GB/T 27982-2011 小反刍兽疫诊断技术

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27982—2011

　　小反刍兽疫诊断技术

　　Diagnostictechniquesforpestedespetitsruminants

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27982—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 :农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室 、中国动物卫生与流行病学中心 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、王清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、李金明 、姚李四 、张乐 、林祥梅 、吴绍强 、韩雪清 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27982—2011

　　小反刍兽疫诊断技术

　　1 范围

　　本标准规定了小反刍兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求 。

　　本标准适用于小反刍兽疫的诊断 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489—2008 实验室 生物安全通用要求

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　荧光定量反转录-聚合酶链式反应 realtimequantitativereversetranscription polimerasechain re- action

　　荧光定量 RT-PCR反应

　　在 RT-PCR反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号积累实时监测整个 RT-PCR 进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。

　　3. 2

　　荧光域值 threshold

　　荧光定量 RT-PCR反应的 前 15个 循 环 的 荧 光 信 号 作 为 荧 光 本 底 信 号 , 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是3个 ~ 15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍 。

　　3. 3

　　Ct值 Ctvalue

　　每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数 。

　　4 生物安全措施

　　进行小反刍兽疫实验室检测时 ,如病毒分离 、血清处理等 ,按照 GB 19489—2008。

　　5 临床诊断

　　5. 1 临床症状

　　5. 1. 1 突然发热,第 2 天 ~第 3 天体温达 40℃ ~42℃高峰 。发热持续 3 d左右 ,病羊死亡多集中在发热后期 。

　　1

　　GB/T 27982—2011

　　5. 1. 2 眼 、鼻大量排出分泌物 ,最初水样的眼 、鼻分泌物 日益增多 ,变成脓性然后结干 ,动物发出恶臭 。由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖 ,动物打喷嚏和咳嗽 。 呼吸急促 , 呼吸困难 ,排痰性咳嗽和眼睛的卡他性分泌物 。

　　5. 1. 3 口腔粘膜充血 , 口腔上皮和鼻腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点 ,坏死组织脱落后形成界线分明的浅糜烂斑 。上皮破损偏好部位为嘴唇 、齿龈 、牙板 、舌头以及母羊阴户的阴唇表面 。口腔破损可能伴有大量流涎 。

　　5. 1. 4 发热 2 d~ 3 d后病畜开始腹泻 ,伴随严重脱水 、消瘦 、虚脱 。怀孕母羊可发生流产 。

　　5. 1. 5 特急性病例在发热开始的 4 d~ 6 d 内死亡 。亚临床型病例症状较轻 ,病畜在生病 10 d~ 14 d以后康复 。

　　5. 2 病理变化

　　5. 2. 1 嘴唇充血 , 口腔破损程度不等 , 较轻的只有一处溃疡 ,严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔炎 ,涉及牙板 、硬腭 、颊 粘 膜 和 乳 突 和 舌 头 喙 部 背 面 。 粘 膜 病 变 可 延 伸 至 咽 部 , 偶 尔 在 网 胃 和 瘤 胃 交界处 。

　　5. 2. 2 上呼吸道粘膜可能严重充血 ,伴有鼻孔和气管的溃疡 。支气管肺炎 ,肺尖肺炎 。

　　5. 2. 3 皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂 。偶尔 ,整个肠道出现弥散性的充血 ,但是 ,多数情况仅局限于十二指肠 、回肠 、盲肠和结肠上部分 。 常见回盲肠瓣膜出血 。大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形成斑马样条纹 。

　　5. 2. 4 肠淋巴组织坏死 、萎陷 。肠系膜淋巴组织轻微肿大 、水肿 ,脾可能肿胀 。上呼吸道粘膜可能严重充血 ,伴有鼻孔和气管的溃疡 。支气管肺炎 ,肺尖肺炎 。肺部淋巴结肿胀并水肿 。

　　5. 2. 5 结膜出现脓性结膜炎 。 肾和膀胱可见充血 。母羊可见阴户和阴道糜烂 。

　　5. 2. 6 组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体 。

　　5. 3 结果判定

　　山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化 ,羊群发病率 、病死率较高 ,传播迅速 ,可判定为疑似小反刍兽疫 。

　　6 实验室诊断

　　6. 1 样品采集与运输

　　6. 1. 1 样品的采集

　　6. 1. 1. 1 每个发病羊群最少选择 5 只病畜采集样品 。

　　6. 1. 1. 2 选择处于发热期(体温 40 ℃ ~41 ℃) 、排出水样眼分泌物 、出现口腔溃疡 、无腹泻症状的活畜采集样品 。采集结膜棉拭子 2个 、鼻粘膜棉拭子 2 个 、颊部粘膜棉拭子 1 个 , 分别放在 300 μL灭菌的0. 01 mol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液(PBS)中 。无菌采集血液 10 mL,用常规方法分离血清 。

　　6. 1. 1. 3 选择刚被扑杀或者死亡时间不超过 24h 的病畜采集组织样品 。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各 3个 ~4个 ,脾 、胸腺 、肠粘膜和肺等组织各约 25 g~ 50 g,分别置于 50 mL离心管中 。

　　6. 1. 1. 4 肉制品取 25 g~ 50 g,置于 50 mL离心管中 。

　　6. 1. 2 样品的运输与储存

　　6. 1. 2. 1 样品采集后 ,置冰上冷藏送至实验室检测 。

　　6. 1. 2. 2 血清储存应置于 -20℃冰箱 。

　　2

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　　6. 1. 2. 3 棉拭子 、病料组织和肉制品储存应置于 -70℃冰箱 。

　　6. 2 器械与设备

　　5%二氧化碳培养箱 ,DNA热循环仪 ,低温高速离心机 , 电泳仪和电泳槽 ,凝胶成像系统或者紫外检测仪 ,实时荧光定量 PCR仪 ,96孔高吸附性酶标板 ,洗瓶或者洗板机 ,恒温箱 ,酶标仪 。

　　6. 3 病毒分离与鉴定

　　6. 3. 1 试验材料

　　非洲绿猴肾(Vero)细胞, pH 7. 4 磷 酸 盐 缓 冲 液(PBS) (见 A. 1) , 细 胞 培 养 液(见 A. 3) , 细 胞 培养瓶 。

　　6. 3. 2 样品处理

　　棉拭子 充 分 捻 动 、挤 干 后 弃 去 拭 子 , 加 入 青 霉 素 至 终 浓 度 200 IU/mL, 加 入 链 霉 素 至 终 浓 度200 μg/mL。37 ℃作用 1 h。3 000g离心 10 min,取上清液 300 μL作为接种材料 。

　　用灭菌的剪刀 、镊子取大约 0. 5 g组织样品或肉制品,置于研钵中 ,剪碎 ,充分研磨 ,加入 5 mL灭菌的 0. 01 mol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液(含青霉素 200 IU/mL,链霉素 200 μg/mL) , 制成 1 ∶ 10悬液 。 37 ℃ 作用 1 h。3 000g离心 10 min,取上清液 5 mL作为接种材料 。

　　不能立即接种者 ,应将上清放 -70℃保存 。

　　6. 3. 3 样品接种

　　取样品上清液接种已长成单层的 Vero细胞 ,37 ℃恒温箱中吸附 2 h,加入细胞培养液 ,置 5%二氧化碳培养箱 37 ℃培养 。

　　6. 3. 4 观察结果

　　接种后 5 d 内 ,细胞应出现细胞病变效应 ,表现为细胞融合 ,形成多核体 。如接种 5 d~ 6 d后不出现细胞病变 ,应将细胞培养物盲传三代 。

　　6. 3. 5 病毒的鉴定

　　将出现细胞病变的细胞培养物 ,按“6. 4 RT-PCR方法 ”和“6. 5 荧光定量 RT-PCR 反应 ”做进 一步鉴定 。

　　6. 3. 6 结果判定

　　样品出现细胞病变 ,而且 RT-PCR方法或实时荧光 RT-PCR 方法鉴定结果阳性 ,则判为小反刍兽疫病毒分离阳性 ,表述为检出小反刍兽疫病毒 。

　　否则 ,表述为未检出小反刍兽疫病毒 。

　　6. 4 RT-PCR方法

　　6. 4. 1 试剂与材料

　　除另有规定外 ,试剂为分析纯或生化试剂 。实验用水符合 GB/T 6682的要求 。

　　TRIzol试剂 ,三氯甲烷 ,异丙醇 ,无水乙醇 ,DEPC处理过的水(见附录 B) ,反转录酶/Taq DNA 聚合酶混合液 ,2×一步法 RT-PCR反应缓冲液 ,1. 5%的琼脂糖凝胶(见附录 B) ,0. 5×TBE缓冲液(见附录 B) ,溴化乙锭 。

　　3

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　　可以采用引物 NP3/NP4用于小反刍兽疫病毒核酸的检测 , 引物的靶基因 、位置 、序列和扩增产物的大小见表 1。

　　表 1 用于小反刍兽疫病毒 RT-PCR检测的引物

　　引物

　　目的

　　靶基因

　　序列(5′– 3′)

　　产物

　　NP3

　　正向引物

　　N 基因

　　TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG

　　351 bp

　　NP4

　　反向引物

　　N 基因

　　CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT

　　6. 4. 2 样品处理

　　将棉拭子充分捻动 、挤干后弃去拭子 , 取 100 μL样品液至一新的离心管中 , 加入 1 mL TRIzol试剂 ,振荡混匀 ,进行 RNA提取 。

　　取大约 100 mg组织样品,剪碎后 ,加入 1 mL TRIzol试剂充分匀浆后转移至 1. 5 mL离心管中 ,进行 RNA提取 。

　　6. 4. 3 RNA提取

　　经 TRIzol处理的样品液 12 000 r/min,4 ℃离心 10 min, 取上清 ,静置 5 min。 加 200 μL三氯甲烷 ,振荡混匀 ,15 s,静置 2 min~ 3 min。 12 000 r/min,4 ℃离心 15 min,取 400 μL上层水相到新的离心管中 ,加 400μL的异丙醇 ,混匀 ,静置 10min。 12000 r/min,4 ℃离心 10min,去上清 。加入 75%乙醇 1 mL,混匀 ,12000 r/min,4 ℃离心 5 min,去上清 。再加入 75%乙醇 1 mL,混匀 ,12000 r/min,4 ℃离心 5 min,去上清 。干燥 RNA沉淀后加入 100 μLDEPC处理过的水溶解 。立即进行 RT-PCR 反应或 -70℃保存 。

　　6. 4. 4 RT-PCR反应

　　反应体系为 25μL,依次加入以下成分 : 12. 5 μL 2×一步法 RT-PCR 反应缓冲液 , 1 μL正向引物NP3 (10μmol/L) ,1 μL反向引物 NP4 (10μmol/L) ,1 μL反转录酶/TaqDNA 聚合酶混合液 ,4. 5 μL DEPC处理过的水 ,5 μL RNA模板 。

　　每次进行 RT-PCR反应时均设标准阳性 、阴性及空白对照 。标准阳性用阳性对照 RNA作为模板 ,标准阴性用 Vero细胞 RNA作为模板 ,空白对照用 DEPC处理过的水作为模板 。

　　RT-PCR反应条件为 :50 ℃反转录 30 min; 94 ℃ , 2 min进行 Taq酶的激活 ; 94 ℃ , 30 s, 55 ℃ , 30 s,72 ℃ , 30 s,共 35次循环;72 ℃延伸 7 min。

　　6. 4. 5 PCR产物的电泳

　　取 PCR产物 5 μL在 1. 5%琼脂糖凝胶中进行电泳 ,凝胶成像系统中观察结果 。

　　6. 4. 6 质控标准

　　小反刍兽疫病毒 RT-PCR标准阳性对照有大小为 351bp的特异性阳性扩增条带 ,标准阴性对照和空白对照无任何扩增条带 ,说明质控合格 。

　　6. 4. 7 结果判定

　　样品有大小为 351bp的特异性阳性扩增条带判为 RT-PCR结果阳性 ,表述为检出小反刍兽疫病毒核酸 。

　　4

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　　样品无特异性的阳性扩增条带判为 RT-PCR结果阴性 ,表述为未检出小反刍兽疫病毒 。

　　6. 5 荧光定量 RT-PCR反应

　　6. 5. 1 试验材料

　　TRIzol试剂 ,三氯甲烷 ,异丙醇 ,无水乙醇 ,DEPC处理过的水(见附录 B) 、2×一步法荧光 RT-PCR反应缓冲液 ,TaqDNA 聚合酶 ,反转录酶 ,参比荧光 ROX Ⅱ 。

　　引物和探针 : 引物和探针针对小反刍兽疫病毒 N 基因保守序列区段设计 , 引物和探针的位置和序列见表 2。

　　表 2 用于小反刍兽疫病毒实时荧光定量 RT-PCR检测的引物和探针

　　引物

　　目的

　　位置

　　序列(5′– 3′)

　　PPRN8a

　　正向引物

　　1213-1233

　　CACAGCAGAGGAAGCCAAACT

　　PPRN9b

　　反向引物

　　1327-1307

　　TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGA

　　PPRN10P

　　探针

　　1237-1258

　　FAM-5′-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGCT-3′-TAMRA

　　6. 5. 2 RNA提取

　　同 6. 4. 3。

　　6. 5. 3 荧光定量 RT-PCR反应

　　反应体系为 25 μL, 依 次 加 入 以 下 成 分 : 12. 5 μL 2 × 1 step buffer, 1 μL 正 向 引 物 PPRN8a (10 μmol/L) ,1 μL反向引物 PPRN9b (10μmol/L) ,0. 5 μL探针 PPRN10p (10μmol/L) ,0. 5 μLTaq DNA 聚合酶 ,0. 5 μL反转录酶 ,0. 5 μL参比荧光 ROX II, 3. 5 μL DEPC处理过的水 , 5 μL RNA 模板 。每次进行荧光定量 RT-PCR 时均设标准阳性 、阴性及空白对照 。标准阳性用阳性对照 RNA 作为模板 ,标准阴性用 Vero细胞 RNA作为模板 ,空白对照用 DEPC处理过的水作为模板 。

　　荧光定量 RT-PCR反应条件为 :42 ℃反转 录 30 min; 95 ℃ , 10 min进 行 Taq酶 的 激 活 ; 95 ℃ , 15 s,60 ℃ , 1 min,共 50次循环 ;每个循环在 60 ℃ , 1 min时收集荧光信号 。

　　6. 5. 4 质控标准

　　读取每个样品的 Ct值 。

　　标准阳性对照样品有特异性扩增曲线而且 Ct值 ≤30,标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线 ,说明质控合格 。

　　6. 5. 5 结果判定

　　样品有特异性扩增曲线而且 Ct值 ≤40判为实时荧光 RT-PCR 扩增阳性 ,表述为检出小反刍兽疫病毒核酸 。

　　样品 Ct值 >40或者无特异性扩增曲线判为实时荧光 RT-PCR 扩增阴性 ,表述为未检出小反刍兽疫病毒核酸 。

　　6. 6 竞争 ELISA 方法

　　6. 6. 1 试验材料

　　包被用抗原 :PPRV疫苗株重组 N 蛋白 。对照血清 : 强阳性血清 、弱阳性血清 、阴性血清 。单克隆

　　5

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　　抗体 :小反刍兽疫病毒 N蛋白的单克隆抗体 。酶结合物 :辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠血清 。 封闭缓冲液 、洗涤缓冲液 、底物溶液及终止液 ,配制方法见附录 C。

　　6. 6. 2 抗原包被

　　PPRV重组 N蛋白用包被缓冲液 1 ∶ 3 500倍稀释后 , 每孔 50 μL包被 96孔酶标板 , 37 ℃置湿盒吸附 1 h,用洗涤缓冲液洗板 4次 。

　　6. 6. 3 血清加样步骤

　　每孔加入 45μL封闭缓冲液 。每份待检血清做 2孔 ,每孔加入 5 μL待检血清 。设强阳性血清对照孔(C++)4个 ,每孔加入 5 μL强阳性血清 ,设弱阳性血清对照孔(C+)4个 ,每孔加入 5 μL弱阳性血清 ,设阴性血清对照孔(C-)2个 ,每孔加入 5 μL阴性血清 ,设单抗对照孔(Cm)4个 ,每孔加入 5 μL封闭缓冲液 ,设酶结合物对照孔(Cc)2个 ,每孔加入 55 μL封闭缓冲液 。

　　6. 6. 4 单克隆抗体的加入

　　除酶结合物对照孔外 ,每孔加入 50 μL工作浓度的单抗 ,37 ℃置湿盒作用 1 h,用洗涤缓冲液洗板4次 。

　　6. 6. 5 酶结合物的加入

　　每孔加入 50 μL工作浓度的酶结合物 ,37 ℃置湿盒作用 1 h,洗涤缓冲液洗板 4次 。

　　6. 6. 6 显色与终止

　　每孔加入 50 μL底物溶液 ,37 ℃避光反应 10 min,每孔加入 50 μL终止液 。

　　6. 6. 7 读值

　　酶标仪预热 15 min,读取每孔 492 nm 波长的吸光度值(OD值) 。

　　6. 6. 8 计算抑制率

　　按照式(1)计算每孔(包括对照孔)的抑制率 ,并计算每份样品的平均抑制率 。

　　式中 :

　　PI — 抑制率 ;

　　ODT — 试验孔或对照孔 OD值 ;

　　ODC — 单抗对照孔 OD平均值 。

　　PI= 100- (ODT ÷ ODC ) × 100 …………………………( 1 )

　　6. 6. 9 质控标准

　　结果在质控标准(见表 3)范围内 ,则试验成立 。

　　表 3 小反刍兽疫竞争 ELISA检测方法质控标准

　　项 目

　　最大值

　　最小值

　　Cm 孔的 OD值

　　1. 500

　　0. 500

　　Cc 孔抑制率

　　+105

　　+95

　　Cm 孔抑制率

　　+20

　　-19

　　6

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　　表 3 (续)

　　项 目

　　最大值

　　最小值

　　C++ 孔抑制率

　　90

　　81

　　C+ 孔抑制率

　　80

　　51

　　C- 孔抑制率

　　30

　　5

　　6. 6. 10 结果判定

　　平均抑制率(PI) >80,判为强阳性 ,50<平均抑制率(PI) ≤80,判为弱阳性 ,表述为小反刍兽疫血清学阳性 。平均抑制率(PI) ≤50,判为阴性 ,表述为小反刍兽疫抗体血清学阴性 。

　　7 综合判定

　　凡具有 6. 3. 6、6. 4. 7、6. 5. 5、6. 6. 10 中任何一项阳性者 ,均判为小反刍兽疫阳性 。

　　7

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　病毒分离鉴定溶液的配制

　　A. 1 pH7. 4 磷酸盐缓冲液(PBS)

　　NaCl

　　8. 00

　　g

　　KCl

　　0. 20

　　g

　　Na2 HPO4 · 2H2 O

　　1. 44

　　g

　　KH2PO4

　　0. 24

　　g

　　用 HCl调节 溶 液 的 pH 值 至 7. 4, 加 去 离 子 水 至 1 000 mL, 在 1. 034× 105 Pa高 压 下 蒸 汽 灭 菌20 min。保存于室温 。PBS一经使用 ,于 4 ℃保存不超过 3周 。

　　A. 2 高糖型 DMEM 培养液

　　高糖型 DMEM

　　13. 37 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 )

　　3. 7 g

　　超纯水

　　1 000 mL

　　充分溶解后 ,0. 22 μm 微孔滤膜过虑除菌 。4 ℃保存 。

　　A. 3 细胞培养液

　　高糖型 DMEM培养液 950 mL

　　胎牛血清 50 mL

　　加入青霉素至终浓度 200IU/mL,链霉素至终浓度 200 μg/mL,两性霉素 B 至终浓度 2. 5 μg/mL充分混匀 。4 ℃保存 。

　　8

　　GB/T 27982—2011

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　反转录-聚合酶链反应溶液的配制

　　B. 1 DEPC处理过的水

　　DEPC 1 mL

　　去离子水 1 000 mL

　　充分混匀 ,将瓶盖拧松后置于 37 ℃放置过夜 ,高压灭菌 。

　　B. 2 5× TBE 缓冲液

　　Tris碱

　　54 g

　　硼酸

　　27. 5 g

　　0. 5 mol/L EDTA

　　20 mL

　　加去离子水调整体积至 1 000 mL。

　　B. 3 0. 5× TBE 缓冲液

　　取 100 mL 5×TBE缓冲液 ,加去离子水调整体积至 1 000 mL。

　　B. 4 1. 5%的琼脂糖凝胶

　　琼脂糖

　　0. 75 g

　　0. 5×TBE缓冲液

　　50 mL

　　溴化乙锭溶液(10mg/mL)

　　2. 5 μL

　　称取 0. 75 g 琼脂糖 , 置于 200 mL锥形瓶中 , 加入 50 mL 0. 5× TBE缓 冲 液 , 加 热 溶 解 , 冷 却 至50 ℃ ~ 60 ℃时加入 2. 5 μL溴化乙锭溶液 ,倒入胶槽内 自然凝固 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　竞争酶联免疫吸附试验溶液的配制

　　C. 1 包被缓冲液—0. 05mol/L pH9. 6 碳酸盐/重碳酸盐缓冲液

　　Na2CO3 0. 318 g

　　NaHCO3 0. 588 g

　　去离子水 200 mL

　　用 0. 22 μm 膜过滤除菌 ,室温保存备用 。

　　C. 2 洗涤缓冲液—pH7. 4 PBST (0. 05%吐温-20)

　　吐温 20

　　0. 5 mL

　　pH7. 4 PBS

　　1 000 mL

　　C. 3 封闭缓冲液(含 3%BSA的 pH7. 4 PBS)

　　BSA 30 g

　　pH7. 4 PBS 1 000 mL

　　封闭液要临用前配制 。

　　C. 4 底物溶液

　　C. 4. 1 A 液

　　Na2 HPO4 3. 682 g

　　柠檬酸 1. 021 g

　　过氧化氢尿素 0. 06 g

　　去离子水 100 mL

　　临用前配制 ,避光 4 ℃ ~ 8 ℃保存 。

　　C. 4. 2 B 液

　　柠檬酸 1. 05 g

　　EDTA 14. 6 mg

　　TMB (3,3’-二氨基联苯胺) 25. 0 mg

　　去离子水 100 mL

　　用 0. 45 μm 滤膜过滤 , 临用前配制 ,避光 4 ℃保存 。

　　C. 4. 3 用法

　　使用时 ,将 A液 、B液按 1 ∶ 1 的比例混合 。

　　10

　　GB/T 27982—2011

　　C. 5 终止液—3 mol/L H2SO4

　　浓硫酸 16. 5 mL

　　去离子水 87. 5 mL

　　将浓硫酸缓缓加到蒸馏水中 ,混匀 。