GB/T 27538-2011 动物流感检测 A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27538—2011

　　动物流感检测 A 型 H1N1流感病毒中HA、NA 的焦磷酸测序检测方法

　　Animalinfluenza detection—Method ofpyrosequencingforHA andNA in

　　influenzavirusA (H1N1)

　　2011-11-21发布 2012-03-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27538—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :徐彪 、梁成珠 、凌宗帅 、张太翔 、岳志芹 、高宏伟 、孙涛 、方绍庆 、林祥梅 、韩雪清 、朱来华 、张鹤晓 、单虎 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27538—2011

　　动物流感检测 A 型 H1N1流感病毒中

　　HA、NA 的焦磷酸测序检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了焦磷酸测序技术用于 A 型 H1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的 HA 和 NA 核酸序列检测方法 。

　　本标准适用于 A 型 H1N1流感病毒通用及 A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法

　　SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　ATP:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)

　　PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate belanced solution)

　　Pyrosequencing:焦磷酸测序

　　RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction)

　　RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)

　　Taq酶 :TaqDNA 聚合酶

　　4 原理

　　焦磷酸测序是通过测序引物和 PCR扩增单链 DNA模板杂交 ,与 DNA 聚合酶 、ATP硫酸化酶 、荧光素酶 、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS) 、荧光素孵育 ,逐一加入四种 dNTPs(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) ,如与模板配对 ,此 dNTP与引物的末端形成共价键 , 释放焦磷酸基团(PPi) ;ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成 ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化 ,氧化荧光素发出与 ATP量成正比 的 可 见 光 信 号 ; 光 信 号 由电 荷 耦 合 检 测 器(CCD) 收 集 并 由 软 件 转 化 为 峰 。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比 。ATP 和未掺入的 dNTP 由三磷酸腺苷双磷酸酶降解 ,淬灭光信号 ,并再生反应体系 。

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　　GB/T 27538—2011

　　5 试剂和材料

　　5. 1 除特别说 明 外 , 本 标 准 所 用 试 剂 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂 , 所 有 试 剂 均 用 无 RNA 酶 污 染 的 器 具(用 DEPC水处理)分装 ,实验用水符合 GB/T 6682的规定 。

　　5. 2 焦磷酸测序用引物(对)序列见附录 A。

　　5. 3 AMV反转录酶 。

　　5. 4 TaqDNA 聚合酶 。

　　5. 5 Pyro GoldSQA Reagents DNA序列分析试剂盒或其他等效试剂 。

　　5. 6 DNTPs。

　　5. 7 琼脂糖(电泳纯) 。

　　5. 8 三氯甲烷 。

　　5. 9 异丙醇 。

　　5. 10 70%乙醇 :配制方法见附录 B。

　　5. 11 DNA分子量标准品(100bp ~ 2 000 bp) 。

　　5. 12 裂解液 :Trizol或其他等效总 RNA提取试剂 。

　　5. 13 PBS:配制方法见附录 B。

　　5. 14 10×PCR缓冲液 :建议使用厂家提供 ,如需配制见附录 B。

　　5. 15 电泳缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　5. 16 溴化乙锭贮存液 :用水配制成 10 mg/mL。

　　5. 17 电泳加样缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　5. 18 磁珠悬液 。

　　6 仪器设备

　　6. 1 焦磷酸测序仪 。

　　6. 2 焦磷酸测序仪 96孔板 。

　　6. 3 真空吸附器 。

　　6. 4 PCR仪 。

　　6. 5 冷冻离心机(最大离心力 12000g以上) 。

　　6. 6 微量移液器 。

　　6. 7 电泳仪 。

　　6. 8 紫外检测仪 。

　　6. 9 1. 5 mL Eppendorf管 。

　　7 采样和样品制备

　　7. 1 采样

　　按照 NY/T 541和 GB/T 18088选取样品 。样品处理和其他实验活动符合 GB 19489的有关规定 。

　　7. 2 样品处理

　　7. 2. 1 鼻腔拭子

　　样品在混合器上充分混合后 ,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出 , 3 000g离心 5 min,取上清液

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　　转入无菌的 1. 5 mL Eppendorf管中 ,编号备用 。

　　7. 2. 2 肌肉或组织脏器

　　取待检 样 品 2. 0 g 于 洁 净 、灭 菌 并 烘 干 的 研 钵 中 充 分 研 磨 , 加 10 mL PBS 混 匀 , 4 ℃ , 3000g离心 15 min,根据需要取上清液转入无菌的 1. 5 mL Eppendorf管中 ,编号备用 。

　　7. 3 样本存放

　　制备的样本在 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存应不超过 24 h,若需长期保存应置 - 70 ℃以下 ,但应避免反复冻融(冻融不超过 3 次) 。

　　8 操作方法

　　8. 1 病毒 RNA 的提取

　　8. 1. 1 取灭菌的 1. 5 mL Eppendorf管 ,编号 。

　　8. 1. 2 用微量移液 器 向 每 管 中 各 加 入 600 μL裂 解 液 , 分 别 加 入 被 检 样 本 、阴 性 对 照 、阳 性 对 照 各200 μL,混匀后再加入 200 μL三氯甲烷 ,混匀器上振荡混匀 30 s。 于 4 ℃ 12000g离心 15 min。

　　8. 1. 3 取与 8. 1. 1 相同数量灭菌的 1. 5 mL Eppendorf管 ,加入 -20 ℃预冷的 500 μL异丙醇 ,做标记 。 吸取本标准 8. 1. 2各管中的上清液转移至相应的管中 ,上清液应至少吸取 500 μL。

　　8. 1. 4 于 冷 冻 离 心 机 上 4 ℃ 12 000g离 心 15 min, 小 心 倒 去 上 清 , 倒 置 于 吸 水 纸 上 , 吸 干 液 体 ;加入 600 μL70%乙醇 ,颠倒洗涤 。

　　8. 1. 5 于 4 ℃ 12000g离心 10 min,小心倒去上清 ,倒置于吸水纸上 ,尽量沾干液体 ,室温干燥 。

　　8. 1. 6 加入 10 μLDEPC水 ,轻轻混匀 ,溶解管壁上的 RNA,2 000g离心 5 s,冰上保存备用 。提取的RNA应在 2 h 内进行 PCR扩增 ;若需长期保存须放置 -70℃冰箱 。

　　8. 2 RT-PCR 扩增

　　8. 2. 1 反转录

　　在 3 μL 模 板 中 分 别 加 入 2 μL 25 mmol/L MgCl2 , 1 μL 10 × PCR 缓 冲 液 , 1 μL 2. 5 mmol/L dNTP,0. 25 μL 40 U/μL RNA 酶 抑 制 剂 , 0. 5 μL 5 U/μL AMV 反 转 录 酶 , 0. 5 μL 20 pmol/μL焦磷酸测序引物对(见附录 A) 中的 RT-PCR 上下游引物 ,用 DEPC水补足体积至 10 μL,瞬时离心混合 。在 PCR仪上进行反转录 ,条件为 42 ℃ 30 min,98 ℃ 1 min,冷却到 4 ℃ 。

　　8. 2. 2 PCR反应

　　8. 2. 2. 1 PCR反应体系

　　在反转录后 的 10 μL cDNA 溶 液 中 加 入 10× PCR 缓 冲 液 5 μL, 5 U/μL Taq DNA 聚 合 酶0. 25μL,20 pmol/μL焦磷酸测序引物对(见附录 A) 中的 RT-PCR 上下游引物各 0. 5 μL,DEPC水补足体积至 50 μL,在 PCR仪上扩增 。

　　8. 2. 2. 2 PCR循环条件

　　8. 2. 2. 2. 1 A 型 H1N1 流 感 病 毒 HA 基 因 : 94 ℃预 变 性 5 min, 94 ℃变 性 30 s, 60 ℃退 火 30 s, 72 ℃延伸 30 s,共循环 45次 ;然后 72 ℃再延伸 10 min。

　　8. 2. 2. 2. 2 A 型 H1N1 流 感 病 毒 NA 基 因 : 94 ℃预 变 性 5 min, 94 ℃变 性 30 s, 56 ℃退 火 30 s,

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　　72 ℃延伸 30 s,共循环 45次 ;然后 72 ℃再延伸 10 min。

　　8. 2. 2. 2. 3 A 型 H1N1流感病毒墨西哥株 HA 基因 : 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 58 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸 30 s,共循环 45次 ;然后 72 ℃再延伸 10 min。

　　8. 2. 2. 2. 4 A 型 H1N1流感病毒墨西哥株 NA 基因 : 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s,共循环 45 次 ;然后 72 ℃ 再延伸 10 min。

　　8. 2. 3 对照系统

　　检测过程中分别设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。

　　8. 3 PCR扩增产物电泳检测

　　在电泳槽中加入电泳缓冲液 ,使液面刚刚没过含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶 ;将 3 μL~ 6 μL PCR 扩增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合 ,点样 ; 以 DNA 分子量标准品做对照 ; 9 V/cm 恒压电泳 ,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 ;紫外检测仪下观察电泳结果并记录 ;扩增到 目标片段的 PCR 产物用于测序 。

　　8. 4 焦磷酸测序

　　8. 4. 1 测序单链模板的制备

　　8. 4. 1. 1 测序使用焦磷酸测序专用试剂盒或其他等效试剂 。

　　8. 4. 1. 2 在焦磷酸测序仪 96孔板中每孔预先加入 44 μL退火缓冲液 , 1 μL 20 pmol/μL测序引物 ,混匀 。

　　8. 4. 1. 3 混匀磁珠悬液 ,将需要使用的磁珠总量(按每样 3 μL) 转移到一个 1. 5 mL Eppendorf管中 ,加入结合缓冲液 ,使得平均每样达 50 μL。

　　8. 4. 1. 4 将 50 μL标记有生物素的 PCR产物与 50μL链霉亲和素包被的磁珠混合 ,在室温 25 ℃下振荡孵育 20 min。

　　8. 4. 1. 5 用真空吸附器将与磁珠结合后的 PCR产物吸起 ,然后在纯水中清洗 30 s; 在 70%乙醇中清洗 5 s;变性缓冲液洗 5 s;最后移到洗涤缓冲液中清洗 10 s。

　　8. 4. 1. 6 真空吸附器放入含有焦磷酸测序引物的板中 ,摇动 ,释放磁珠 。将样品放入 80 ℃烘箱2 min,再冷却到室温 。

　　8. 4. 2 测序反应

　　测序反应在 28 ℃下于焦磷酸测序仪上进行 ,加样使用 600 mb/8 ms的加样压力和时间 ,每轮反应时间 65 s。 引物链随着不同 dNTP 的加入而延伸 。 随着核酸的 结 合 , CCD 摄 像 机 检 测 到 发 出 的 光 信号 ,读出 DNA序列 。

　　8. 5 结果判定

　　8. 5. 1 A 型 H1N1流感病毒的确定

　　8. 5. 1. 1 H1和 N1RT-PCR反应均为阳性的 ,进行焦磷酸测序分析 ,测序片段与 H1、N1 目标片段完全相同的 ,确定为 A 型 H1N1流感病毒亚型 。

　　8. 5. 1. 2 H1和 N1RT-PCR反应均为阳性的 , H1和 N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑 ,进行 HA 或 NA基因全序列测定 ,确定其亚型和毒株 ,如为 H1N1变异株 ,建议将其作为新序列公布 , 以供其他诊断参考 。

　　8. 5. 1. 3 H1、N1RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非 A 型 H1N1流感病毒 。

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　　GB/T 27538—2011

　　8. 5. 2 A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株的确定

　　8. 5. 2. 1 8. 5. 1 中确定为 A 型 H1N1流感病毒的样品,建议采用 A. 2 中的引物 ,按照 8. 1 到 8. 4 的程序进行测序 。

　　8. 5. 2. 2 所得序列参照 8. 5. 1 中的方法 ,对照附录 C 中的 A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株的 目标片段确定是否为 A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株 。

　　9 检测过程中防止交叉污染的措施

　　按照 SN/T 1193要求执行 。

　　10 废弃物处理

　　检测过程中的废弃物 ,收集后在焚烧炉中焚烧处理 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　RT-PCR及测序引物

　　A. 1 A 型 H1N1流感病毒 RT-PCR及测序引物

　　H1基因上游引物(88bp) 5′-TTTGGCGATCTACTCCACAGTC-3′

　　H1基因下游引物 5′-ACCCATTAGAACACATCCAGAAGC-3′ 5′生物素标记

　　H1基因测序引物 5′-AGAACACATCCAGAAGC-3′

　　N1基因上游引物(249bp) 5′-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3′

　　N1基因下游引物 5′-TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3′ 5′生物素标记

　　N1基因测序引物 5′-CGTTTAAATACGGCAAT-3′

　　A. 2 A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株 RT-PCR及测序引物

　　H1基因上游引物(86bp) 5′-GAAGACAAGCATAACGGGAAAC-3

　　H1基因下游引物 5′-AGGATCCAGCCAGCAATGTTAC-3 5′生物素标记

　　H1基因测序引物 5′-CAAGCATAACGGGAAA-3

　　N1基因上游引物(147bp) 5′-GGGAATCAAAATCAGATTGAAACA-3

　　N1基因下游引物 5′-GGAATTGCCCGCTAATTTCA-3 5′生物素标记

　　N1基因测序引物 5′-CAACTTTGCTGCTGG-3

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　试 剂 配 制

　　B. 1 70%乙醇

　　取 70 mL乙醇加蒸馏水稀释定容至 100 mL。

　　B. 2 磷酸盐缓冲生理盐水配方

　　B. 2. 1 A 液(0. 2 mol/L磷酸二氢钠水溶液)

　　一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4 · H2 O)27. 6 g ,溶于蒸馏水中 ,最后稀释至 1 000 mL。

　　B. 2. 2 B 液(0. 2 mol/L磷酸氢二钠水溶液)

　　七水合磷酸氢二 钠(Na2 HPO4 · 7H2 O) 53. 6 g, [或 十 二 水 合 磷 酸 氢 二 钠 (Na2 HPO4 · 12H2 O)

　　71. 6 g或二水合磷酸氢二钠(Na2 HPO4 · 2H2 O)35. 6 g]加蒸馏水溶解 ,最后稀释至 1 000 mL。 B. 2. 3 0. 01mol/L pH7. 2 磷酸盐缓冲生理盐水的配制

　　0. 2 mol/LA液 14 mL

　　0. 2 mol/LB液 36 mL

　　氯化钠 8. 5 g

　　用蒸馏水稀释至 1 000 mL。

　　B. 3 10× PCR缓冲液

　　500 mmol/LKCl

　　100 mmol/LTris-Cl(pH8. 3,室温下)

　　15 mmol/LMgCl2

　　在 1. 05 kg/cm2 高压下蒸汽灭菌 10 min。分装后贮存在 -20 ℃ 。

　　B. 4 电流缓冲液

　　B. 4. 1 贮存液(50× )

　　Tris 242 g

　　冰乙酸 57. 1 mL

　　0. 5 mol/LEDTA(pH8. 0) 100 mL

　　加蒸馏水至 1 000 mL。

　　B. 4. 2 使用液

　　将上述贮存液做 50倍稀释 。

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　　GB/T 27538—2011

　　B. 5 溴化乙锭贮存液

　　取 1 g溴化乙锭加蒸馏水稀释定容至 100 mL,磁力搅拌数小时 ,确保完全溶解 。然后用铝箔包裹容器或将溶液保存于棕色瓶中 ,于室温保存 。

　　B. 6 电泳加样缓冲液

　　溴酚蓝 0. 25 g

　　蔗糖 40. 0 g

　　加水稀释至 100 mL。

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　　GB/T 27538—2011

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　已知亚型目标片段

　　A 型 H1N1流感病毒 H1 目标片段 :GGGGGCAAT

　　A 型 H1N1流感病毒 N1 目标片段 :GGTGTTTGGATAGG

　　A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株 H1 目标片段 :TGCAAACTAAGAGGGGTA

　　A 型 H1N1流感病毒墨西哥变异株 N1 目标片段 :CAGTCAGTGGTT

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