GB/T 27635-2011 斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27635—2011

　　斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌

　　检测操作方法

　　Protocolofidentification ofStenotrophomonasmaltophilia from Ictalurus

　　punctatusRafinsque

　　2011-12-30发布 2012-04-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27635—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、中国动物卫生与流行病学中心 。

　　本标准主要起草人 : 薛峰 、蒋原 、袁芳 、王云飞 、张睿 、易海华 、徐帮兴 、邵卫星 、马卉 、栾军 、陈国强 、乔华林 、谢怀根 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27635—2011

　　斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌

　　检测操作方法

　　1 范围

　　本标准规定了斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法 。

　　本标准适用于对斑点叉尾鮰的嗜麦芽寡养单胞菌的分离 、鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 4789. 28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法 、培养基和试剂

　　GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　NA: nutrientagar,普通营养琼脂 。

　　TSA:tryptose soya agar,大豆胰蛋白胨琼脂 。

　　VIA:amphotericin B;imipenem;vancomycin hydrochloride,含有万古霉素 、亚胺培南 、两性霉素 B的选择性平板 。

　　4 设备和材料

　　4. 1 冰箱 :0 ℃ ~4 ℃ 。

　　4. 2 恒温培养箱 :28 ℃ ±1 ℃ 。

　　4. 3 铂/铱接种环或玻璃棒 。

　　4. 4 滤纸 。

　　4. 5 发酵管 。

　　4. 6 天平 :0 g~ 100 g,精确至 0. 5 g。

　　4. 7 均质器或灭菌乳钵 。

　　4. 8 灭菌广口瓶 :500 mL。

　　4. 9 灭菌三角烧瓶 :500 mL,250 mL。

　　4. 10 灭菌培养皿 :直径 90 cm。

　　4. 11 显微镜 :10× ~ 100× 。

　　5 试剂和培养基

　　5. 1 试剂级别 : 除另有规定 ,本方法试验用水应符合 GB/T 6682—2008规定的二级水 ,所用化学试剂

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　　GB/T 27635—2011

　　均为分析纯 。

　　5. 2 普通营养肉汤 、大豆胰蛋白胨琼脂(TSA) 、普通营养琼脂(NA) 、普通羊血营养琼脂和 VIA 的配制见附录 A(也可按 GB/T 4789. 28—2003中 4. 7规定) 。

　　5. 3 革兰氏染色液 :按 GB/T 4789. 28—2003中 2. 2规定 。

　　5. 4 氧化酶试剂 :按 GB/T 4789. 28—2003中 3. 18规定 。

　　5. 5 糖发酵管 :麦芽糖按 GB/T 4789. 28—2003中 3. 2规定 。

　　5. 6 DNA酶甲基绿琼脂 :按 GB/T 4789. 28—2003中 4. 51规定 。

　　5. 7 微量生化反应管 :乳糖 、水杨苷 、乙酸盐 、丙酸盐 、戊酸盐 、丙二酸盐 、琥珀酸盐 、延胡索酸盐 、L-苹果酸盐 、乳酸盐 、柠檬酸盐 、2-酮戊二酸盐 、丙酮酸盐生化反应 ,L-丙氨酸 、D-丙氨酸 、L-谷氨酸盐 、L-组氨酸和 L-脯氨酸 ,按照 GB/T 4789. 28—2003中规定 。

　　5. 8 API20E生化鉴定试剂盒 。

　　6 检验程序

　　斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图 1。

　　图 1 斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检验程序

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　　GB/T 27635—2011

　　7 操作步骤

　　7. 1 样品处理液的制备

　　以无菌操作取出有病症鱼体 ,直接从鱼体肝 、肾等组织中采样 。如果是体长小于 4 cm 的幼鱼取整条鱼 ,如果是体长 4 cm~6 cm 的鱼取内脏 。将鱼体或内脏 25g均质于 225mL营养肉汤中 ,28℃±1℃ ,需氧培养 24h,无菌取培养液作为样品处理液 。

　　7. 2 细菌的分离

　　将 24h普通营养肉汤增菌液划线接种于 VIA,置于 28 ℃需氧培养 24 h,显微镜观察 ,背景未变化的单个优势菌落为可疑菌落 。

　　7. 3 可疑菌落筛选

　　挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆胰蛋白胨琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板 ,置于 28 ℃需氧培养 24h。观察菌落的大小 、形态 。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色 , 圆形 ,表面光滑 ,边沿整齐的半 透 明 菌 落 ; 在 大 豆 胰 蛋 白 胨 琼 脂 (TSA) 平 板 上 形 成 圆 形 , 表 面 光 滑 , 边 缘 整 齐 , 直 径0. 18 mm~ 1. 12 mm 的透明的无色菌落 ;在普通羊血琼脂平板上出现明显的 β 溶血环 ,且溶血环呈草绿色 ,有强烈的氨味 。符合以上菌落特征的为可疑菌株 。

　　7. 4 嗜麦芽寡养单胞菌的鉴定

　　7. 4. 1 革兰氏染色

　　对可疑菌落进行革兰氏染色 , 嗜麦芽寡养单胞菌为 G- 杆菌 ,无荚膜 ,无芽孢 ,极生端鞭毛 ,鞭毛数不小于 2。

　　7. 4. 2 氧化酶实验

　　使用铂/铱接种环或玻璃棒 ,挑取单个可疑菌落 , 然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上 , 如果在10 s 内出现紫红色 、紫罗兰或深蓝色为阳性 ,不变色为阴性 , 嗜麦芽寡养单胞菌为阴性 。

　　7. 4. 3 麦芽糖氧化实验

　　将可疑菌落无菌挑取到麦芽糖发酵管 ,28℃ ±1℃培养 2 h~ 3 h,观察结果 。 嗜麦芽寡养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性 。

　　7. 4. 4 DNA 酶反应实验

　　在以甲基绿为指示剂的 DNA 酶 培 养 基 的 试 管 或 平 皿 上 检 测 DNA 酶 活 性 , 在 该 培 养 基 上 , 围 绕DNA酶阳性的细菌菌落的周围有一个清亮的环 。将可疑菌落接种到上述 DNA酶反应培养基中 ,28℃需氧条件下培养 72 h,观察结果 。 嗜麦芽寡养单胞菌为 DNA酶反应阳性 。

　　7. 4. 5 其他生化反应

　　7. 4. 5. 1 API20E鉴定

　　对上述均符合的可疑菌株用 API20E生化鉴定试剂条鉴定 ,具体操作按照产品说明书进行 。

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　　GB/T 27635—2011

　　7. 4. 5. 2 微量反应生化管实验

　　除 API20E鉴定方法外 ,也可以利用微量反应生化管 ,做乳糖 、水杨苷 、乙酸盐 、丙酸盐 、戊酸盐 、丙二酸盐 、琥珀酸盐 、延 胡 索 酸 盐 、L-苹 果 酸 盐 、乳 酸 盐 、柠 檬 酸 盐 、2-酮 戊 二 酸 盐 、丙 酮 酸 盐 、L-丙 氨 酸 、 D-丙氨酸 、L-谷氨酸盐 、L-组氨酸和 L-脯氨酸生化实验 。 嗜麦芽寡养单胞菌均可以利用上述有机物 ,反应均为阳性 。

　　8 结果报告

　　可疑菌落全部符合 7. 4 中的报告阳性结果 :“检出嗜麦芽寡养单胞菌 ” ,否则报告阴性结果 : “未检出嗜麦芽寡养单胞菌 ”。

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　　GB/T 27635—2011

　　附 录 A (规范性附录)培养基与试剂

　　A. 1 普通营养肉汤

　　A. 1. 1 基础培养基成分

　　蛋白胨 10 g

　　牛肉膏 3 g

　　氯化钠 5 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　A. 1. 2 制备

　　用蒸馏水溶解培养基基 础 成 分 , 调 节 pH7. 4, 选 取 合 适 大 小 的 三 角 瓶 分 装 此 基 础 培 养 基 , 121 ℃ 15 min高压灭菌 。

　　A. 2 大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)

　　A. 2. 1 基础培养基成分

　　胰胨 15. 0 g

　　植物蛋白胨 5. 0 g

　　氯化钠 30. 0 g

　　琼脂 15. 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　A. 2. 2 配制

　　用蒸馏水溶解培养基基础成分 ,调节 pH , 以确保灭菌后 pH 为 7. 2±0. 2(25 ℃) ,选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基 ,121 ℃ 15 min高压灭菌 。

　　A. 2. 3 制备

　　当基础培养基的温度 降 至 47 ℃ ~ 50 ℃时 , 混 匀 。倾 注 15 mL 基 础 培 养 基 于 灭 菌 平 皿 中 , 静 置使凝固 。

　　A. 3 普通营养琼脂培养基(NA)

　　A. 3. 1 基础培养基成分

　　蛋白胨 12 g

　　氯化钠 5 g

　　牛肉膏粉 3 g

　　酵母膏粉 3 g

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　　GB/T 27635—2011

　　琼脂 3 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　A. 3. 2 配制

　　用蒸馏水溶解培养基基础成分 ,调节 pH , 以确保灭菌后 pH 为 7. 2±0. 2(25 ℃) ,选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基 ,121 ℃ 15 min高压灭菌 。

　　A. 3. 3 制备

　　当基础培养基的温度 降 至 47 ℃ ~ 50 ℃时 , 混 匀 。倾 注 15 mL 基 础 培 养 基 于 灭 菌 平 皿 中 , 静 置使凝固 。

　　A. 4 普通羊血琼脂

　　A. 4. 1 基础培养基

　　A. 4. 1. 1 成分

　　动物组织酶解物 23. 0 g

　　淀粉 1. 0 g

　　氯化钠 4. 0 g

　　琼脂 8. 0 g~ 18. 0 g

　　水 1 000 mL

　　A. 4. 1. 2 配制

　　将基础组分溶于水 ,加热以促进溶解 。调节 pH ,使培养基在高压灭菌后 ,在 24 ℃时的 pH 为 7. 3 ±0. 2,选取适当三角瓶进行分装 。 121 ℃ 15 min高压灭菌 。

　　A. 4. 2 合成培养基

　　A. 4. 2. 1 组分

　　basic medium(基础培养基 ,见 A. 4. 1) 1 000 mL

　　sterile defibrinated horse/sheep blood(无菌脱纤维马/羊血) 50 mL

　　A. 4. 2. 2 制备

　　当基础培养基的温度降至 47 ℃ ~ 50 ℃时 , 加入无菌脱纤维马/羊血 5 mL/100 mL, 混匀 。倾注15 mL合成培养基于灭菌平皿中 ,静置使凝固 。

　　A. 5 VIA

　　A. 5. 1 基础培养基

　　A. 5. 1. 1 成分

　　蛋白胨 10. 0 g

　　牛肉浸膏 1. 0 g

　　D-甘露醇 10. 0 g

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　　GB/T 27635—2011

　　氯化钠 5. 0 g

　　琼脂 15. 0 g

　　溴百里酚蓝 0. 06 g

　　A. 5. 1. 2 配制

　　将基础培养基组分溶于水 ,加热以促进溶解 。 调节 pH ,使培养基在高压灭菌后 ,在 25 ℃时的 pH为 7. 3±0. 2,选取适当三角瓶进行分装 。 121 ℃ 15 min高压灭菌 。

　　A. 5. 2 抗生素溶液

　　A. 5. 2. 1 成分

　　vancomycin hydrochloride(万古霉素) 5 mg/L

　　imipenem(亚胺培南) 32 mg/L

　　amphotericin B(两性霉素 B) 2. 5 mg/L

　　A. 5. 2. 2 制备

　　用水溶解上述成分并且过滤除菌 。

　　A. 5. 3 合成培养基

　　A. 5. 3. 1 成分

　　基础培养基(见 A. 5. 1) ,抗生素溶液(见 A. 5. 2) 。

　　A. 5. 3. 2 制备

　　当基础培养基的温度降至 47 ℃ ~ 50 ℃时 ,加入抗生素溶液 ,混匀 ,形成合成培养基 。倾注 15 mL此合成培养基于灭菌平皿中 ,静置使凝固 。