GB/T 21443-2008 海湾扇贝

　　ICS 65 . 150 B 51

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21443—2008

　　海 湾 扇 贝

　　Bay scallop

　　2008-02-15 发布 2008-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21443—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B、附录 C 为规范性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位：中国科学院海洋研究所 。

　　本标准主要起草人：刘保忠 、张国范 、董波 、阙华勇 、尤锋 、张晓军 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21443—2008

　　海 湾 扇 贝

　　1 范围

　　本标准给出了海湾扇贝(Argopectenirradians Lamarck) 主要形态构造特征 、生长与繁殖习性 、遗传学特征以及检测方法 。

　　本标准适用于海湾扇贝的种质监测和鉴定 。

　　2 名称与分类

　　2 . 1 学名

　　海湾扇贝 Argopectenirradians Lamarck 。

　　2 . 2 分类位置

　　软体动物门( Mollusca) ,瓣鳃纲(Lamellibranchia) ,珍珠贝 目 (Pterioida) , 扇 贝 科(Pectinidae) ,海湾扇贝属(Argopecten)。

　　3 主要生物学性状

　　3 . 1 外部形态特征

　　3 . 1 . 1 外形

　　贝壳扇形，两壳几乎相等，右壳稍高，后耳大于前耳 。前耳下方生有足丝孔，成体无足丝，绞合部相连且平直，肋较宽而高起，肋上无棘 。 生 长 纹 较 明 显 。壳 面 有 放 射 肋 17 条 ~ 18 条，壳 面 呈 黑 褐 色 、褐色 、黄色或灰白色 。成贝壳高 6 cm左右 。

　　海湾扇贝的外部形态见图 1 。

　　图 1 海湾扇贝外部形态

　　3 . 1 . 2 可数性状

　　壳面有放射肋 17 条 ~ 18 条 。

　　3 . 1 . 3 可量性状

　　对于壳长 49 . 40 mm ~ 68 . 70 mm , 体重 16 . 43 g ~ 36 . 52 g 的 55 个成体进行数量性状的测量，统计数据见表 1 。

　　1

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　　表 1 海湾扇贝数量性状统计值

　　性状

　　壳长 犔/mm

　　壳宽/mm

　　壳高 犎/mm

　　体重 犠/g

　　平均值

　　55 . 93

　　23 . 67

　　53 . 82

　　25 . 37

　　标准差

　　± 4 . 41

　　± 2 . 07

　　± 3 . 86

　　± 5 . 23

　　3 . 1 . 4 体重 、壳长生长关系式

　　海湾扇贝在自然条件下体长与体重关系见式(1) :

　　犠 = 0 . 003 2 × 犔2 . 224 4 …………………………( 1 )

　　式中：

　　犠 — 海湾扇贝体长 犔 时的体重，单位为克(g) ;

　　犔— 海湾扇贝体重 犠 时的壳长，单位为毫米(mm) 。

　　3 . 2 内部构造特征

　　3 . 2 . 1 外套膜

　　简单型外套膜，具外套眼和外套触手 。

　　3 . 2 . 2 生殖系统

　　雌雄同体，精巢位于腹嵴外周缘，卵巢位于精巢内侧 。

　　4 生长与繁殖特征

　　4 . 1 生长

　　在适宜生长条件下，8 个月平均壳长可达 5 cm,寿命 12 个月 ~ 16 个月 。

　　4 . 2 繁殖习性

　　一年有春秋两次繁殖期 。黄渤海区春季繁殖期在 5 月下旬至 6 月，秋季为 9 月 至 10 月 。

　　海湾扇贝繁殖力强，一只壳长 5 cm 以上的成贝一次产卵量为 50 × 104 粒 ~ 60 × 104 粒，一个产卵期产卵量 150 × 104 粒 ~ 200 × 104 粒 。

　　5 细胞遗传学特征

　　体细胞染色体 2 倍数：2狀=32 ,核型表达式：2 狀= 2 sm+12 st+18 t , NF= 34 。

　　即亚中部着丝粒染色体(sm 组)1 对，亚端部着丝粒染色 体(st 组)6 对，端 部 着 丝 粒 染 色 体( t 组) 9 对，染色体臂数(NF)34 ,见图 2 。

　　图 2 海湾扇贝染色体核型

　　6 生化遗传学特征

　　肌肉中苹果酸脱氢酶( MDH)同工酶为单态，酶谱见图 3 。

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　　图 3 苹果酸脱氢酶(MDH)酶谱

　　7 分子遗传学特征

　　16S rDNA序列(547bp) : 5 ’—3 ’

　　CGCCTGTTTA TCAAAAACAT GGCTCCCTTG AATAACCATA AGGAGTCGGT

　　GCCTTCCCGG TGAGTTTAAA CTTAAACGGA TGCGGTAAAG CGTGCTAAGG

　　TAGCTTAAGT TATGGCCTAG TTAATTGTAG GCCCTGTGAA TGGTTTGACG

　　AGTTTTCTTC TGTCTCTAGC TTGTTTAAGT GAACTTGAGT TGGATGTGCA

　　AATGCTTCCT TGGTAAAGAA AGACGAGAAG ACCCCGTGAG GTTAGAAATT

　　AATGTGCAGA ATAGTGGGAG GCTACTTTTT CTGCCTTATA GTTTTGGCTG

　　GGGCAGCAAG GGGGCAAAAG TAGACCCCTT AAAATTTAAT TCTGGTGAGT

　　AATGACCCAT AAGGTTTAAG GGTATGATTA GTAGAAGAAG TTACTCCGGG

　　GATAACAGCG TAATCCGCCT TGACAGTCCT TATAGATGGG TGGGTTTGCG

　　ACCTCGATGT TGGCTCTGGA TGTCCTGAAG CTGTAGGCGG TTTCAAGGGT

　　TGGTTCGTTC GCCCATTAAA ATCCAACGTG ATCTGAGTTC AGACCGG

　　8 检测方法

　　8 . 1 染色体和核型检测

　　8 . 1 . 1 染色体标本的制备

　　a) 剪取活体扇贝鳃组织，置于 0 . 04%秋水仙素溶液中处理 15 min ~ 40 min ;

　　b) 从秋水仙素溶液中取出后，置于 25%低渗海水中处理 40 min ~ 50 min ;

　　c) 从低渗海水中取出后，置于 Carnoy’s 固定液中固定 4 次，每次 15 min ;

　　d) 固定完毕后，置于 0℃ ~ 4℃冰箱中过夜;

　　e) 从冰箱中取出，在距玻片 20 cm ~ 30 cm处滴下，玻片温度 56 ℃ ~ 60 ℃ ;

　　f) 10% Giemsa染液染色 10 min ~ 20 min(Giemsa染液配制见附录 A) ;

　　g) 流水冲洗，显微镜下观察 。

　　8 . 1 . 2 染色体计数

　　在显微镜下观察，计数 100 个以上清晰 、分散良好的中期分裂相，测定染色体数目，统计得出二倍体染色体条数 。

　　8 . 1 . 3 核型分析

　　选取 7 套 ~ 10 套染色体分裂相进行拍照 、放大，测量染色体及其长臂 、短臂的长度，计算其相对长度 、臂比 、臂指数 、着丝粒指数 。根据二倍体染色体相对长度 、臂比 、着丝粒指数，参照 Levan 的分类标准，得出二倍体的染色体核型公式 。

　　8 . 2 同工酶分析

　　8 . 2 . 1 样品制备

　　样本活体，解剖取其闭壳肌 0 . 1 g~ 0 . 2 g,加 2 倍体积的 Tris-HCl缓冲液(0 . 01 mol/L, pH= 7 . 0),并

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　　加适量处理过的石英砂冰上匀浆，然后在 4℃ , 12 000 r/min 离心 20 min,取上清液分装后用于电泳 。

　　8 . 2 . 2 电泳方法

　　采用淀粉凝胶 TC缓冲系统 Tris-柠檬酸，pH= 6 . 9 进行电泳分析 。凝胶浓度为 13%(质量分数)，胶制好后，样品加在靠阴极一侧，用滤纸蘸样品液插入孔中 。 电泳在 4℃冰箱内进行，电压 120 V , 电流22 mA/板(TC) 。

　　电泳结束后进行染色，染色液配方见附录 B 。

　　8 . 3 DNA特征标记分析

　　8 . 3 . 1 DNA 的提取

　　取闭壳肌 300 mg 剪碎后，放入 600 μL裂解液，55℃水浴消化至组织碎块完全裂解 。裂解液分别用等体积的饱和酚 、酚 ∶ 三氯甲烷(1 ∶ 1) 、三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1)抽提，加入 2 倍体积的无水乙醇和终浓度 10%的乙酸钠离心沉淀 DNA,最后用 70%的乙醇洗 2 次后晾干 。裂解液配方见附录 C 。

　　8 . 3 . 2 片段克隆和纯化

　　以提取的 DNA 为模板，利用两个特异性引物进行 PCR 扩增 。

　　8 . 3 . 2 . 1 引物序列

　　f:5 ’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3 ’r;5 ’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3 ’

　　8 . 3 . 2 . 2 反应条件

　　94℃变性 2 min , 1 个循环;94℃变性 30 s, 55℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min , 35 个循环;72℃延伸10 min , 1 个循环 。

　　反应液配方见附录 C 。

　　8 . 3 . 3 序列测定

　　用基因 自动分析仪测 序，反 应 程 序 按 照 所 使 用 的 测 序 试 剂 盒 说 明 书 给 出的 规 程 操 作，最 后 读 出16S rDNA 的序列 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　吉姆萨(Giemsa)染色液配制

　　A.1 Giemsa染色母液的配制

　　称取 0 . 5 g Giemsa 粉，量取甘油 33 mL,在研钵中先用少量甘油与 Giemsa 粉混合，研磨至无颗粒时再将剩余甘油加入，在 56℃条件下保温 2 h后，再加 33 mL 甲醇，混匀，保存于棕色瓶内 。

　　A.2 磷酸缓冲液(0 . 2 mol/L，PH7 . 2)的配制

　　磷酸缓冲液由 A 液和 B液按比例混合而成 。

　　A 液(0 . 2 mol/L , Na2 HPO4 )配制：

　　取 36 . 61 g 含 1 个 结 晶 水 的 磷 酸 氢 二 钠 (Na2 HPO4 · H2 O) 定 容 于 1 000 mL 蒸 馏 水 中，或 取71 . 64 g含 2 个结晶水的磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ·2H2 O)定容于 1 000 mL蒸馏水中，即可 。

　　B 液(0 . 2 mol/L , NaH2 PO4 )配制：

　　取 27 . 6 g 含 1 个结晶水的磷酸二氢钠(NaH2 PO4 · H2 O)定容于 1 000 mL蒸馏水中，或取 31 . 21 g含 2 个结晶水的磷酸二氢钠(NaH2 PO4 ·2H2 O)定容于 1 000 mL蒸馏水中即可 。

　　取 A 液 720 mL,加上 B 液 28 . 0 mL,混合即成所需的磷酸缓冲液 。

　　A.3 Giemsa工作染色液的配制

　　取 100 mL磷酸缓冲液，加入 3 mL Giemsa染色母液即可 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)同工酶染液配方

　　苹果酸脱氢酶 ( MDH) : DL-苹 果 酸 钠，392 mg ; 0 . 1 mol/L Tris-HCl 缓 冲 液 (pH 值 8 . 0) , 2 mL ; 1 . 15 mol/L MgCl2 + 0 . 05 mol/L NaCl , 0 . 4 mL ; MTT(噻 唑 盐)，4 mg;PMS(N-甲 基 吩 嗪 甲 基 硫 酸盐)，2 . 5 mg;辅酶 Ⅰ , 5 mg 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　DNA提取裂解液和 PCR扩增反应液组成

　　C.1 DNA提取裂解液

　　HB (10 mmol/L Tris-HCl , pH8 . 0 ; 100 mmol/L EDTA)

　　540 μL

　　SDS(十二烷基磺酸钠)(10%)

　　60 μL

　　蛋白酶 K

　　100 μg

　　C.2 扩增 PCR反应液

　　DNA模板

　　l50 ng ~ 200 ng

　　10 倍扩增缓冲液

　　2 . 5 μL

　　MgCl2 (25 mmol/L)

　　2 . 0 μL

　　dNTP(10 mmol/L)

　　0 . 5 μL

　　引物 f(50 pmol/μL)

　　0 . 5 μL

　　引物 r(50 pmol/μL)

　　0 . 5 μL

　　Taq 酶(5 U/μL)

　　0 . 2 μL

　　加超纯水配制成 25 μL 的反应体系 。

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