GB/T 28063-2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28063—2011

　　菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofbean pod mottlevirus

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28063—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :廖富荣 、沈建国 、郑耘 、陈青 、林石明 、陈红运 、黄蓬英 、吴媛 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28063—2011

　　菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了菜豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法 。

　　本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子 、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定 ,也适用于传播该病毒介体昆虫的检测鉴定 。

　　2 菜豆荚斑驳病毒基本信息

　　中文名 :菜豆荚斑驳病毒 。

　　英文名 :bean pod mottle virus。

　　异名 :bean pod mottle comovirus(菜豆荚斑驳病毒) , pod mottle virus(荚 斑 驳 病 毒) , desmodium virus(金钱草病毒) 。

　　英文缩写 :BPMV。

　　属豇豆花叶病毒科 Comoviridae、豇豆花叶病毒属 Comovirus。

　　菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 、反转录和体外 DNA 扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定 。

　　4 主要仪器设备

　　本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备 :

　　微量榨汁机 、酶标仪 、洗板机 、微量天平(感量 :0. 001 g) 、PCR 仪 、荧光 PCR 仪 、电泳仪 、水平电泳槽 、凝胶成像仪 、高速冷 冻 台 式 离 心 机 、水 浴 槽、pH 计 和 各 种 量 程 的 可 调 移 液 器(1 000 μL、200 μL、 100 μL、20 μL、2 μL) 。

　　5 检测样品的制备

　　5. 1 DAS-ELISA 和 IC-RT-PCR检测样品的制备

　　对每批送检样品进行症状检查 ,优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始) ,或者选取具有斑驳 、皱缩 、褪绿等症状的叶片 。

　　种子样品:称取 0. 5 g~ 1. 0 g 的种皮作为检测样品,在液氮中充分研磨 , 回温后按 1 ∶ 10 比例加入样品提取缓冲液继续研磨 。

　　叶片样品:称取 0. 5 g~ 1. 0 g 的叶片作为检测样品,在研钵中研磨或在液氮中研磨 ,按 1 ∶ 10 比例加入样品提取缓冲液继续研磨 。

　　把研磨后的样品转移到 5 mL离心管中 , 8 000 r/min离心 5 min,上清液作为 DAS-ELISA(见附录 B)和 IC-RT-PCR(见附录 C)检测提取液 。

　　注 : 提取液在 3 h 内使用 ,否则保存在 4 ℃中 。

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　　5. 2 RT-PCR检测样品的制备

　　称取表现症状的 0. 1 g 叶片 、种子等样品在液氮中充分研磨后 ,利用 TRIzol方法提取 RNA。 (见附录 D 中的 D. 3)

　　6 检测与鉴定

　　6. 1 检测鉴定流程

　　通常 ,初筛时采用 DAS-ELISA 检 测 方 法 。 当 DAS-ELISA 产 生 阳 性 结 果 时 , 再 采 用 IC-RT-PCR或 RT-PCR等方法进行验证 。

　　当首先采用 IC-RT-PCR或 RT-PCR方法检测时 ,如果产生阳性结果 ,则通过实时荧光 RT-PCR方法或序列测定等方法验证 。

　　6. 2 DAS-ELISA检测

　　把制备的样品上清液加入已包被 BPMV抗体的在 96微孔板中 ,进行 DAS-ELISA检测 ,每个样品平行加到两个孔中 。用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 BPMV 的植物组织作阳性对照 ,用样品提取缓冲液作空白对照 ,其中阴性对照种类和材料(如 :种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致 。

　　具体操作过程见附录 B。

　　6. 3 RT-PCR检测

　　分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后 ,进行 PCR扩增 。用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 BPMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。

　　具体操作过程见附录 D。

　　6. 4 IC-RT-PCR检测

　　把制备的样品上清液加入已包被 BPMV 抗体的离心管中 , 然后进行 RT-PCR 扩增 。 用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 BPMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。

　　具体操作过程见附录 C。

　　6. 5 序列测定

　　将 PCR产物回收后 ,进行克隆 、测序 ,或者直接测序 ,测序可由生物公司完成 。把测序所得到的核苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的 BPMV 相应序列进行比对 ,如果与已知的 BPMV 相应序列同源性大于 75%则判定为 BPMV序列 , 同源性小于 75%则判定为非 BPMV序列 。

　　注: 序列比对可利用 NCBI网站上的 BLAST软件进行,网址为 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/

　　7 结果判定与报告

　　7. 1 结果判定

　　当产生以下检测结果时 ,则判定为检出 BPMV:

　　— 当 DAS-ELISA检测 、IC-RT-PCR(或 RT-PCR)检测 、其中两种方法的检测结果呈阳性时 ,则判定为检出 BPMV;

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　　— 当 IC-RT-PCR 或 RT-PCR 检 测 结 果 呈 阳 性 , 测 定 的 序 列 为 BPMV 序 列 时 , 则 判 定 为 检 出BPMV。

　　7. 2 结果记录与保存

　　记录各项实验数据 ,包括样品种类 、来源 ,检测时间 、地点 、方法和结果等 。DAS-ELISA 检测结果保存吸光值的数据报 告 , IC-RT-PCR 或 RT-PCR 检 测 结 果 保 存 电 泳 照 片 , 序 列 测 定 结 果 保 存 测 序 报告图 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　菜豆荚斑驳病毒简介

　　A. 1 分布地区

　　北美洲 :美国 、加拿大 。

　　南美洲 : 巴西 、厄瓜多尔 、秘鲁 。

　　亚洲 :伊朗 。

　　A. 2 形态特征

　　病毒粒子形态为等轴对称二十面体 ,无包膜 ,直径为 28 nm。

　　A. 3 寄主范围及症状

　　BPMV 的 寄 主 局 限 于 豆 科 植 物 , 主 要 是 大 豆 (Glycine max) 和 菜 豆 (Phaseolus spp. ) , 山 蚂 蟥(Desmodium paniculatum)是其多年生寄主 。

　　在鉴别寄主植物上的症状 :

　　大豆(Glycinemax) :表现为 严 重 的 系 统 症 状 , 叶 片 斑 驳 、皱 缩 、荚 和 种 子 斑 驳 , 甚 至 坏 死 、植 株 死亡 。该病毒还能延迟大豆茎杆成熟,引起 “绿茎 ”现象 。在种子上产生褐色 、黑色的斑驳症状 ,症状从种脐开始 , 因而称为 “种脐渗色 ”。

　　菜豆(Phaseolusvulgaris) Tendergreen品种 :起初出现褪绿斑 ,后发展为严重的系统褪绿 , 叶片畸形 ,豆荚严重斑驳 、深绿色 、豆荚变短 、畸形 、扭曲 、变得粗糙有疣状突起 。

　　菜豆(P. vulgaris) Pinto品种 :无系统症状 ,接种后约 3 d~ 4 d 出现散生的红色局部枯斑 ,接种叶有时叶脉坏死 。

　　菜豆(P. vulgaris) Bountiful品种 :无系统症状 ,接种后约 3 d~4 d 出现大的淡黄色局部病斑 。

　　A. 4 传播途径

　　BPMV可以通过昆虫介体传播 ,主要是大豆叶甲(Cerotomatrifurcata) ,而玉米根叶甲(Diabrotica virgifera) 、带斑黄瓜叶甲(D. balteata) 、点斑黄瓜叶甲(D. undecimpunctatahowardii) 、葡萄甲虫(Co- laspisflavida) 、甲虫(C. lata) 、曲条豆芫菁(Epicautavittata) 、墨西哥叶甲(Epilachnavarivestis)和大豆潜叶虫(Odontotahorni[Xenochalepushorni])也是该病毒的传播介体 。

　　该病毒另外还可以机械传播 ,嫁接传播 , 以及通过种子进行远距离传播 。从感染 BPMV 植株上收获的种子 ,其种传率为 0. 10% ,种传率相对较低 。 与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) 一起感染 ,种传率可以达到 39% 。

　　A. 5 血清学特性

　　BPMV具有很强的免疫原性 ,制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片 、种子 、草本寄主植物和介体昆虫中的病毒 。

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　　A. 6 分子生物学特性

　　BPMV是正链 RNA病毒 ,其基因组由两条正链 RNA-1(约 3. 6 kb)和 RNA-2(约 6. 0 kb)组成 ,分别包裹在两个直径为 28 nm 的等轴多面体粒体中 。RNA-1编码 5 个复制所需的蛋白 ,RNA-2编码 一个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白 。

　　A. 7 豇豆花叶病毒属种间区分依据

　　A. 7. 1 大外壳蛋白(Large coatprotein, LCP)的氨基酸序列同源性小于 75% 。

　　A. 7. 2 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于 75% 。

　　A. 7. 3 在可能的成分间没有假重组 。

　　A. 7. 4 抗原反应有差异 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　DAS-ELISA检测操作步骤

　　B. 1 DAS-ELISA所采用的试剂

　　B. 1. 1 包被缓冲液(pH9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 20 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 HCl调节 pH值到 9. 6,然后加水至 1 L。

　　B. 1. 2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7. 4)

　　氯化钠 (NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾 (KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　叠氮化钠 (NaN3 ) 0. 2 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4,然后加水至 1 L。

　　B. 1. 3 PBST

　　每升 PBS中加入 0. 5 mL 的 Tween-20。

　　B. 1. 4 样品提取缓冲液(pH7. 4)

　　PBST+2% PVP (PVP-40聚乙烯基吡咯烷酮) 。

　　B. 1. 5 酶标抗体稀释缓冲液

　　PBST+2% PVP+0. 2%卵白蛋白 。

　　B. 1. 6 底物缓冲液

　　二乙醇胺 97 mL

　　蒸馏水 600 mL

　　叠氮化钠 (NaN3 ) 0. 2 g

　　用 HCl调整 pH 至 9. 8,然后加 H2 O 到 1 L。

　　注 : 缓冲液可以储存在 4 ℃ ~ 10 ℃中至少 2个月 ,使用前回温至室温 。

　　B. 1. 7 抗体

　　BPMV包被抗体 、碱性磷酸酶标记的 BPMV抗体 。

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　　B. 2 操作步骤

　　B. 2. 1 包被

　　根据检测试剂盒说明 ,用包被缓冲液稀释 BPMV抗体(如 1 ∶ 200) ,在微孔板中每孔加入 100μL包被抗体溶液 。在室温下孵育 2 h~4 h或 4 ℃下包被过夜 。

　　B. 2. 2 捕获抗原

　　倒去孔中的抗体包被溶液 ,用 PBST洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。加入 100 μL检测样品提取液到酶标板的孔中 ,每个样品至少两个孔 。并设置阳性和阴性对照 。在室温下孵育 2 h 或 4 ℃下过夜 。

　　B. 2. 3 加入酶标抗体

　　根据试剂盒说明 ,用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如 1 ∶ 200) 。倒去孔中的检测样品提取液 ,用 PBST洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。 每 孔 加 入 100 μL酶 标 抗 体 溶 液 。 在 室 温 下 孵 育2 h。

　　B. 2. 4 加底物

　　用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(p-NitrophenylPhosphate,pNPP) 配制成 1 mg/mL 的底物溶液 。倒去酶标抗体溶液 ,用 PBST洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。 每孔加入 100 μL新鲜配制的底物溶液 。室温下避光放置(约 30 min~ 60 min) ,至阳性对照孔明显显色 。

　　B. 2. 5 吸光值的测定

　　用酶标仪在 405 nm 处读取吸光值 。

　　B. 2. 6 结果判定

　　通过酶标仪上 405 nm 的 OD值来判定 。

　　对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 。 阳性对照有明显的颜色反应 ;孔的重复性基本一致 。在满足了该要求后 ,结果原则上可判断如下 :

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显 >2,判为阳性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显<2,判为阴性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重新做一次 ,或用其他方法加以验证 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　IC-RT-PCR检测操作步骤

　　C. 1 主要试剂

　　BPMV抗体 、包被缓冲液和 PBST试剂见 B. 1;RT-PCR试剂见 D. 1。

　　C. 2 包被抗体

　　根据检测试剂说明 ,将包被抗体用包被缓冲液稀释(如 1 ∶ 200) ,取 50 μL~ 100 μL稀释好的包被溶液于 0. 6 mL的离心管中 。25 ℃中放置 3 h或 4 ℃冰箱中过夜 ,然后用 PBST缓冲液洗涤 3 次 ~ 5 次 ,去除残留溶液 。

　　C. 3 抗原捕捉

　　向每个已包被抗体的离心管中加入检测样品上清液 100 μL,25 ℃下放置 2 h~ 3 h 或 4 ℃冰箱中放置过夜 ;加入 PBST缓冲液洗涤 3 次 ~ 5 次 ,双蒸水洗涤 1 次 ,去除残留溶液 。

　　注 : 如果是用于验证 DAS-ELISA 的检测结果 ,可直接使用血清学检测样品的剩余提取液 。

　　C. 4 cDNA合成

　　在上述 离 心 管 中 加 入 1 μL 的 BPM4引 物(10 μmol/L) 、37. 5 μL 的 ddH2 O(经 DEPC处 理) , 于95 ℃的水浴中处理 7 min,然后迅速冰浴 5 min;继续加入 5× RT 缓冲液 10 μL、10 mmol/L的 dNTP混合物 0. 5 μL、M-MLV 反 转 录 酶 0. 5 μL、RNase Inhibitor0. 5 μL;然 后 37 ℃水 浴 1 h, 95 ℃水 浴10 min,冷却后作为 PCR扩增模板 。

　　C. 5 PCR扩增

　　在 25 μL的 反 应 体 系 中 : 2. 5 μL 的 10× PCR buffer(含 20 mmol/L 的 Mg2+ ) , dNTP(每 种 各10 mmol/L) 0. 5 μL, Taq DNA 聚 合 酶 (2. 5 U/μL) 0. 5 μL, BPM3 和 BPM4 引 物 (10 μmol/L) 各1. 0 μL(引物见表 D. 1) ,加入上述 DNA模板 10 μL,ddH2 O 补足体积 。

　　与 D. 5 反应程序相同 ,反应完成后 , 取 5 μL扩增产物在 1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳 , 然后用EB染色 ,在凝胶成像系统上观察 。

　　C. 6 结果判定

　　阴性对照和空白对照没有产生条带 、阳性对照产生预期大小(约 228bp)的条带情况下 :

　　— 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阳性 ;

　　— 如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阴性 。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测操作步骤

　　D. 1 主要试剂

　　D. 1. 1 RNA提取试剂

　　TRIzolreagent、三氯甲烷 、异丙醇 、70%乙醇 。

　　D. 1. 2 反转录试剂

　　M-MLV反转 录 酶(200U/μL) 、5×反 应 缓 冲 液(250 mmol/L Tris-HClpH8. 3 25 ℃ 、375 mmol/L KCl、15 mmol/LMgCl2、50 mmol/LDTT) 、dNTP混合液(各 10 mmol/L) 、RNaseInhibitor(40U/μL) 。

　　D. 1. 3 PCR试剂

　　10×PCR缓冲液(含 15 mmol/L的 Mg2+ ) 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP混合液(各 10 mmol/L) 。

　　D. 2 引物序列

　　本方法的特异性引物序列见表 D. 1。其中 BPM3为正向引物 ,BPM4为反向引物 ,扩增区域在大外壳蛋白基因上 ,扩增大小为 228bp。 引物由生物公司合成与纯化 。

　　表 D. 1 所使用的引物序列

　　引物名称

　　引物序列

　　在 NC_003495a 上的位置

　　BPM3

　　5’-CATAGCATTTGGAAATTTGGCTG-3’

　　2 587~ 2 609

　　BPM4

　　5’-TCACCTGGTATTGTRGACAC-3’b

　　2 795~ 2 814

　　注 : 也可以采用根据 BPMV基因组序列合成的其他特异性引物 。

　　a 在 GenBank上的基因序列登录号 。

　　b 序列中的 R= G或 A。

　　D. 3 总 RNA 的提取

　　取 0. 05g~0. 1 g样品,加入 1 mL TRIzolreagent充分研磨 ,室温放置 5 min;12000g离心5 min,取上清液到另一离心管中 ;加入三氯甲烷 200 μL,充分振荡 15 s,室温放置 3 min; 12 000 g,4 ℃离心15 min;取上层水相加入另一离心管中 ,加入 0. 5 mL异丙醇;12000g,4 ℃ ,离心 10min,弃去上清液 ;加入 1 mL 70%乙醇洗涤 ; RNA沉淀干燥后 ,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的 ddH2 O 40 μL溶解即可 。

　　注 : 本方法是根据 TRIzolreagent方 法 提 取 总 RNA, 在 保 证 总 RNA 质 量 的 情 况 下 , 也 可 以 采 用 其 他 总 RNA 提取方法 。

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　　D. 4 cDNA合成

　　在 3 μL的总 RNA 中加入 1 μL的 BPM4引物(10μmol/L) ,于 95 ℃的水浴中 7 min,然后迅速冰浴 5 min。继续加入 5×反应 缓 冲 液 2. 5 μL、dNTP 混 合 物(10 mmol/L) 0. 5 μL、M-MLV 反 转 录 酶(200U/μL) 0. 5 μL、RNase Inhibitor0. 5 μL、经 DEPC处理的 ddH2 O 4. 5 μL。然后 37℃水浴 1 h, 95 ℃水浴 10 min, 自然冷却至室温 , -20 ℃冰箱中保存 。

　　D. 5 PCR 扩增

　　以上述合成的 cDNA 为模板 ,进行 PCR 扩 增 。 在 PCR 的 薄 壁 管 中 分 别 加 入 以 下 试 剂 (25 μL体系) :10 ×PCR缓冲液(含 20 mmol/L的 Mg2+ ) 2. 5 μL、TaqDNA 聚合酶(2. 5 U/μL) 0. 5 μL、dNTP混合物(每种各含 10 mmol/L) 0. 5 μL、BPM3 引 物 (10 μmol/L) 1. 0 μL、BPM4 引 物 (10 μmol/L)

　　1. 0 μL、cDNA 3. 0 μL、ddH2 O 16. 5 μL。

　　反应条件 :94 ℃预变性 3 min, 然后 94 ℃变性 50 s、60 ℃ 退火 50 s、72 ℃延伸 30 s,进行 35个循环 ,最后一个循环结束后 72 ℃继续延伸 7 min。

　　D. 6 琼脂糖凝胶电泳

　　RT-PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析 。每个样品取 5 μL的 RT-PCR产物与 1 μL的 6×上样缓冲液混合均匀 ,并加到置于 0. 5×TBE缓冲液的 1. 5%琼脂糖凝胶孔中 ,然后在 120 V 下电泳 。 电泳结束后 ,放入装有 0. 5 μg/μL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色 ,然后在清水中清洗后 ,在凝胶成像系统中观察 ,拍照 ,并保存照片 。

　　D. 7 结果判定

　　在阴性对照和空白对照没有产生条带 、阳性对照产生预期大小(约 228bp)的条带情况下 :

　　— 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阳性 ;

　　— 如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阴性 。

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