GB/T 29431-2012 番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29431—2012

　　番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofClavibactermichiganensis subsp.

　　michiganensis(Smith) Davisetal.

　　2012-12-31发布 2013-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29431—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 、华南农业大学 、中国农业大学 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :乐海 洋 、彭 仁 、刘 琼 光 、罗 来 鑫 、张 建 军 、刘 勇 、冯 欣 、龚 忠 年 、林 友 伟 、张 卫 东 、高文娜 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29431—2012

　　番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了番茄溃疡病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于番茄种子 、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃疡病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 番茄溃疡病菌基本信息

　　中文名 :番茄溃疡病菌(密执安棒形杆菌密执安亚种) 。

　　学名 : Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis(Smith, 1910) Davis et al. , 1984, 简 称Cmm) 。

　　异名 :Corynebacterium michiganense pV. michiganense(Smith) Dye & Kemp;Corynebacterium michiganense(Smith)Jensen。

　　病害英文名 :Bacterial canker of tomato。

　　属细菌域 Bacteria、放线菌门 Actinobacteria、放线菌纲 Actinobacteria、放线菌 目 Actinomvcetales、微杆菌科 Microbacteriaceae、棒形杆菌属 Clavibacter。

　　该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子 , 番茄种子内外层都可带菌 。 在田间和温室 ,该病菌由伤口 、气孔和自然孔口侵入寄主组织 ,主要通过灌溉水 、雨水 、修枝剪 、培养料等传播 。该病菌在土壤和病残体组织中可存活 2 年 ~ 3 年 。

　　番茄溃疡病菌的其他基本信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据番茄溃疡病菌的危害状 ,对检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并带回实验室作进一步分离鉴定 ,依据病原菌的培养性状 、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行判定 。

　　5 仪器和用具

　　生物显微镜 、超净工作台 、高压灭菌锅 、光照恒温培养箱 、恒温振荡培养箱 、电子天平 、低温冰箱 、接种环 、牙签 、注射器 、恒温水浴锅 、高速冷冻离心机(12 000 r/min 以上) 、匀浆机 、PCR 仪 、电泳装置(电泳仪和水平电泳槽) 、凝胶成像分析仪 、微量可调加样器等 。

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　　6 主要试剂

　　蔗糖 、蛋白胨 、酪蛋白水解物 、酵母膏 、葡萄糖 、磷酸氢二钾(K2 HPO4 ) 、磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 、硫酸镁(MgSO4 · 7H2 O) 、琼脂 、萘啶酮酸钠 、硫酸多粘菌素 、放线菌酮 、硼酸(H2BO3 ) 、甘油 、磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 、吐温-20(Tween-20) 、硫 代 硫 酸 钠(Na2S2 O3 ) 、氯 化 铵(NH4Cl) 、Trizma碱 、烟 酸 、亚 碲 酸钾 、甘露糖 、碳 酸 钙 (CaCO3 ) 、乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 、三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 、十 二 烷 基 磺 酸 钠(SDS) 、液氮 、三氯甲烷 、异戊醇 、异丙醇 、琼脂糖(电泳用) 、TaqDNA 聚合酶 、DNA Marker。

　　7 检测鉴定方法

　　7. 1 现场检疫和抽样

　　番茄种植田间的病害调查或进出境番茄样品的现场检疫中 ,若番茄植株或果实病害症状表现与附录 A 中描述类似 ,取样带回实验室作进一步分离鉴定 ; 对番茄种子可 进 行 种 植 观 察 或 样 品 分 离 鉴 定 。取样方法和步骤按照 SN/T 2122。

　　7. 2 种植观察

　　将待测的番茄种子种植于温室或实验室的育苗钵(钵内土壤或基质应灭菌) 中 ,每份种子样品种植5 000粒左右 ,最少不低于 3 000粒种子 ,生长环境温度 24 ℃ ~ 34 ℃ ,相对湿度大于或等于 70% ,种子出苗后 15 d 内观察幼苗发病情况 。如果种植期间有发病幼苗 ,且表现出番茄溃疡病苗期的 典 型 症 状(参见附录 A) ,则进一步采集可疑病株进行分离鉴定 。

　　7. 3 分离培养

　　7. 3. 1 种子中病原细菌的分离培养

　　7. 3. 1. 1 种子细菌浸提液制备

　　将 24g种子(至少 12 g)样品加入灭菌袋 ,加种子提取缓冲液(按 1 g 种子加 4 mL提取缓冲液比例) ,4 ℃培养过夜(最少 14h) ,在匀浆机上至少浸 7 min。分离培养番茄溃疡病菌所用的缓冲液 、培养基配方见附录 B。

　　7. 3. 1. 2 半选择性培养基平板分离

　　用三层消毒纱布(或过滤袋)过滤种子浸提液 ,至少取 2 mL过滤提取液 ,8000g离心 15 min,仔细除去上清液 ,沉淀用十分之一离心体积的无菌种子提取液悬浮 ,并用无菌种子提取液进行 10倍梯度稀释(稀释到 100倍) ,取 0. 1 mL每一稀释度分别涂布于 D2ANX 和 SCM 或 mSCM 半选择性培养基平板 。 同时 ,用无菌种子提取缓冲液制备 Cmm 标准菌株 10倍系列稀释液 ,取 0. 1 mL Cmm 标准菌株的每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上 , 以保证至少一个平板菌落数在 50~ 200个范围内 。将培养皿于 26℃ ~ 28℃培养 ,在 5 d、7 d、10d各检查平板菌落生长情况 。检查 Cmm 标准菌株在两种培养基上生长情况和菌落形态特征 。检查待测样品培养皿中是否有 Cmm 可疑菌落 ,与 Cmm 标准菌株比较 。记录可疑菌落和其他菌落数 。

　　在 D2ANX上培养 5 d~ 7 d后 ,Cmm 菌落黄色 ,黏液状 , 凸起 。

　　在 SCM上培养 10 d后 ,Cmm 菌落灰白半透明 ,黏液状 ,最后为不规则型 , 中间内部有黑点(斑) 。

　　在 mSCM上培养 10 d后 ,Cmm 菌落半透明米白 ,黏液状 ,最后为不规则型 , 中间内部带有黄色/橙色点(斑) 。

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　　菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异 。通常 Cmm 的形态和颜色在 SCM 和 mSCM会发生变化 。如果存在菌落形态和颜色的变化 ,每批样品每个皿至少挑取 5个可疑菌落在 YDC培养基上做进一步纯化培养观察 。在 YDC上 ,Cmm 菌落黄色 , 圆形 , 凸起 , 黏液状 , 挑取具有这些特征的菌落 ,做进一步的番茄致病性测定 。 注意在 YDC上划线过程中 ,若菌落未分开 , 其菌落形态不一定总是圆形的 ,如果存在这种情况 ,可挑取这些可疑菌落先 进 行 紫 茉 莉(Mirabilisjalapa) 接 种 检 测 ,若 测 定 为 阳性 ,则进一步在番茄上进行致病性测定 ,若测定为阴性 ,则表明为非 Cmm 细菌 。

　　7. 3. 2 病组织中病原细菌的分离培养

　　用灭菌剪刀剪取病变组织(叶片 、茎秆 、果实)上的病斑 ,在 70%酒精或含有效氯 7%的次氯酸钠溶液中表面消毒 50 s~ 60 s,无菌水清洗 3 次 ,然后将其移至灭菌培养皿中 ,加 5~ 10滴无菌水 ,用灭菌镊子和剪刀将病组织捣碎 ,静置 5 min~ 10 min, 即制成组织液 。用灭菌的接种环蘸一环组织液 ,在 SCM或 mSCM培养基上划线 ,每处理重复 3 次 ,25 ℃ ~ 28 ℃下培养 。Cmm 在 SCM 或 mSCM 培养基上生长较慢 ,在 25 ℃ ~ 28 ℃下需培养 7 d~ 10 d才可见典型浅黄色菌落 ;纯化或活化 Cmm 则用 YDC培养基为好 ,24h~48h 内就可见典型金黄色菌落 。挑取典型菌落 ,做进一步的番茄致病性测定 。如果存在与典型菌落有相似特征的可疑菌落 ,可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉接种检测 ,如果测定为阳性 ,则进一步在番茄上进行致病性测定 ,如果测定为阴性 ,则表明为非 Cmm 细菌 。

　　7. 4 紫茉莉接种检测

　　供测试 的 菌 株 在 YDC 琼 脂 斜 面 上 培 养 48 h 后 , 用 无 菌 水 洗 下 , 调 整 悬 浮 液 中 细 菌 的 浓 度 为1×107 CFU/mL。用一次性注射器注射接种紫茉莉叶片 , 同时接种标准菌株做阳性对照 , 接种无菌水为阴性对照 。接种后植株置于 18℃ ~ 36℃环境下 36h~48h,观察过敏性坏死现象 。 当用 Cmm 接种后 ,紫茉莉的叶片在 36h~48h 内就能出现典型的过敏性坏死斑 。其他棒状杆菌及常见植物病原细菌均不能引起紫茉莉产生过敏性坏死反应 。

　　7. 5 番茄上致病性测定

　　感病番茄幼苗(如华南红宝石 、佳粉 10号 、合作 908等)在生长环境温度 25 ℃ ~ 32 ℃ ,相对湿度 ≥ 70%条件下生长到 2~ 3 片真叶(大约播种后 3周 ~4周) ,用灭菌牙签蘸取 YDC平板上可疑菌落 ,在番茄幼苗的子叶和第一片真叶之间茎的位置 ,穿刺法接种 。 同时接种标准菌株做阳性对照 ,无菌牙签蘸取无菌水接种做阴性对照 。接种后植株置于 25 ℃ ~ 32 ℃条件至少 8 h 光照培养 ,并适时浇水保持苗床土壤湿润 。接种后 2周 ~ 3周 ,观察植株的萎蔫症状 , 与阳性对照进行比较并做好相关记录 。 由 Cmm引起的典型症状是在接种位置产生溃疡斑 ,变黄 ,边缘坏死 ,真叶萎蔫 。

　　7. 6 分子生物学检测

　　在上述检测和鉴定的基础上 ,可通过分子生物学检测进一步确定和验证 。从分离培养的细菌菌株中提取 DNA(也可直接用菌液 ,浓度 1×105 CFU/mL) ,或从表现典型症状的病组织中提取 DNA,作为模板 ,进行 PCR检测和电泳分析 。用 Cmm 标准菌株 DNA作为阳性对照 ,用非 Cmm 的植物病原细菌DNA作为阴性对照 ,用双蒸水作空白对照 ,进行 PCR扩增 。具体检测方法见附录 C。

　　8 结果判定

　　若经症状检验并分离的细菌菌株在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符 ,致病性测定表现典型症状 ,且 PCR检测结果为阳性 ,扩增的片段大小与描述相符 ,则可以判定为检出 Cmm。其余情况判定为未检出 Cmm。

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　　9 样品保存

　　保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥 、防虫防鼠处妥善保存 3 个月 。对检出番茄溃疡病菌的样品应至少保存 6个月 , 以备复检 、谈判和仲裁 ,该类样品保存期满后 ,需经灭菌后方可处理 。

　　10 菌株保存

　　从检测样品中分离并鉴定为番茄溃疡病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 YDC或 523斜面培养基上 ,然后置于 4 ℃冰箱中保存 ,定期(30d)转接 ;或将菌种接种于 10% ~ 20%(体积分数) 灭菌甘油中 - 80 ℃ 下 保 存 ( 1 年 ~ 2 年) ; 必 要 时 可 将 菌 株 用 真 空 冷 冻 干 燥 机 冻 干 后 - 80 ℃ 下 长 期 保存(5年 ~ 10年) 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　番茄溃疡病菌(Cmm)其他信息

　　A. 1 地理分布

　　亚洲 : 中国 、印度 、伊朗 、以色列 、日本 、黎巴嫩 ;非洲 :埃及 、肯尼亚 、摩洛哥 、南非 、多哥 、突尼斯 、乌干达 、赞比亚 、津巴布韦 ;欧洲 :土耳其 、奥地利 、比利时 、保加利亚 、芬兰 、法国 、德国 、希腊 、匈牙利 、爱尔兰 、意大利 、立陶宛 、荷兰 、挪威 、波兰 、葡萄牙 、罗马尼亚 、西班牙 、瑞士 、英国 、乌克兰 、俄罗斯 ; 大洋洲 :澳大利亚 、新西兰 ;美洲 :美国 、墨西哥 、加拿大 、伯利兹 、哥斯达黎加 、古巴 、巴拿马 、多米尼加 、巴西 、哥伦比亚 、阿根廷 、智利 、秘鲁等 60多个国家 。

　　A. 2 寄主范围

　　番茄(Lycopersiconesculentum) 、树番茄(Cyphomandrabetacea) 、心 叶 烟(Nicotianaglutinosa) 、乳茄(Solanum mammosum) 、马铃薯(Solanum tuberosum) 、人参果(solanum muricatum) 、龙葵(Sola- num nigrum) 、裂叶茄(Solanum triflorum) 。 人 工 接 种 可 侵 染 小 麦 (Triticum spp. ) 、大 麦 (Hordeum vulgare) 、黑麦(Secalecereale) 、燕麦(Avena spp. ) 、向 日葵(Helianthusannuus) 、西瓜(Citrulluslana- tus) 、黄瓜(Cucumissativus) 、辣椒(Capsicum annuum) 、茄子(Solanum melongena)等 。

　　A. 3 症状

　　番茄溃疡病是一种系统性病害 ,从番茄育苗到收获期均可发生 。在温室条件下 ,最初的症状是叶片表现萎蔫 , 叶脉之间产生白色 ,后是褐色的坏死斑点 ,最后表现出永久性萎蔫 ,致使整株干枯死亡 。在田间 ,最初的症状是低位叶片的边缘出现卷缩 、下垂 、凋萎 ,似缺水状 。 随病情发展 , 叶脉和叶柄上出现小白点 ,在茎和叶柄上出现褐色条斑 、下陷 、向上下扩展 ,并且爆裂 ,露出黄到红褐色的髓腔 , 出现溃疡症状 。幼嫩果实发病后皱缩 、滞育 、畸形 。果实感病后往往出现白色圆形小点 , 扩展后变为褐色 , 中心粗糙 、略微突起 ,直径约 3 mm 左右 ,斑点边缘围绕着白色晕圈 ,呈典型的 “鸟眼状 ”。鸟眼斑是诊断番茄溃疡病的典型症状 。此外 ,不同的季节和栽培条件下溃疡病的发生症状不尽相同 。

　　辣椒叶片病斑灰绿色 ,不规则 、木栓质疱疹 , 中央褐色 ,疱疹往往崩溃 ,成不规则形褐斑 , 叶片脱落 。果实上形成鸟眼状斑 ,与番茄果实上的症状类似 。

　　A. 4 生物学特性

　　病 原 细 菌 短 杆 状 或 棒 杆 状 , 革 兰 氏 染 色 阳 性 , 无 芽 孢 , 无 鞭 毛 , 严 格 好 氧 。 大 小 为(0. 3 μm~0. 4 μm) × (0. 6 μm~ 1. 2 μm) ,在 523培养基(见附录 B) 上 28 ℃培养 ,菌落黄色 、圆形 、略突起 、边缘整齐 、光滑不透明 、黏稠状 ,直径 2 mm~ 3 mm。 在 YDC上 ,Cmm 菌落黄色 , 凸起 , 黏液状 。接种烟草和紫茉莉可产生过敏性坏死反应 。硝酸盐还原阴性 ,尿酶阴性 , 明胶液化慢 ,水解七叶苷 ,水解淀粉能力很弱或不水解 。生长需要氨基酸 、生物素 、烟酸和硫胺素 。最高能忍耐 4%的盐度 , 能利用葡萄糖 、蔗糖 、阿拉伯糖 、甘露糖 、麦芽糖和甘油 ,不能利用鼠李糖 、棉子糖 、松三糖 、甘露醇 、山梨醇 。 能利用苯甲酸 、柠檬酸 、延胡索酸 、丁二酸和苹果酸 ,不能利用甲酸 、丙二酸 、草酸 、酒石酸 、丙酸及半乳糖酸 。液化明胶 ,不产生吲哚 ,但产生 H2S,不还原硝酸盐 , 石蕊牛乳还原不产生氨 。 尿酶 、苯丙酸脱氨酶 、氧化酶 、色氨酸脱氨酶阴性 ,过氧化氢酶为阳性 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　番茄溃疡病菌(Cmm)常用培养基、缓冲液配方

　　B. 1 种子提取缓冲液(pH 7. 4)

　　Na2 HPO4 7. 75 g;KH2PO4 1. 65 g;Tween-20 0. 2 mL;Na2S2 O3 0. 5 g(当种子已经用次氯酸盐处理后推荐使用) ;蒸馏水 1 000 mL,pH值调至 7. 4,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B. 2 D2ANX培养基

　　酵母膏 2. 0 g;酪蛋白水解物 4. 0 g;葡萄糖 10. 0 g;MgSO4 · 7H2 O 0. 3 g;NH4Cl1. 0 g;Trizma碱1. 2 g;琼脂 18g;蒸馏水 1000mL,121℃高压灭菌 15min后 ,冷却至 50℃时加入 2. 8 mL萘啶酮酸钠(10mg/mL,溶解于 0. 1 mol/L NaOH 中) ,0. 5 mL放线菌酮(200mg/mL,溶解于纯甲醇中) ,1 mL硫酸多粘菌素(10mg/mL,溶解于蒸馏水中) 。

　　B. 3 SCM 培养基

　　酵母膏 0. 1 g;蔗糖 10. 0 g;H3BO3 (硼酸)1. 5 g;MgSO4 · 7H2 O 0. 25 g;K2 HPO4 2. 0 g;KH2PO4 1. 5 g;琼脂 18 g;亚碲酸钾 10 mg;蒸馏水 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min后 ,冷却至 50 ℃时加入3 mL 萘啶酮酸钠(10mg/mL,溶解于 0. 1 mol/L NaOH 中) ,1 mL放线菌酮(200mg/mL,溶解于纯甲醇中) ,5 mL烟酸(20mg/mL,溶解于蒸馏水中) 。

　　B. 4 mSCM 培养基

　　酵母膏 0. 1 g; 甘 露 糖 10. 0 g; H3BO3 (硼 酸) 1. 5 g; MgSO4 · 7H2 O 0. 25 g; K2 HPO4 2. 0 g; KH2PO4 1. 5 g;琼脂 18g;蒸馏水 1000mL,121℃高压灭菌 15min后 ,冷却至 50℃时加入 3 mL萘啶酮酸钠(10mg/mL,溶解于 0. 1 mol/L NaOH 中) , 1 mL 放 线 菌 酮(200 mg/mL, 溶 解 于 纯 甲 醇 中) , 5 mL 烟酸(20mg/mL,溶解于蒸馏水中) 。

　　B. 5 YDC(酵母浸膏-葡萄糖-碳酸钙)培养基

　　酵母浸膏 10. 0 g;D-葡 萄 糖 20. 0 g;CaCO3 超 微 粉 (light powder) 20. 0 g;琼 脂 18. 0 g;蒸 馏 水1 000 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B. 6 523培养基(pH 7. 0~pH 7. 1)

　　蛋白胨 8 g;酵 母 粉 4 g; MgSO4 · 7H2 O 0. 3 g; 蔗 糖 10 g;磷 酸 氢 二 钾 2 g;琼 脂 18 g;蒸 馏 水1 000 mL,pH值调至 7. 0~ 7. 1,121 ℃高压灭菌 15 min。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　番茄溃疡病菌(Cmm)PCR检测方法

　　C. 1 试剂及配制

　　C. 1. 1 DNA抽提液配方

　　100 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0 100 mmol/L EDTA

　　250 mmol/L NaCl 100 μg/mL蛋白酶 K

　　C. 1. 2 CTAB沉淀液配方

　　1%CTAB(质量浓度)(十六烷基三乙基溴化铵)

　　50 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0

　　10 mmol/L EDTA,pH 8. 0

　　C. 1. 3 TE 缓冲液配方

　　10 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0

　　1 mmol/LEDTA,pH 8. 0

　　C. 1. 4 TAE 电泳缓冲液(pH 8. 5)配方

　　Tris 242 g 冰乙酸 57. 1 mL

　　Na2EDTA · 2H2 O 37. 5 g 蒸馏水定溶至 1 000 mL

　　灭菌后常温保存 ,用时稀释 50倍 。

　　C. 1. 5 10× 电泳上样缓冲液(pH 8. 5)配方

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　　20%(质量浓度)Ficoll400 1. 9%(质量浓度)SDS

　　

　　0. 1 mol/LNa2EDTA(pH 8. 0)

　　0. 25%(质量浓度)溴酚蓝

　　C. 2 样品 DNA提取

　　C. 2. 1 病组织中总 DNA提取

　　将待检测的新鲜病组织约 0. 2 g用剪刀剪碎 ,置于灭菌研钵中 ,加入适量液氮 ,迅速研磨 ,成粉状 。然后将其转移 至 1. 5 mL 离 心 管 中 , 加 入 1. 2 mL DNA 抽 提 缓 冲 液(含 2%β-巯 基 乙 醇) , 充 分 混 匀 , 65 ℃水浴中孵育 30 min。室温 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 700 μL移至另 一 1. 5 mL离心管中 ,加入 5 μLRnaseA(10μg/mL) ,37 ℃水浴孵育 30 min。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1) ,颠倒混匀 。室温 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 600 μL移至另一 1. 5 mL离心管中 ,加入等体积CTAB沉淀液 ,混匀 ,室温 12 000 r/min离心 10min,弃上清液 。加入 600μL氯化钠(1. 2 mol/L)室温静置 5 min,加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1) ,颠倒混匀 。 室温 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 600 μL 移 至 另 一 1. 5 mL 离 心 管 中 , 加 入 0. 6 倍 体 积 的 异 丙 醇 , 混 匀 , 室 温 静 置 30 min。

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　　12 000 r/min离心 10 min,弃上清液 。用 70%冷乙醇洗涤沉淀两次 ,无水乙醇洗涤沉淀一次 , 晾干 。加入 50 μLTE缓冲液溶解 DNA沉淀 。 -20 ℃长期保存 。

　　C. 2. 2 病原细菌 DNA 的提取

　　将供试菌株在 523斜面培养基上培养 48h(28 ℃) 。在每一试管中加入 0. 1 mol/L磷酸钠缓冲液10 mL洗下菌苔 。将细菌悬浮液转移至一干净的 12 mL离心管中 , 12 000 r/min离心 15 min,弃上清液 。在沉淀中加入 TE缓冲液 5 mL,10%SDS溶液 300 μL,20 mg/mL蛋白酶 K 30 μL,混匀 ,37 ℃水浴孵育 1 h。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1) ,混匀 。 10000 r/min离心 5 min,将上清液移至一个新管中 。加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) ,混匀 , 10 000 r/min离心 5 min,将上清液移至一个新管中 。加入 0. 6倍体积的异丙醇 ,轻轻混合至 DNA沉淀 ,10 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ,用 70%乙醇洗涤沉淀 , 晾干 ,加入 50 μLTE缓冲液溶解 DNA沉淀 , -20 ℃长期保存 。

　　注 : 此步也可省略 。可直接用培养的菌株稀释成 ≥105 CFU/mL 的菌悬液作模板进行 PCR检测 。

　　C. 3 PCR检测

　　C. 3. 1 PCR反应体系

　　C. 3. 1. 1 检测 Cmm 采用的 PCR 引物序列见表 C. 1。

　　表 C. 1 检测 Cmm 的 PCR 引物序列

　　引物名称

　　引物序列

　　PCR产物大小bp

　　Spm4f

　　正向引物 :5’-TCAGGCGTCTGTTCTGGC-3’

　　223

　　Spm2r

　　反向引物 :5’-CCCACCACCATCCACAAC-3’

　　C. 3. 1. 2 检测 Cmm 采用的 PCR反应体系见表 C. 2。

　　表 C. 2 检测 Cmm 的 PCR反应体系

　　组 成

　　加样体积μL

　　10×PCR缓冲液(含 MgCl2 浓度为 15 mmol/L)

　　2. 5

　　dNTP(各 2. 5 mmol/L)

　　2

　　TaqDNA聚合酶(2. 5 U/μL)

　　0. 4

　　正向引物(10 pmol/μL)

　　1

　　反向引物(10 pmol/μL)

　　1

　　模板 DNA(1ng/μL~ 10 ng/μL)

　　1

　　双蒸水

　　17. 1

　　总体积

　　25

　　C. 3. 2 PCR反应循环参数

　　检测 Cmm 采用的 PCR反应条件为 :

　　94 ℃预变性 5 min;随 后 94 ℃ , 30 s, 60 ℃ , 40 s, 72 ℃ , 1 min, 进 行 35个 循 环 ; 最 后 72 ℃延 伸

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　　7 min,并置于 4 ℃保温 。

　　上述 PCR反应用 Cmm 标准菌株 DNA作为阳性对照 ,用非 Cmm 的植物病原细菌 DNA作为阴性对照 ,用双蒸水作空白对照 。

　　C. 3. 3 PCR扩增产物的检测

　　用 TAE 电泳缓冲液制备 2%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,将混有上样缓冲液的 PCR扩增产物加样品孔中 ,用 DNA Marker做相对分子质量标记 ,进行电泳分析 , 电泳结束后 ,在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带 ,拍摄并记录实验结果 。

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