GB/T 4789.27-2008 食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验

　　ICS 07 . 100 . 30 C 53

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 4789 . 27—2008代替 GB/T 4789 . 27—2003

　　食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验

　　Microbiologicalexamination offoodhygiene—

　　Examination ofresidueofantibioticsin fresh milk

　　2008-1 1-21 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　前 言

　　本标准修改采用了国际分析家学会(AOAC) AOAC 982 . 18《液体牛奶制品中的 β-乳胺抗生素定性的颜色反 应 试 验》( AOAC Official Method 982 . 18 : Beta-lactam antibiotics in fluid milk products— Qualitative color reaction tests)作为第二法 。

　　本标准与 AOAC 982 . 18 相比主要区别如下：

　　— 扩大适用范围 为 鲜 乳 中 能 抑 制 嗜 热 脂 肪 芽 胞 杆 菌 卡 利 德 变 种( Bacillusstearothermophilus var. calidolactis)的抗生素的检验，也可用于复原乳 、消毒灭菌乳 、乳粉中抗生素的检测;

　　— 修改了试剂盒加营养片方法，直接将含有试验菌株芽胞的培养基制备在小试管内;

　　— 将 “注：偶尔有 特 殊 批 次 的 试 剂 盒 可 能 需 要 较 长 的 温 育 时 间 才 能 完 全 显 色 。 如 果 …… 每 隔10 min检查一次颜色显示情况，并记录 每 个 批 号 产 品 所 需 要 的 最 适 当 的 温 育 时 间 。 (Note: Occasionally kits of a particular Lot No. may require a longer incubation time for color to fully develop . If ……Check color development at 10 min intervals and record optimum incu- bation time required for each Lot No. ) ”程序修改为 “如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30 min作最终观察 ”;

　　— 删除青霉素酶确证程序 。

　　本标准代替 GB/T 4789 . 27—2003《食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留量检验》。

　　本标准与 GB/T 4789 . 27—2003 相比主要修改如下：

　　— 标准名称修改为 “食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验 ”;

　　— 增加了第二法，将原标准的嗜热乳酸链球菌方法确定为第一法;

　　— 增加了附录 A“培养基和试剂 ”。

　　本标准的附录 A 为规范性附录 。

　　本标准由中华人民共和国卫生部提出并归 口 。

　　本标准由中华人民共和国卫生部负责解释 。

　　本标准负责起草单位：福建省疾病预防控制中心 。

　　本标准参加起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 、中国检验检疫科学研究院 、河南省疾病预防控制中心 、湖北省疾病预防控制中心 。

　　本标准主要起草人：马群飞 、郭云昌 、李瑾 、田卫 、廖兴广 、马弋 、田静 。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB 4789 . 27—1984 、GB/T 4789 . 27—1994 、GB/T 4789 . 27—2003 。

　　Ⅰ

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验

　　1 范围

　　本标准规定了鲜乳中抗生素残留的检验方法 。

　　本标准的第一法适用于鲜乳中能抑制嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)的抗生素的检验;第二法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种(Bacillusstearothermophilusvar. calidola- ctis)的抗生素的检验，也可用于复原乳 、消毒灭菌乳 、乳粉中抗生素的检测 。

　　第一法 嗜热链球菌抑制法

　　2 原理

　　样品经过 80 ℃杀菌后，添加嗜热链球菌菌液 。培养一段时间后，嗜热链球菌开始增殖 。这时候加入代谢底物 2 , 3 , 5-氯化三苯四氮唑(TTC) , 若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，还原 TTC成为红色物质 。 相反，如果样品中含有高于检测限的抑菌剂，则嗜热链球菌受到抑制，因此指示剂 TTC不还原，保持原色 。

　　3 设备和材料

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

　　3 . 1 冰箱：2 ℃ ~ 5 ℃ 、-20 ℃ ~ - 5 ℃ 。

　　3 . 2 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃ 。

　　3 . 3 带盖恒温水浴锅：36 ℃ ± 1 ℃ 、80 ℃ ±2 ℃ 。

　　3 . 4 天平：感量 0 . 1 g、0 . 001 g 。

　　3 . 5 无菌吸管：1 mL(具 0 . 01 mL刻度)，10 . 0 mL(具 0 . 1 mL刻度)或微量移液器及吸头 。

　　3 . 6 无菌试管：18 mm×180 mm 。

　　3 . 7 温度计：0 ℃ ~ 100 ℃ 。

　　3 . 8 旋涡混匀器 。

　　4 菌种 、培养基和试剂

　　4 . 1 菌种：嗜热链球菌 。

　　4 . 2 灭菌脱脂乳：见第 A. 1 章 。

　　4 . 3 4% 2 , 3 , 5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液：见第 A. 2 章 。

　　4 . 4 青霉素 G参照溶液：见第 A. 3 章 。

　　5 检验程序

　　鲜乳中抗生素残留检验程序见图 1 。

　　1

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　图 1 鲜乳中抗生素残留检验流程图

　　6 操作步骤

　　6 . 1 活化菌种

　　取一接种环嗜热链球菌菌种，接种在 9 mL灭菌脱脂乳中，置 36 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中培养 12 h ~ 15 h 后，置 2 ℃ ~ 5 ℃冰箱保存备用 。每 15 d转种一次 。

　　6 . 2 测试菌液

　　将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭菌脱脂乳，36 ℃ ± 1 ℃培养 15 h±1 h ,加入相同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成为测试菌液 。

　　6 . 3 培养

　　取样品 9 mL,置 18 mm×180 mm试管内，每份样品另外做一份平行样 。 同时再做阴性和阳性对

　　2

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　照各一份，阳性对 照 管 用 9 mL 青 霉 素 G 参 照 溶 液，阴 性 对 照 管 用 9 mL 灭 菌 脱 脂 乳 。 所 有 试 管 置80 ℃ ±2 ℃水浴加热 5 min,冷却至 37 ℃以下，加入测试菌液 1 mL , 轻轻旋转试管混匀 。 36 ℃ ± 1 ℃水浴培养 2 h ,加 4%TTC水溶液 0 . 3 mL,在旋涡混匀器上混合 15 s 或振动试管混匀 。 36 ℃ ± 1 ℃水浴避光培养 30 min,观察颜色变化 。如果颜色没有变化，于水浴中继续避光培养 30 min 作最终观察 。观察时要迅速，避免光照过久出现干扰 。

　　6 . 4 判断方法

　　在白色背景前观察，试管中样品呈乳的原色时，指示乳中有抗生素存在，为阳性结果 。试管中样品呈红色为阴性结果 。如最终观察现象仍为可疑，建议重新检测 。

　　7 报告

　　最终观察时，样品变为 红 色，报 告 为 抗 生 素 残 留 阴 性 。样 品 依 然 呈 乳 的 原 色，报 告 为 抗 生 素 残 留阳性 。

　　本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素 0 . 004 IU ,链霉素 0 . 5 IU ,庆大霉素 0 . 4 IU ,卡那霉素 5 IU 。

　　第二法 嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法

　　8 原理

　　培养基预先混合嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，并含有 pH 指示剂(溴甲酚紫)。加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸，pH 指示剂的紫色变为黄色 。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，pH 指示剂的颜色保持不变，仍为紫色 。

　　9 设备和材料

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

　　9 . 1 冰箱：2 ℃ ~ 5 ℃ 、-20 ℃ ~ - 5 ℃ 。

　　9 . 2 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃ 、56 ℃ ± 1 ℃ 。

　　9 . 3 恒温水浴锅：65 ℃ ±2 ℃ 、80 ℃ ±2 ℃ 。

　　9 . 4 无菌吸管或 100 μL、200 μL微量移液器及吸头 。

　　9 . 5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm 。

　　9 . 6 温度计：0 ℃ ~ 100 ℃ 。

　　9 . 7 离心机：转速 5 000 r/min 。

　　10 菌种 、培养基和试剂

　　10 . 1 菌种：嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种 。

　　10 . 2 无菌磷酸盐缓冲液：见第 A. 4 章 。

　　10 . 3 灭菌脱脂乳：见第 A. 1 章 。

　　10 . 4 溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基：见第 A. 5 章 。

　　10 . 5 青霉素 G参照溶液：见第 A. 3 章 。

　　1 1 检验程序

　　样品中抗生素残留检验程序见图 2 。

　　3

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　图 2 样品检验流程图

　　12 操作步骤

　　12 . 1 芽胞悬液

　　将嗜热脂肪芽胞杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56 ℃ ± 1 ℃培养 24 h 后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56 ℃ ± 1 ℃培养 24 h 后转入 36 ℃ ± 1 ℃培养3 d ~ 4 d ,镜检芽胞产率达到 95%以上时进行芽胞悬液的制备 。 每块平板用 1 mL ~ 3 mL 无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔(如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液 10 mL ~ 20 mL) 。将洗脱液 5 000 r/min离心 15 min 。取沉淀物加 0 . 03 mol/L 的无菌磷酸盐缓冲液(pH7 . 2),制成 109 CFU/mL芽胞悬液，置 80 ℃ ±2 ℃恒温水浴中 10 min后，密封防止水分蒸发，置 2 ℃ ~ 5 ℃保存备用 。

　　4

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　12 . 2 测试培养基

　　在溴甲 酚 紫 葡 萄 糖 蛋 白 胨 培 养 基 中 加 入 适 量 芽 胞 悬 液，混 合 均 匀，使 最 终 的 芽 胞 浓 度 为8 × 10 5 CFU/mL ~ 2 × 10 6 CFU/mL 。混合芽胞悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管200 μL,密封防止水分蒸发 。配制好的测试培养基可以在 2 ℃ ~ 5 ℃保存 6 个月 。

　　12 . 3 培养操作

　　吸取样品 100 μL加入含有芽胞的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀 。 每份检样做两份，另外再做阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为 100 μL 青霉素 G 参照溶液，阴性对照管为 100 μL 无抗生素的脱脂乳 。 于 65 ℃ ±2 ℃水浴培养 2 . 5 h ,观察培养基颜色的变化 。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养 30 min作最终观察 。

　　12 . 4 判断方法

　　在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色 。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果 。对于可疑结果应继续培养 30 min再进行最终观察 。如果培养基颜色仍然处于黄色-紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次 。

　　13 报告

　　最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性 。

　　培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴性 。

　　本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素 3 μg/L,链霉素 50 μg/L,庆大霉素 30 μg/L ,卡那霉素 50 μg/L 。

　　5

　　GB/T 4789 . 27—2008

　　附 录 A (规范性附录)培养基和试剂

　　A.1 灭菌脱脂乳

　　A.1 . 1 成分

　　无抗生素的脱脂乳 。

　　A.1 . 2 制法

　　经 115 ℃灭菌 20 min 。也可采用无抗生素的脱脂牛乳粉，以蒸馏水 10 倍稀释，加热至完全溶解， 115 ℃灭菌 20 min 。

　　A.2 4% 2 , 3 , 5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液

　　A.2 . 1 成分

　　2 , 3 , 5-氯化三苯四氮唑(TTC) 1 g

　　灭菌蒸馏水 5 mL

　　A.2 . 2 制法

　　称取 TTC,溶于灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于 2 ℃ ~ 5 ℃保存 。如果溶液变为半透明的白色或淡褐色，则不能再用 。 临用时用灭菌蒸馏水 5 倍稀释，成为 4%水溶液 。

　　A.3 青霉素 G参照溶液

　　A.3 . 1 成分

　　青霉素 G钾盐

　　30 . 0

　　mg

　　无菌磷酸盐缓冲液

　　适量

　　无抗生素的脱脂乳

　　适量

　　A.3 . 2 制法

　　精密称取青霉素 G钾盐标准品，溶于无菌磷酸盐缓冲液中，使其浓度为 100 IU/mL~ 1 000 IU/mL。再将该溶 液 用 灭 菌 的 无 抗 生 素 的 脱 脂 乳 稀 释 至 0 . 006 IU/mL , 分 装 于 无 菌 小 试 管 中，密 封 备 用 。

　　-20 ℃保存不超过 6 个月 。

　　A.4 无菌磷酸盐缓冲液

　　A.4 . 1 成分

　　磷酸二氢钠

　　2 . 83 g

　　磷酸二氢钾

　　1 . 36 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A.4 . 2 制法

　　将上述成分混合，调节 pH 至 7 . 3±0 . 1 , 121 ℃高压灭菌 20 min 。

　　A.5 溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基

　　A.5 . 1 成分

　　蛋白胨

　　10 . 0 g

　　葡萄糖

　　5 . 0 g

　　6

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　　2%溴甲酚紫乙醇溶液

　　0 . 6 mL

　　琼脂

　　4 . 0 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A.5 . 2 制法

　　在蒸馏水中加入蛋白胨 、葡萄糖 、琼脂，加热搅拌至完全溶解，调节 pH 至 7 . 1 ± 0 . 1 ,然后再加入溴甲酚紫乙醇溶液，混匀后，115 ℃高压灭菌 30 min 。

　　GB/T 4 7 8 9 2 7 2 0 0 8

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　　鲜乳中抗生素残留检验

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