状鉴定

　　D. 2. 1. 1 叶片斑驳 :首先观察中脉基部及叶脉附近是否有不均匀分布的黄化病斑 ,再看叶缘是否有黄化病斑 。黄龙病所致黄化病斑呈浅黄色 ,与周围绿色叶肉分界不如缺锌症状明显 ,而缺锰引起的黄化通常分布均匀 。

　　D. 2. 1. 2 树冠黄梢 :病树上部个别枝梢叶片黄化 , 叶脉变黄 , 叶片发脆 。若天牛为害则枝梢叶片中脉均匀黄化或全树黄化 。

　　D. 2. 1. 3 果实畸形 :病树果实畸形、变小 ,歪斜 ,果皮内维管黄褐色(键果维管束绿白色) ,果实种子败育 。

　　D. 2. 2 通过柑桔木虱鉴定

　　柑桔木虱为同翅目的木虱科昆虫 ,传播亚洲韧皮部杆菌的为亚洲柑桔木虱 ,传播非洲柑桔韧皮部杆菌的为非洲二点木虱(柑桔木虱见图 D. 5) 。

　　a) 亚洲柑桔木虱 b) 非洲二点木虱A— 卵 ;

　　B— 若虫 ;

　　C— 成虫 。

　　图 D. 5 柑桔木虱

　　柑桔木虱成虫吸食嫩梢状见图 D. 6,柑桔木虱若虫取食及分泌蜜露见图 D. 7。

　　11

　　GB/T 28062—2011

　　图 D. 6 柑桔木虱成虫吸食嫩梢状 图 D. 7 柑桔木虱若虫取食及分泌蜜露

　　12

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　样品处理试剂配制及样品 DNA提取

　　E. 1 样品处理试剂配制

　　除非特殊说明 ,本标准所有样品制备试剂均用无菌容器分装 ,常温保存备用 。

　　E. 1. 1 TES 缓 冲 液 (pH 8. 0) : 10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, 1% SDS, 121 ℃ 高 压 灭 菌20min。

　　E. 1. 2 TE缓冲液(pH 8. 0) :10mmol/LTris-Cl,1 mmol/L EDTA,121℃高压灭菌 20min。

　　E. 1. 3 蛋白质变性剂 :7 mol/L Guanidinge HCl(盐酸胍) 。

　　E. 1. 4 10mg/ml蛋白酶 K, -20℃冰箱保存 。

　　E. 2 样品 DNA提取

　　E. 2. 1 工作台及操作者消毒灭菌 :样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行;工作台和操作者双手应消毒灭菌 。

　　E. 2. 2 待测柑桔组织样品或柑桔木虱 DNA制备

　　E. 2. 2. 1 将柑桔叶片或果实用清水洗净 , 吸水纸擦干 ,撕取叶片中脉或果柄 、果蒂 ,放于研钵中 ,加入液氮研成粉末 ,或直接用剪刀剪碎(每一样品处理换干净研钵 ,剪刀用后以医用酒精擦拭并用火焰灼烧防止交叉污染) ,取约 200mg碎屑装入 1. 5 mL离心管中 ;或取柑桔木虱 5 头 ,装入 1. 5 mL离心管中 ,用 Tip头尖捣碎 。

　　E. 2. 2. 2 离心管中加入 800μLTES缓冲液 65℃水浴中预热 10min和 10μL的蛋白酶 K液(10μg/μL) ,混合均匀后置于 65℃水浴 1 h,其间振荡 2 次 。

　　E. 2. 2. 3 吸取上清液转入 1. 5 mL离心管 ,按照 1 ∶ 2 的比例加入蛋白质变性剂 ,混合均匀后 ,在室温下放置 10min。

　　E. 2. 2. 4 10000g离心 10min后 , 吸取上清液加入微滤柱中 ,10000g离心 1 min,弃滤过液 ,

　　E. 2. 2. 5 向微滤柱中加入 75%乙醇 750μL,10000g 离心洗涤 1 min,弃滤过液 。如微滤柱滤膜上有黄褐色沉淀 ,应再加 75%乙醇重复洗涤直到洗去黄褐色沉淀 。

　　E. 2. 2. 6 10000g离心 1 min以除去残余乙醇 。

　　E. 2. 2. 7 向柱中加入 50μLTE缓冲液 ,10000g离心 1 min,收集洗脱液约 40μL, 即为后续 PCR步骤中的待测样品模板 。

　　E. 2. 3 阳 性 对 照 : 按 照 上 述 方 法 提 取 确 诊 的 柑 桔 黄 龙 病 典 型 斑 驳 叶 片 中 脉 DNA 或 以 浓 度 为0. 44pg/μL的病菌特异 DNA序列无害化重组质粒 DNA作为阳性对照(推荐) 。

　　E. 2. 4 阴性对照 : 按照上述方法提取健康的柑桔成熟叶片中脉 DNA作为阴性对照 。

　　13

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　检测试剂配制及实时荧光 PCR检测

　　F. 1 扩增试剂配制(在反应试剂配制区进行)

　　F. 1. 1 用无菌超纯水配制 25μmol/L亚洲韧皮杆菌特异性引物对 CQULasF 03/CQULas R 03母液(用 于 荧 光 染 料 法 , 引 物 序 列 为 5’-CAAGGAAA GAGCGTAGAA-3’/5’-CCTCAAGATCG GGTA AA G-3’,扩增柑桔黄龙病菌亚洲种 rplJ/rplL特异基因序列片段为 382bp) 。

　　F. 1. 2 以无菌超纯水配制 25μmol/L亚洲韧皮杆菌特异性 引 物 对 CQULasF04/CQULasF04母 液 : (用于荧光探针法 , 序列为 5’-TGGAGGTGTAAAAG TTGCCAAA-3’/5’-CCAACGAAAAG ATCA GATATTCCTCTA- 3’,扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 rplJ/rplL特异基因靶序列片段为 87bp) 。

　　F. 1. 3 以无菌超纯水配制 25μmol/L荧光标记探针 CQULasP1母液(序列为 5’-ATCGTCTCGTCA AGATTGC TA TCCGTGATACTAG- 3’) 。

　　F. 2 加样 (在反应试剂配制区进行)

　　F. 2. 1 方法 1 试剂盒方法(推荐方法)

　　从固相化试剂盒中取出 0. 2 mL PCR 固相化试剂检测管 ,管中分别加入 23μL样品恢复液 ,再在不同管中分别加入 2μL待测样品 DNA液 、阳性对照 、阴性对照 、空白对照(灭菌超纯水) ,盖紧管盖 ,转移至 PCR反应区 。

　　F. 2. 2 方法 2 自配试剂方法

　　F. 2. 2. 1 荧光染料法(反应体系为 25μL)

　　F. 2. 2. 1. 1 加入引物对 CQULasF03/CQULas R03母液到实时荧光 PCR Master Mix 中 ,加入适量灭菌超纯水 ,使反应液中引物终浓度为各 0. 3 μmol/L,1×PCR Master Mix,振荡混匀 。

　　F. 2. 2. 1. 2 取 0. 2 mL PCR反应管 ,编号后每管中加入 23μL上步所配反应液 。

　　F. 2. 2. 1. 3 反应管中分别加入待测样品 DNA液 2μL/每管 ; 以新鲜制备的阴性对照 、阳性对照和空白对照 2μL/每管代替待测样品设置对照 ,盖紧试管盖 ,3000g 瞬时离心 , 以混匀并去除气泡 。

　　F. 2. 2. 1. 4 转移至 PCR检测区 。

　　F. 2. 2. 2 荧光探针法(反应体系为 25μL)

　　F. 2. 2. 2. 1 在避光条件下加入引物母液 CQULasF04/CQULas R04和荧光标记探针 CQULasP1母液到实时荧光 PCR Master Mix 中 ,加入适量灭菌超纯水 ,使反应液中引物对终浓度为各 0. 3 μmol/L,探针浓度为 0. 3 μmol/L,1×PCR Master Mix,振荡混匀 。

　　F. 2. 2. 2. 2 取 0. 2 mL PCR反应管 ,编号后每管中加入 23μL上步所配反应液 。

　　F. 2. 2. 2. 3 分别加入待测样品 DNA液 2μL/每管 ; 以新鲜制备的阴性对照 、阳性对照和空白对照(灭菌超纯水)2μL/每管代替待测模板设置对照 ,盖紧试管盖 ,3000g 瞬时离心 , 以混匀并去除气泡 。

　　F. 2. 2. 2. 4 转移至 PCR检测区 。

　　F. 3 实时荧光 PCR检测(在检测区进行)

　　设置好各反应管在实时荧光 PCR仪上的孔位并做好标记记录 ,按照预设孔位将各检测样品及对照

　　14

　　GB/T 28062—2011

　　放入荧光 PCR仪内进行 PCR扩增 。

　　F. 3. 1 荧光染料法 PCR扩增

　　F. 3. 1. 1 扩增程序

　　在 iCyclerTM (Bio-Rad,USA)实时荧光 PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号 PCR仪扩增程序参数可能稍有变化) :

　　— 94℃预变性 5 min;

　　— 95℃变性 5 s,然后 59℃退火 15s,72℃延伸 45s,共 40个循环 ;设置在每个循环的延伸阶段自动采集荧光 ;

　　— 末次延伸 72℃ ,7 min。

　　F. 3. 1. 2 熔解曲线分析

　　PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析 , 以验证扩增的特异性 。熔解曲线的反应程 序 为 : 95 ℃ , 1 min; 55℃ ,1 min;然后从 55℃开始每升高 0. 5 ℃保持 10s,连续升高 80次(到 95℃为止) 。

　　验证检测结束后 ,设备自动记录并生成报告 。根据采集的荧光曲线和 Ct值判定结果 。

　　F. 3. 2 荧光探针法扩增程序

　　在 iCyclerTM (Bio-Rad,USA)实时荧光 PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号 PCR仪扩增程序参数可能稍有变化) :

　　— 预扩增 95℃ ,1 min;

　　— 95℃ ,15s,59℃ ,15s,72℃ ,45s,40个循环 ;在每个循环延伸阶段(72℃)同步采集荧光 ;

　　— 末次延伸 72℃ ,7 min。

　　检测结束后 ,根据采集的荧光曲线和 Ct值判定结果 。

　　15

　　GB/T 28062—2011

　　附 录 G

　　(资料性附录)

　　柑桔黄龙病菌亚洲种实时荧光 PCR检测试剂盒组成及使用说明

　　G. 1 试剂盒组成

　　每个试剂盒可做 48个检测 ,包括以下成分 :

　　样品制备液 Ⅰ

　　50mL×1瓶

　　样品制备液 Ⅱ

　　10mL×5 管

　　样品制备液 Ⅲ

　　20mL×1瓶

　　阴性对照 (健康柑桔叶片 DNA)

　　100ng/管 × 2 管

　　阳性对照(柑桔黄龙病菌亚洲种重组质粒 DNA)

　　100ng/管 × 2 管

　　固相化试剂检测管

　　八联管 × 6条

　　恢复液

　　10mL×5 管

　　G. 2 试剂盒说明

　　G. 2. 1 样品制备液 I:主要成分为三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、乙二胺四乙酸(EDTA)和十二烷基磺酸钠(SDS) ,外观为无色液体 ,常温保存时可能有絮状沉淀 ,使用前应在 65℃下水浴加热溶解沉淀 。使用前按说明书要求加入蛋白酶 K水溶液 。

　　G. 2. 2 制备液 Ⅲ第一次使用时应按包装上注明的剂量加入无水乙醇 ,然后常温密闭保存备用 ,可保存2个月 。

　　G. 2. 3 恢复液用于溶解荧光 PCR 固相化混合试剂 。

　　G. 2. 4 用于荧光染料法检测的固相试剂检测管中包含除待测样品 DNA外的所有 PCR 扩增反应试剂及荧光染料 ,用于荧光探针检测的固相化试剂检测管中包含除待测模板 DNA 外的所有 PCR 反应试剂

　　及荧光探针 。

　　G. 3 功能

　　所列试剂盒可用于柑桔黄龙病叶片和果实等组织样品中柑桔黄龙病菌亚洲种的实时荧光 PCR 检测和病害鉴定 。若需检测样品带菌量 ,则样品和阳性对照都需要定量 。具体操作按使用说明进行 。

　　16

　　GB/T 28062—2011

　　G. 4 试剂盒使用注意事项

　　G. 4. 1 发生褐变的柑桔组织材料不可用作 PCR检测的样品 。

　　G. 4. 2 在检测过程中 ,应严防不同样品间的交叉污染 ,所有用具应彻底清洗并消毒 。移液器头尖应 一次性使用 ,并且转移每个样品时都应更换 。

　　G. 4. 3 全部检测过程可在室温(23℃)下进行 。试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存 ,使用时取出所需数量 ,剩余部分立即放回干燥器中 。

　　17