GB/T 14926.46-2008 实验动物 钩端螺旋体检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 14926 . 46—2008代替 GB/T 14926 . 46—2001

　　实验动物 钩端螺旋体检测方法

　　Laboratory animal—Method forexamination ofLeptospiraspp.

　　2008-12-03 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

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　　中 华 人 民 共 和 国

　　国 家 标 准

　　实验动物 钩端螺旋体检测方法

　　GB/T 14926 . 46—2008

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　　中 国 标 准 出 版 社 出 版 发 行

　　北京复兴门外三里河北街 16 号

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　　中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷

　　各地新华书店经销

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　　开本 880 × 1230 1/16 印张 0 . 5 字数 9 千字

　　2009 年 2 月第一版 2009 年 2 月第一次印刷

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　　书号：155066 ·1-35767

　　如有印装差错 由本社发行中心调换

　　版权专有 侵权必究

　　举报电话：(010)68533533

　　GB/T 14926 . 46—2008

　　前 言

　　GB/T 14926《实验动物》共 54 个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法 。

　　本部分自实施之日起代替 GB/T 14926 . 46—2001《实验动物 钩端螺旋体检测方法》。

　　本部分与 GB/T 14926 . 46—2001 相比主要技术差异如下：

　　a) 原理部分增加显微镜凝集试验原理;

　　b) 原标准中“6 . 1 试管凝集实验 ”修改为 “显微镜凝集实验 ”;“6 . 1 . 2 . 2 表 1 钩端螺旋体定量显凝试验操作方法 ”更改为 “钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 ”;

　　c) 修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容;

　　d) 在原标准中增加了“7 结果判定 ”。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归 口 。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草 。

　　本部分主要起草人：范薇 、田克恭 、贺争鸣 。

　　本部分所代替标准历次版本发布情况为：

　　—GB/T 14926 . 46—2001 。

　　Ⅰ

　　GB/T 14926 . 46—2008

　　实验动物 钩端螺旋体检测方法

　　1 范围

　　GB/T 14926 的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法 。

　　本部分适用于犬钩端螺旋体的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过 GB/T 14926 的本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本 适 用 于 本部分 。

　　GB/T 14926 . 42 实验动物 细菌学检测 标本采集

　　GB/T 14926 . 43 实验动物 细菌学检测 染色法 、培养基和试剂

　　GB/T 14926 . 50 实验动物 酶联免疫吸附试验

　　3 原理

　　钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇，在适宜的电解质存在下发生凝集现象，此种凝集一般须用暗视野显微镜检查 。

　　钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，形成抗原抗体复合物 。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合 。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质 。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比 。

　　4 主要设备和材料

　　4 . 1 普通恒温培养箱 。

　　4 . 2 实体显微镜 。

　　4 . 3 恒温水浴箱 。

　　4 . 4 高速离心机 。

　　4 . 5 超声波细胞粉碎器 。

　　4 . 6 酶标仪 。

　　4 . 7 微量加样器，容量 5 μL ~ 50 μL 和 50 μL ~ 200 μL 。

　　5 培养基及试剂

　　5 . 1 犬型钩端螺旋体标准抗原 。

　　5 . 2 标准阳性血清 。

　　5 . 3 标准阴性血清 。

　　5 . 4 生理盐水 。

　　5 . 5 显微镜凝集抗原：各群钩端螺旋体标准株接种 Korthof培养基，28 ℃培养 5 d ~ 7 d 。取样作暗视野显微镜检查，每 400 倍视野不少于 50 条，运动活泼并无自凝现象者，可作为抗原 。

　　5 . 6 ELISA抗原

　　5 . 6 . 1 钩端螺旋体培养：各群钩端螺旋体标准株接种 Korthof培养基，28 ℃培养 5 d ~ 7 d 。

　　1

　　GB/T 14926 . 46—2008

　　5 . 6 . 2 生长良好的培养物用 10 000 r/min 离心 30 min,沉淀用 PBS在相同条件下洗 2 次 。

　　5 . 6 . 3 上述沉淀用 PBS悬浮，超声波打碎后，10 000 r/min 离心 20 min,上清即为 ELISA抗原 。

　　5 . 7 酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬 IgG抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白 A(SPA) 。

　　5 . 8 阳性血清：钩端螺旋体免疫 SPF犬所获得的血清，或自然感染犬后所获得的血清 。

　　5 . 9 阴性血清：无钩端螺旋体感染犬血清 。

　　5 . 10 培养基和试剂溶液的配制：参照 GB/T 14926 . 43 和 GB/T 14926 . 50 执行 。

　　6 检测方法

　　6 . 1 显微镜凝集实验

　　6 . 1 . 1 检测程序

　　检测程序见图 1 。

　　图 1 检测程序

　　6 . 1 . 2 操作步骤

　　6 . 1 . 2 . 1 采样

　　采血 、分离血清 。采样方法参照 GB/T 14926 . 42 执行 。

　　6 . 1 . 2 . 2 血清稀释

　　参照表 1 进行 。

　　表 1 钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法

　　凹孔板编号

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　6

　　7

　　8

　　9

　　10

　　11

　　12

　　生理盐水/mL

　　0 . 16

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　待检血清/mL

　　0 . 04刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　0 . 1 刀

　　弃去

　　0 . 1

　　阴性血清/mL

　　0 . 1

　　阳性血清/mL

　　0 . 1

　　标准抗原/mL

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　0 . 1

　　血清最终稀释度

　　1/10

　　1/20

　　1/40

　　1/80

　　1/160

　　1/320

　　1/640

　　1/1 280

　　1/2 560

　　2

　　GB/T 14926 . 46—2008

　　6 . 1 . 2 . 2 . 1 待检血清灭活：将待检血清以 56 ℃水浴灭活 30 min后备用 。

　　6 . 1 . 2 . 2 . 2 取 96 孔 板，第 1 孔 加 入 生 理 盐 水 0 . 16 mL , 以 后 每 孔 加 入 生 理 盐 水 0 . 1 mL , 一 直 加 到第 9 孔 。

　　6 . 1 . 2 . 2 . 3 在第 1 孔中加入血清 0 . 04 mL,混匀后，吸取 0 . 1 mL 到第 2 孔，如此类推，直到第 9 孔，弃去 0 . 1 mL 。

　　6 . 1 . 2 . 3 对照

　　另标明 10 、11 、12 孔，第 10 孔加入阴性血清 0 . 1 mL , 第 11 孔加入阳性血清 0 . 1 mL , 第 12 孔加入生理盐水 0 . 1 mL 。

　　6 . 1 . 2 . 4 加入抗原

　　将各孔加入标准抗原 0 . 1 mL,混匀，此时各孔血清稀释度为 1 ∶ 10 , 1 ∶ 20 , 1 ∶ 40 , 1 ∶ 80 , 1 ∶ 160 , 1 ∶ 320 , 1 ∶ 640 , 1 ∶ 1 280 , 1 ∶ 2 560 。具体操作见表 1 。置 37 ℃温箱 2 h ,取出后摇匀，用接种环挑取各孔中的反应物置于载玻片上，在暗视野下观察结果 。

　　6 . 1 . 2 . 5 结果判定

　　结果判定如下：

　　a) ++++：几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残片，仅有少数游离的钩端螺旋体;

　　b) +++:75%的钩端螺旋体被凝集，大部分呈块状或蜘蛛状，尚有 25%菌体游离;

　　c) ++:50%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有 50%菌体游离;

　　d) + : 25%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有 75%菌体游离;

　　e) - ：全部菌体正常，分散，无凝集块，菌数与对照相同 。

　　待检血清凝集效价在 1 ∶ 20 达到“++ ”或以上时，均判为阳性反应 。

　　6 . 2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

　　6 . 2 . 1 包被抗原

　　根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释 。每孔 100 μL,置 37 ℃ 1 h 后再 4 ℃过夜 。

　　6 . 2 . 2 用洗涤液洗 3 次，每次 5 min,叩干 。

　　6 . 2 . 3 加样

　　待检血清和阴性 、阳性血清分别用稀释液做 1 ∶ 160 稀释，每孔 100 μL , 37 ℃ 1 h ,洗涤同上 。

　　6 . 2 . 4 加酶结合物

　　用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入 100 μL , 37 ℃ 1 h ,洗涤同上 。

　　6 . 2 . 5 加底物溶液

　　每孔加入新配制的底物溶液 100 μL,置 37 ℃ ,避光显色 10 min ~ 15 min 。

　　6 . 2 . 6 终止反应

　　每孔加入终止液 50 μL 。

　　6 . 2 . 7 测 A值

　　在酶标仪上，于 490 nm处读出各孔 A值 。

　　6 . 2 . 8 结果判定

　　在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定 。

　　6 . 2 . 8 . 1 同时符合下列 2 个条件者，判为阳性：

　　a) 待检血清的 A值大于等于 0 . 2 ;

　　b) 待检血清的 A值/阴性对照血清的 A值大于等于 2 . 1 。

　　6 . 2 . 8 . 2 均不符合上述 2 个条件者，判为阴性 。

　　6 . 2 . 8 . 3 仅有 1 条符合者，判为可疑，需重试 。如仍为阳性则判为阳性 。

　　6 . 2 . 8 . 4 对阳性结果需重试，如仍为阳性则判为阳性 。

　　GB/T 14926 . 46—2008

　　GB/T 1 4 92 6 . 4 6 2 0 0 8

　　—

　　7 结果判定

　　7 . 1 基础级犬

　　如接种疫苗后，经 ELISA 检测抗体效 价 大 于 等 于 1 ∶ 160 , 或 显 微 镜 凝 集 检 测 抗 体 效 价 大 于 等 于1 ∶ 20 判为合格 。被检动物免疫抗体合格率大于等于 70%可判为该犬群免疫合格 。

　　免疫抗体合格率=(被检动物抗体阳性数/被检动物总数)× 100%

　　7 . 2 SPF级犬

　　不应进行疫苗接种，或未进行免疫的基础级犬，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试 。如仍为阳性则判为阳性 。

　　8 结果报告

　　根据判定结果，作出报告 。

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