GB/T 27537-2011 动物流感检测 A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27537—2011

　　动物流感检测 A型流感病毒分型基因

　　芯片检测操作规程

　　Animalinfluenza detection—ProtocolofDNA microarray examination

　　forinfluenzaA virussubtypes

　　2011-11-21发布 2012-03-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27537—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 、中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 、中 国 兽 医 药 品 监察所 。

　　本标准主要起草人 :韩雪 清 、刘 伯 华 、李 建 、林 祥 梅 、王 慧 煜 、刘 建 、陈 茹 、侯 义 宏 、刘 业 兵 、贾 广 乐 、吴绍强 、梁成珠 、秦智锋 、宁宜宝 、薄清如 、王伊琴 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27537—2011

　　动物流感检测 A型流感病毒分型基因

　　芯片检测操作规程

　　1 范围

　　本标准规定了 A 型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程 。

　　本标准适用于口岸样品中 A 型流感病毒全部亚型(H1~ H16,N1~N9)的筛查 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　ctr1、ctr2和 ctr3:质控探针 1、2 和 3(control1、control2 and control3)

　　DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)

　　dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)

　　PBS:磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer solution)

　　RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)

　　RT-PCR:反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction)

　　SDS:十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate)

　　SSC:氯化钠/柠檬酸钠缓冲液(sodium chloride-sodium citrate buffer)

　　TAMRA:羧基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine)

　　4 主要试剂和仪器

　　4. 1 主要试剂

　　4. 1. 1 试验用水

　　蒸馏水 ,按照 GB/T 6682,三级用水 ,除另有规定外 ,所用生化试剂均为分析纯 。

　　4. 1. 2 提取试剂

　　Trizol试剂等或商品化的病毒 RNA提取试剂 。

　　4. 1. 3 A型流感病毒多重不对称 RT-PCR扩增引物和探针的合成

　　特异性引物和探针(参见附录 A) 。探针和引物合成后 ,采用无 RNA酶的水(参见附录 B)分别溶解为 50 μmol, -20 ℃保存备用 。

　　1

　　GB/T 27537—2011

　　4. 1. 4 RT-PCR反应试剂

　　一步法 RT-PCR缓冲液 ,dNTP,酶混合物 ,RNA酶抑制剂等 。

　　4. 1. 5 基因芯片

　　含有 A 型流感病毒 16个 HA 亚型和 9个 NA亚型特异性探针和质控探针 ,参见附录 C。

　　4. 1. 6 基因芯片杂交液

　　商品 化 的 基 因 芯 片 杂 交 液 (参 见 附 录 B) , 每 份 含 有 ddH2 O 0. 7 μL, 20 × SSC 1. 5 μL, 50×Denhardt’s 1. 5 μL,50%(质 量 体 积 比) 硫 酸 葡 聚 糖 3. 0 μL, 4%(质 量 体 积 比) SDS 1. 5 μL, 共8. 2 μL/份 。

　　4. 1. 7 杂交质控探针

　　TAMRA荧光标记的一段寡核苷酸(ctr1) , 与芯片上杂交阳性参照(PC,ctr2) 序列互补 ,用于质控杂交过程(序列参见附录 A) 。合成后 ,采用无 RNA酶的水溶解为 50 μmol/L, -20 ℃保存备用 。

　　4. 2 仪器

　　4. 2. 1 微型台式高速冷冻离心机(大于 13 000 r/min) 。

　　4. 2. 2 PCR仪 。

　　4. 2. 3 涡旋混匀器 。

　　4. 2. 4 恒温水浴箱 。

　　4. 2. 5 芯片杂交盒 。

　　4. 2. 6 脱色摇床 。

　　4. 2. 7 基因芯片扫描仪 。

　　4. 2. 8 冰箱(2 ℃ ~ 8 ℃ 、-20 ℃和 -80℃三种) 。

　　4. 2. 9 微量可调移液器 。

　　4. 2. 10 离心管和枪头 。

　　5 操作方法

　　5. 1 采样工具

　　下列采样工具应经(121±2) ℃ ,15 min高压灭菌并烘干 :

　　— 棉拭子 ;

　　— 剪刀 ;

　　— 镊子 ;

　　— 1. 5 mL离心管 ;

　　— 研钵 。

　　5. 2 样品采集

　　5. 2. 1 活动物

　　取鼻拭子 、咽喉拭子和泄殖腔拭子 ,采集方法如下 :

　　— 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮 2 次 ~ 3 次并旋转 ,取鼻腔分泌液 ;

　　— 取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮 2 次 ~ 3 次并旋转 ,取咽喉分泌液 ;

　　2

　　GB/T 27537—2011

　　— 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便 ;

　　— 将采样后的拭子分别放入盛有 1. 0 mL PBS的 1. 5 mL离心管中 ,加盖 、编号 。

　　5. 2. 2 脏器或肌肉组织

　　用无菌镊子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织 ,装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 ,编号 。

　　5. 3 样品贮运

　　样品采集后 ,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋) ,于保温箱中加冰 、密封 ,24 h内送实验室 。

　　5. 4 样品的处理

　　5. 4. 1 棉拭子处理方法

　　样品在混匀器上充分混合后 ,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出 ,室温放置 30 min,取上清液转入无菌的 1. 5 mL离心管中 ,编号备用 。

　　5. 4. 2 肌肉或组织脏器处理方法

　　取待检样品 2. 0 g,加入等量灭菌石英砂 ,于洁净 、灭菌并烘干的研钵中充分研磨 ,加入 10 mL PBS混匀 ,4 ℃ ,3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌的 1. 5 mL离心管中 ,编号备用 。

　　5. 5 样品 RNA 的制备

　　5. 5. 1 取上清液 200μL,分别加入 1. 5 mL离心管内 ,各加入 Trizol试剂 1. 0 mL,反复混匀 ,冰上放置5 min。

　　5. 5. 2 加入 200 μL氯仿 ,小心盖上帽盖 ,用力摇动离心管 15 s,室温放置 5 min。

　　5. 5. 3 12 000 r/min,4 ℃ ,离心 15 min,可见分为三层 ,上层水相含 RNA。

　　5. 5. 4 转移水相至一新离心管内 ,加入等量异丙醇 ,混匀 ,室温放置 15 min。

　　5. 5. 5 12 000 r/min,4 ℃ ,离心 10 min,离心后在离心管边和底部可见有胶样 RNA沉淀(对于细胞毒而言 ,可能看不到沉淀) 。

　　5. 5. 6 小 心 吸 弃 上 清 , 加 入 500 μL 75%乙 醇 (用 DEPC 水 配 制) , 小 心 颠 倒 以 漂 洗 沉 淀 及 管 壁 , 12 000 r/min,4 ℃ ,离心 5 min。

　　5. 5. 7 小心吸弃上清 ,室温干燥 RNA 沉淀 5 min~ 10 min。 然后加入 20 μL无 RNA 酶的水溶解沉淀 。提取的 RNA应在 2 h 内进行 RT-PCR扩增 ,若需长期保存 ,应放置 -80℃冰箱保存 。

　　5. 6 A型流感病毒 RNA 多重不对称 RT-PCR扩增体系

　　5. 6. 1 引物混合比例

　　25对引物分为 4组 。第 1组包括 H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和 N2,其中 H5和 H7亚型的上游引物为 0. 65μL,下游引物为 1. 3 μL,N2亚型的上游引物为 0. 6 μL,下游引物为 1. 2 μL,其余亚型的上游引物均为 0. 5 μL,下游引物均为 1 μL;第 2组包括 H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15和 H16,每个亚型的上游引物均为 0. 5 μL,下游引物均为 1 μL;第 3组包括 H14、N4、N6、N7和 N9,其中 N7上游引物为 0. 65 μL,下游引物为 1. 3 μL,其余亚型上游引物均为 0. 5 μL,下游引物均为 1 μL;第 4组包括 H12、 N3、N5和 N8,其中 N5上游引物为 0. 6 μL,下游引物为 1. 2 μL,其余亚型上游引物均为 0. 5 μL,下游引物均为 1 μL。

　　5. 6. 2 RT-PCR反应体系

　　每个样品分 4个管 进 行 RT-PCR。 在 0. 2 mL PCR 反 应 管 中 依 次 加 入 一 步 法 RT-PCR 缓 冲 液

　　3

　　GB/T 27537—2011

　　10 μL,10 mmol/L dNTP 2. 0 μL,酶混合物 2. 0 μL,RNA 酶抑制剂 0. 5 μL,通用引物上游 0. 5 μL、下游 5. 0 μL,RNA模板 5. 0 μL,按照 4组引物混合物的用量分别加入引物混合物 ,补无 RNA 酶的水至

　　50. 0 μL。置于 PCR仪立即进行 RT-PCR扩增 。

　　5. 7 A型流感病毒多重不对称 RT-PCR反应条件

　　反应条件 :50 ℃ 30 min;95 ℃ 15 min;94℃ 20 s,52 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,共 20个循环 ;然后 94 ℃ 20 s,70 ℃ 90 s,共 20个循环 ;最后 72 ℃延伸 10 min。扩增反应结束后 ,取出放置于 4 ℃ 。

　　5. 8 基因芯片的杂交、洗涤与扫描

　　5. 8. 1 杂交步骤

　　5. 8. 1. 1 扩增产物 5. 2 μL(4组 RT-PCR产物各取 1. 3 μL) ﹑杂交质控探针 0. 8 μL和杂交液 6 μL于0. 2 mL PCR管中 ,混匀 。

　　5. 8. 1. 2 95 ℃变性 5 min,立即冰浴 3 min,4 000 r/min离心 5 s~ 10 s,将离心管放回冰浴 。

　　5. 8. 1. 3 在杂交盒的沟槽中加入 200 μL蒸馏水以防止杂交体系蒸发 ,将芯片正面向上放入盒中 。

　　5. 8. 1. 4 将已变性的杂交样品从冰盒中取出 ,用枪头轻轻吹吸 3 次 ~ 5 次 。

　　5. 8. 1. 5 取 7 μL杂交混合液加到探针点阵区 ,迅速盖上盖片和杂交盒并密封 。

　　5. 8. 1. 6 将杂交盒水平放入 52 ℃的水浴锅中 ,杂交 2. 5 h。

　　5. 8. 2 洗涤步骤

　　5. 8. 2. 1 杂 交 结 束 后 , 立 即 将 芯 片 取 出 , 放 入 预 热 至 45 ℃的 洗 涤 液 Ⅰ 中 , 100 r/min水 平 振 荡 洗 涤5 min,相同条件重复一次 。

　　5. 8. 2. 2 取出芯片 ,放入预热至 45 ℃的洗涤液 Ⅱ 中 , 100 r/min水平振荡洗涤 5 min,相同条件重复一次 。

　　5. 8. 2. 3 取出芯片 ,放入洗液 Ⅲ中 ,100 r/min室温振荡 5 min。

　　5. 8. 2. 4 将芯片在无水乙醇中浸提几次 ,然后把芯片放入芯片盒中 ,1 000 r/min离心 5 min。

　　5. 8. 3 扫描

　　用基因芯片扫描仪(波长 532 nm ,PMT60% ,激光能量 90% , 扫描仪参数不作硬性规定) 进行芯片扫描 。

　　6 结果判定

　　6. 1 检测结果成立条件

　　A 型流感病毒基因芯片点样阳性参照(QC, 即 ctr3)和杂交阳性参照(PC, 即 ctr2) ,经杂交扫描后出现特异性荧光信号 , 同时点样 buffer参照(NC)和空白参照(N)无荧光信号 ,则检测结果成立 ,否则结果不成立 ,应重新试验 。

　　6. 2 结果判断

　　6. 2. 1 阳性判定

　　在试验结果成立的前提下 ,如果样品 RT-PCR产物经杂交后 ,在各自的位置上(见图 1)出现特异性

　　4

　　GB/T 27537—2011

　　荧光信号 ,则判定为 A 型流感病毒各个亚型(包括 HA 和 NA)核酸阳性 。每条探针有 2个重复位点 , 出现 2个或 2个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性 ; 出现 1个荧光信号需进行重复试验再次读判 ,如果仍出现 1个荧光信号 ,就判为可疑 ,可采用其他方法进一步验证 。如果只有 HA或者只有 NA位点出现荧光信号 ,或者 2个以上 HA或 NA亚型位点出现荧光信号 ,都判定为该亚型核酸阳性 。

　　QC

　　QC

　　H1

　　H1

　　H1

　　H1

　　NC

　　NC

　　H1

　　H1

　　H2

　　H2

　　QC

　　QC

　　H2

　　H2

　　H3

　　H3

　　H3

　　H3

　　H4

　　H4

　　H4

　　H4

　　H5

　　H5

　　H5

　　H5

　　H6

　　H6

　　H6

　　H6

　　H7

　　H7

　　H7

　　H7

　　H7

　　H7

　　H7

　　H7

　　H8

　　H8

　　H8

　　H8

　　H9

　　H9

　　H9

　　H9

　　H10

　　H10

　　H10

　　H10

　　H11

　　H11

　　H11

　　H11

　　NC

　　NC

　　H12

　　H12

　　H12

　　H12

　　PC

　　PC

　　H13

　　H13

　　H13

　　H13

　　NC

　　NC

　　H14

　　H14

　　H14

　　H14

　　H15

　　H15

　　H15

　　H15

　　H16

　　H16

　　H16

　　H16

　　N1

　　N1

　　N1

　　N1

　　N2

　　N2

　　N2

　　N2

　　N3

　　N3

　　N3

　　N3

　　N4

　　N4

　　N4

　　N4

　　N5

　　N5

　　N5

　　N5

　　N6

　　N6

　　N6

　　N6

　　N7

　　N7

　　N7

　　N7

　　N8

　　N8

　　QC

　　QC

　　N8

　　N8

　　N9

　　N9

　　NC

　　NC

　　N9

　　N9

　　N

　　N

　　QC

　　QC

　　QC— 点样阳性参照 ;

　　PC— 杂交阳性参照 ;

　　NC— 点样 buffer参照 ;

　　N— 空白参照 ;

　　DP(H1~ H16,N1~ N9) — 检测探针 。

　　图 1 芯片探针排布图

　　6. 2. 2 阴性判定

　　如果在各亚型特异性探针位置上(见图 1)均未出现荧光信号 ,则判定为 A型流感病毒亚型核酸阴性 。

　　7 注意事项

　　7. 1 样品处理 、RNA提取和 RT-PCR加模板等操作应该符合相关生物安全操作管理规定的要求 , 同时注意自身防护 。扩增后芯片杂交检测可在普通实验室进行操作 。

　　7. 2 因涉及 RNA操作 ,为 了 防 止 RNA 降 解 , 用 于 试 验 的 器 皿 和 离 心 管 、PCR 管 及 枪 头 等 均 需 要 用DEPC水处理 ,并经过 121 ℃ 、15 min高压灭菌后才可使用 。操作时应戴一次性手套 ,并经常更换 。

　　7. 3 模板 RNA提取 、PCR反应液配制 、芯片杂交 、芯片洗涤和结果观察等应分区或分室进行 ,实验室运作应从洁净区到污染区单方向进行 。

　　7. 4 当同时需要进行数个样品的多重不对称 RT-PCR反应时 ,先配制除待检样品外的各种试剂的混合液 ,然后再分装到每个反应管中 。这样 ,可使所取的试剂体积更准确 ,减少试剂损失 ,避免重复分取同一试剂 。 同时也可以减少实验操作产生的误差 。

　　7. 5 使用酶混合物和 RNA酶抑制剂等酶类时 ,取样之前要瞬时离心 ,将液体收集到反应管底部 ; 由于酶保存液中含有 50%的甘油 ,黏度高 ,应慢慢吸取以保证取样量的准确 。

　　7. 6 上机运行前应检查各 PCR管盖是否盖紧 , 以防 RNA 和 PCR产物污染仪器 。

　　7. 7 取杂交混合液加到探针点阵区时 ,一定要轻柔 ,避免出现气泡 ,否则会影响杂交结果 。

　　7. 8 52 ℃杂交时 ,杂交盒要水平放置 。

　　7. 9 芯片洗涤时 ,洗涤液 Ⅰ 和洗涤液 Ⅱ要预热,否则洗涤不干净 ,影响扫描结果 。

　　7. 10 芯片常温避光保存 。

　　5

　　GB/T 27537—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)引物和探针序列

　　表 A. 1 A型流感病毒基因芯片多重不对称 RT-PCR 引物

　　型别

　　引物编号

　　序列(5′~ 3′)

　　长度

　　Univ-

　　ersal

　　PMA-06001-uf

　　PMA-06002-ur

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT

　　—

　　H1

　　PMA-06003-H1f

　　PMA-06004-H1r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAGCAATTGAGTTCAGTATC

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTG

　　601 bp

　　H3

　　PMA-06005-H3f

　　PMA-06006-H3r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTTACCCTTATGATGTGCC

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCCTGTTGCCAATTTCAGAG

　　669bp

　　H5

　　PMA-06007-H5f

　　PMA-06008-H5r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTGAATTGGAATATGGTAACTG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT

　　380 bp

　　H6

　　PMA-06017-H6F

　　PMA-06018-H6R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGCACTTATTGGRTCAGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTAGTTTCAATCTGTGG

　　685 bp

　　H7

　　PMA-06009-H7f

　　PMA-06010-H7r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCAGGWTCTTCWTTCTATGC

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCYCCTTGTGCATTTTGATG

　　641 bp

　　H9

　　PMA-06011-H9f

　　PMA-06012-H9r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGT

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTG

　　493 bp

　　N1

　　PMA-06013-N1f

　　PMA-06014-N1r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCCCACTTGGAATGCAGAAC

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTG

　　328bp

　　N2

　　PMA-06015-N2f

　　PMA-06016-N2r

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGATAGCATGGTCCAGCTCAAG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTCCTG

　　299bp

　　H2

　　PMA-06019-H2F

　　PMA-06020-H2R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGCGTCATTCTTCAGGAACATGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGCCTTGTTGCTATTTCWGG

　　229bp

　　H4

　　PMA-06021-H4F

　　PMA-06022-H4R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTTGTTAYCCATTTGATGTGCC

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTRACTCTTCCAGGGTTGTT

　　324bp

　　H8

　　PMA-06023-H8F

　　PMA-06024-H8R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGTTGGTCATACATAGTGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTTACTAATGGTCTGG

　　444 bp

　　H10

　　PMA-06025-H10F

　　PMA-06026-H10R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGGATTGACAAGATAAGCACCGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTTACTYACTCTACTAGGTGCTAT

　　435 bp

　　H11

　　PMA-06027-H11F

　　PMA-06028-H11R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGACTTAGAAATGTCCCAGCAA

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCATTTCCCTCGTCTTTGGC

　　437bp

　　H12

　　PMA-06035-H12F

　　PMA-06036-H12R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTACAAGAACACCAGAGATT

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGGCCATCCGCCTTCTAT

　　537bp

　　H13

　　PMA-06029-H13F

　　PMA-06030-H13R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACCCTTCTGCTCCTCATG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGAAACTGATTGATTCCCCTGG

　　474 bp

　　H14

　　PMA-06037-H14F

　　PMA-06038-H14R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCTCCCGACTAAACTGGCTA

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGCCGCTCTGATTCCTTAC

　　247bp

　　6

　　GB/T 27537—2011

　　表 A. 1 (续)

　　型别

　　引物编号

　　序列(5′~ 3′)

　　长度

　　H15

　　PMA-06031-H15F

　　PMA-06032-H15R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACTCCTTGACTGAGATCTGG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGTATCACATCTTTGTACCCAC

　　305 bp

　　H16

　　PMA-06033-H16F

　　PMA-06034-H16R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAAACTTCTCGTGCTAATCG

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCTTCAACTTGATCCCTTC

　　252 bp

　　N3

　　PMA-06049-N3F

　　PMA-06050-N3R

　　TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGGAAAGARTGGATGCATGT

　　TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTTGTTGATTCTCATCCAAGG

　　366bp