GB/T 22332-2008 鸭病毒性肠炎诊断技术

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22332—2008

　　鸭病毒性肠炎诊断技术

　　Diagnostictechniquesforduck virusenteritis

　　2008-08-22 发布 2008-12-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22332—2008

　　前 言

　　本标准部分技术采用 OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2004) 推荐的试验方法，并把具体操作程序予以细化 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位：华南农业大学 、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：郭霄峰 、廖明 、洪洁心 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22332—2008

　　鸭病毒性肠炎诊断技术

　　1 范围

　　本标准规定了鸭病毒性肠炎病毒(DVEV) 分离和鉴定及聚合酶链式反应(PCR) 试 验 的 诊 断 技 术要求 。

　　本标准适用于鸭病毒性肠炎的诊断 。

　　2 临床症状和病理变化

　　家养的鸭和雏鸭从 7 日龄至成年均可感染发病 。在易感鸭群，初始症状通常为突发持续性高死亡现象，产蛋量明 显 下 降 。 由 于 感 染 禽 的 品 种 、年 龄 、性 别 以 及 病 毒 毒 力的 不 同，暴 发 鸭 病 毒 性 肠 炎 (DVE)后临床症状 、剖检病变有很大的差异 。种鸭临床症状为流泪 、怕光 、烦渴 、缺乏食欲 、共济失调 、水样腹泻和流鼻液 。通常病鸭羽毛蓬乱，肛门粘有污物 。病鸭借助翅膀支撑方能保持平衡，整个外观虚弱 、精神沉郁 。但 2 周 ~ 7 周龄鸭中损失比成鸭低，其症状为脱水 、体重下降，喙呈蓝色，肛门染有血迹 。

　　剖检时发现，死亡的鸭并不消瘦 。性成熟的公鸭的阴茎可能脱垂 。性成熟母禽的卵巢滤泡出血 。特征性大体病变以血管受损，带有组织出血和体腔游离血液，消化道粘膜表面有环状出血和白喉样损坏，淋巴样器官受损，实质器官呈退行性病变为特征 。 白色北京鸭的特征性病变是血管及内脏器官损伤，消化道上皮细胞出现嗜酸性核内包涵体和胞浆内包涵体 。

　　3 病毒分离

　　3 . 1 材料准备

　　3 . 1 . 1 病料的采集：一般应在感染初期或发病急性期从濒死期禽或活禽采取 。濒死期禽采集肝 、脾 、脑等组织样品 。活禽用灭菌的棉拭子涂抹泄殖腔 。带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有 1 000 IU 青霉素，1 000 μg链霉素，pH7 . 2 ~ 7 . 6 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 中 。 送 检 病 料 应 置 于 50% 的 甘 油 生 理 盐水中 。

　　3 . 1 . 2 病料的保存：采集的样品若在 48 h 内处理，可于 4 ℃保存;否则应放- 20 ℃以下保存(- 70 ℃贮存最好)。

　　3 . 1 . 3 病料的处理：将棉拭子充分捻动 、拧干后除去拭子 。样品液经 3 000 r/min 4 ℃离心 30 min,取上清液作为接种材料 。组织样品先用 pH7 . 2 ~ 7 . 6 的 PBS制成 5 倍 ~ 10 倍乳剂，3 000 r/min 4 ℃离心30 min,取上清液作为接种材料 。 为防止细菌污染，可在样品液中加入青 霉 素(1 000IU/mL) ,链 霉 素(1 000 μg/mL) ,卡那霉素(1 000 μg/mL) , 37 ℃温箱中作用 30 min 。进行无菌检验 。

　　3 . 1 . 4 鸭胚：10 日 ~ 11 日龄的非 DVE疫苗免疫鸭胚 。

　　3 . 2 实验操作

　　3 . 2 . 1 胚胎接种：取经处理并且无菌检验合格的样品，以 0 . 2 mL/胚的量经绒毛尿囊膜接种 10 日 ~ 11 日龄的非 DVE疫苗免疫的鸭胚，每个样品接种 4 个 ~ 5 个胚，于 38 ℃ ~ 38 . 5 ℃恒 温 箱 中 孵 育 。 72 h前每天照胚 1 次 ~ 2 次，以后每天照胚 5 次 。弃去 72 h前死亡的胚胎，冻存 72 h ~ 120 h 内的死胚或活胚 。

　　3 . 2 . 2 病毒收获：无菌收取 72 h ~ 120 h 内的死胚或活胚的绒毛尿囊膜和尿囊液，-20 ℃保存备用 。

　　3 . 2 . 3 如第一代分离结果为阴性，需盲传三代 。

　　1

　　GB/T 22332—2008

　　4 PCR

　　4 . 1 引物

　　P1 : GAG CGT ATT TAG TAG AAA CTG C(上游)

　　P2 : TGA ATG TTG TGA TTG TTC(下游)

　　4 . 2 病毒核酸的抽提

　　4 . 2 . 1 组织样品用 pH7 . 2 ~ 7 . 6 的 PBS制成 5 倍 ~ 10 倍乳剂，3 000 r/min 4 ℃离心 30 min,上清液作为待检材料 。

　　4 . 2 . 2 取一支 1 . 5 mL 的指形管，加入 400 μL待检胚液或 4 . 2 . 1 上清液和 30 μL(20 mg/mL) 核糖核酸酶，混匀后，室温下作用 20 min 。

　　4 . 2 . 3 加 43 μL 10%的十二烷基磺酸钠溶液和 5 μL(10 mg/mL)蛋白酶 K , 42 ℃水浴温育过夜 。

　　4 . 2 . 4 加等量的 Tris-盐酸饱和酚(pH7 . 6) ,充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min,小心吸出上层水相于另一个指形管中 。

　　4 . 2 . 5 加等量的酚-三氯甲烷-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) ,充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min,小心吸出上层水相于另一个指形管中 。

　　4 . 2 . 6 加 1/10 体 积 3 mol/L 的 乙 酸 钠 (pH5 . 4) , 2 . 5 倍 体 积 预 冷 的 无 水 乙 醇，15 000 r/min 离 心20 min,弃去乙醇，沉淀用 75%的乙醇洗涤一次，真空干燥 。用 20 μL灭菌双蒸水溶解沉淀，- 20 ℃保存备用 。

　　4 . 3 操作程序

　　取一支 0 . 5 mL 的 指 形 管，依 次 加 入 下 列 试 剂：2 . 5 μL 10 × 的 PCR 缓 冲 液，1 . 0 μL 上 游 引 物， 1 . 0 μL下游引物，0 . 5 μL dNTP , 1 . 0 μL病毒核酸，18 . 5 μL灭菌双蒸水，0 . 5 μL TaqDNA 酶 。 于 PCR仪中运行：94 ℃ 30 s , 55 ℃ 30 s , 72 ℃ 30 s , 25 个循环，72 ℃ 8 min 。 同时设立阳性和阴性对照 。

　　4 . 4 PCR产物的检测

　　反应结束后，PCR 产物于 1 . 2%的琼脂糖凝胶中电泳，每个样品的加样量为 5 μL ~ 10 μL , 同时以100 bp DNA分子质量标准物为参照 。50 V恒压电泳 40 min,于紫外灯下观察 。

　　4 . 5 结果的判定

　　阳性对照在 416 bp 处有一条特异的 DNA条带，阴性对照没有目的带，证明本实验成立 。待检样品在相同位置有 DNA带，判为阳性，否则为阴性 。

　　2