GB/T 14926.56-2008 实验动物 狂犬病病毒检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 14926 . 56—2008代替 GB/T 14926 . 56—2001

　　实验动物 狂犬病病毒检测方法

　　Laboratory animal—Method forexamination ofRabiesvirus

　　2008-12-10 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 14926 . 56—2008

　　前 言

　　GB/T 14926《实验动物》共 54 个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法 。

　　本部分自实施之日起代替 GB/T 14926 . 56—2001《实验动物 狂犬病病毒检测方法》。

　　本部分与 GB/T 14926 . 56—2001 相比主要技术差异如下：

　　a) 删除原标准中“2 引用标准 ”内容;

　　b) 对原标准中“3 原理 ”中所有内容改为 “在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行 。 当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与抗 犬 IgG 酶 标 记 物 反 应，最 后 通 过 测 定 酶 作 用 底 物 催 化 后 的 产 物，进 行 定 性检测 ”;

　　c) 删除原标准中所有关于血凝抑制试验的试剂 、方法及结果判定;

　　d) 对原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容进行修改，包括试剂 、方法及结果判定等;

　　e) 对原标准中“6 结果判定 ”中增加了“6 . 3 基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率= (被检动物抗体阳性数/被检动物总数)× 100% 。基础级犬群体免疫抗体合格率达到 70%以上可判为该犬群免疫合格 ”内容 。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归 口 。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草 。

　　本部分主要起草人：田克恭 、陈西钊 、曹振 、王传彬 、何秀敏 、汤汉文 。

　　本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 14926 . 56—2001 。

　　Ⅰ

　　GB/T 14926 . 56—2008

　　实验动物 狂犬病病毒检测方法

　　1 范围

　　GB/T 14926 的本部分规定了狂犬病病毒(RV)的检测方法 、试剂等 。

　　本部分适用于犬 RV 的检测 。

　　2 原理

　　在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行 。 当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与抗犬 IgG 酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测 。

　　3 主要试剂和器材

　　3 . 1 试剂

　　犬狂犬病毒 IgG抗体检测试剂盒(定性)，包括：

　　a) 预包被狂犬病毒抗原的微孔板;

　　b) 狂犬病毒 IgG 酶标记物;

　　c) 狂犬病毒 IgG 阳性对照;

　　d) 狂犬病毒 IgG 临界对照;

　　e) 狂犬病毒 IgG 阴性对照;

　　f) 显色液 A：磷 酸 氢=钠-柠 檬 酸 缓 冲 液 (0 . 05 mol/L , pH5 . 0) 1 000 mL , 30%过 氧 化 氢 H2 O2 ( MW34 . 0)3 . 5 mL ;

　　g) 显色液 B：柠檬 酸 1 . 052 g , 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (EDTA-Na2 ) 0 . 186 g , 四 甲 基 联 苯 胺 (TMB)

　　0 . 25 g, 二甲基亚砜(DMSO)8 . 0 mL,纯化水 992 mL ;

　　h) 终止液：98%硫酸 27 . 8 mL,纯化水 972 . 2 mL ;

　　i) 10 倍浓缩洗涤液：PBS(0 . 1 mol/L pH7 . 2 ~ 7 . 4) 995 mL ,吐温-20 , 5 mL ;

　　j) 样品稀释液：硼酸盐缓冲液(0 . 01 mol/L pH8 . 0) 956 . 0 mL,甘油( MW92 . 09)40 . 0 mL,酪蛋白(casein)10%硫柳汞钠溶液 2 . 0 mL,吐温-20 , 1 . 0 mL 1%酚红溶液，1 . 0mL 。

　　试剂在使用前应恢复至室温(18 ℃ ~ 25 ℃) 。

　　3 . 2 器材

　　器材包括：

　　a) 精密移液器 10 μL ~ 100 μL ;

　　b) 一次性移液器吸头;

　　c) 振荡器;

　　d) 酶标仪(含 450 nm 波长滤光片);

　　e) 37 ℃恒温培养箱;

　　f) 蒸馏水或去离子水;

　　g) 100 mL量筒;

　　h) 离心机;

　　i) 吸水纸 。

　　1

　　GB/T 14926 . 56—2008

　　4 检测方法

　　4 . 1 样品的准备

　　将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆 。应避免使用染菌 、溶血和高血脂的样品;室温保存样品不应超过 8 h , 若试验在 8 h 以后进行，需将样品保存在 2 ℃ ~ 10 ℃ ,如保存超过 1 周，则应保存在 -20 ℃并避免反复冻融 。

　　4 . 2 试剂配置

　　将 10 倍浓缩洗涤液恢复至室温，并振摇，然后用去离子水或蒸馏水作 10 倍稀释 。

　　4 . 3 稀释样品

　　将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做 1 ∶ 10 稀释，即取 50 μL血清或血浆加入到 500 μL样品稀释液中，并充分混匀 。

　　4 . 4 加样

　　取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，依次加入稀释好的样品，100 μL/孔，然后将阳性 、阴性对照各加 1 孔，临界对照加 3 孔，100 μL/孔，另留一孔不加样品作为空白对照，在记录纸上记录各样品和对照的次序或位置，剩余的板条放入密封袋中保存 。

　　4 . 5 孵育

　　加样完成后，用封板膜覆盖板条，置 37 ℃恒温培养箱中孵育 30 min 。

　　4 . 6 洗板

　　甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留 1 min后甩净 、拍干，如此重复洗涤 3 次 。

　　4 . 7 加酶

　　除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物 1 滴(50 μL) ,置 37 ℃恒温培养箱孵育 30 min 。

　　4 . 8 显色

　　重复步骤 4 . 6 洗板 3 次，拍干后每孔(含空白对照孔)垂直滴加显色液 A 、B 液各 1 滴，置 37 ℃恒温培养箱避光显色 10 min 。

　　4 . 9 终止

　　每孔(含空白对照 孔)立 即 加 入 终 止 液 1 滴，混 匀 后 以 空 白 孔 调 零，用 酶 标 仪 450 nm 波 长 测 定A值 。

　　5 结果判定

　　5 . 1 试验结果符合下列条件，方为有效：以空白孔调零，阴性对照值小于等于 0 . 10 ,临界对照 A值应在

　　0 . 15 ~ 0 . 40 之间，证明试验成立 。

　　5 . 2 结果判定

　　5 . 2 . 1 待检样品 A值大于等于临界对照 A值的平均值，判为阳性;

　　5 . 2 . 2 待检样品 A值小于临界对照 A值的平均值，判为阴性 。

　　6 结果解释

　　6 . 1 基础级犬：接种疫苗后，经 ELISA检测抗体效价达到阳性值判为合格 。

　　6 . 2 SPF级犬，不应进行疫苗接种，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试 。 如为阳性则判为阳性 。

　　6 . 3 基础级犬群体免疫抗体合格率：

　　免疫抗体合格率=(被检动物抗体阳性数/被检动物总数)× 100%

　　基础级犬群体免疫抗体合格率达到 70%以上可判为该犬群免疫合格 。

　　2

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　　7 结果报告

　　根据判定结果，作出报告 。

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　　2009 年 2 月第一版 2009 年 2 月第一次印刷

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