GB/T 14926.21-2008 实验动物 兔出血症病毒检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 14926 . 21—2008代替 GB/T 14926 . 21—2001

　　实验动物 兔出血症病毒检测方法

　　Laboratory animal—Method forexamination ofRabbit

　　hemorrhagicdiseasevirus(RHDV)

　　2008-12-10 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　中 华 人 民 共 和 国

　　国 家 标 准

　　实验动物 兔出血症病毒检测方法

　　GB/T 14926 . 21—2008

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　　中 国 标 准 出 版 社 出 版 发 行

　　北京复兴门外三里河北街 16 号

　　邮政编码：100045

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　　各地新华书店经销

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　　开本 880 × 1230 1/16 印张 0 . 5 字数 9 千字

　　2009 年 2 月第一版 2009 年 2 月第一次印刷

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　　书号：155066 ·1-35766

　　如有印装差错 由本社发行中心调换

　　版权专有 侵权必究

　　举报电话：(010)68533533

　　GB/T 14926 . 21—2008

　　前 言

　　GB/T 14926《实验动物》共 54 个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法 。

　　本部分自实施之日起代替 GB/T 14926 . 21—2001《实验动物 兔出血症病毒检测方法》。

　　本部分与 GB/T 14926 . 21—2001 相比主要技术差异如下：

　　a) 增加兔出血症病毒核酸(RHDV)核酸检测方法;

　　b) 确定兔免疫接种 RHDV疫苗后的血清抗体合格判定标准 。

　　本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归 口 。

　　本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会 。

　　本部分主要起草人：贺争鸣 、付瑞 、田克恭 。

　　本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 14926 . 21—1994 , GB/T 14926 . 21—2001 。

　　Ⅰ

　　GB/T 14926 . 21—2008

　　实验动物 兔出血症病毒检测方法

　　1 范围

　　GB/T 14926 的本部分规定了兔出血症病毒(RHDV)的检测方法 。

　　本部分适用于兔 RHDV抗原 、抗体和病毒核酸的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过 GB/T 14926 的本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本 适 用 于 本部分 。

　　GB/T 14926 . 53 实验动物 血凝试验

　　GB/T 14926 . 54 实验动物 血凝抑制试验

　　3 原理

　　血凝试验(HA) ：在一定条件下，RHDV 能凝集人 “O ”型红细胞，产生可见的凝集反应 。 根据这 一特性检测兔肝组织中有无 RHDV抗原 。

　　血凝抑制试验(HAI) ：在一定条件下，RHDV凝集人“O”型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制 。根据这一特性检测兔血清中有无 RHDV抗体 。

　　核酸检测：根据 RHDV VP60 基因序列保守的特点，设计特异引物，扩增 目 的片段，检测兔组织中的 RHDV 核酸 。

　　4 主要试剂与器材

　　4 . 1 试剂

　　4 . 1 . 1 血凝素

　　人工感染或 自 然 发 病 的 兔 肝 组 织，经 研 磨 制 成 10% 悬 液，3 000 r/min 离 心 10 min 而 获 得 的 上清液 。

　　4 . 1 . 2 阳性血清

　　RHDV抗原免疫或 RHDV 自然感染恢复后的兔血清 。

　　4 . 1 . 3 阴性血清

　　无 RHDV感染 、未经免疫的兔血清 。

　　4 . 1 . 4 人“O”型红细胞 。

　　4 . 1 . 5 缓冲液与溶液

　　4 . 1 . 5 . 1 PBS(pH7 . 4)

　　NaCl 8 g

　　KCl 0 . 2 g

　　Na2 HPO4 ·12H2 O 2 . 83 g

　　KH2 PO4 0 . 2 g

　　去离子水 1 000 mL

　　4 . 1 . 5 . 2 TRIzol Reagent 。

　　1

　　GB/T 14926 . 21—2008

　　4 . 1 . 5 . 3 50 × TAE Buffer(pH8 . 5)

　　Tris 242 g

　　醋酸 57 . 1 mL

　　Na2 EDTA ·2H2 O 37 . 2 g

　　去离子水 1 000 mL

　　4 . 1 . 5 . 4 溴乙锭(10 mg/mL) 。

　　4 . 1 . 5 . 5 6×Loding Buffer 。

　　4 . 1 . 5 . 6 氨苄青霉素(100 mg/mL) 。

　　4 . 1 . 5 . 7 三氯甲烷(分析纯)。

　　4 . 1 . 5 . 8 乙醇(分析纯)。

　　4 . 1 . 5 . 9 异丙醇(分析纯)。

　　4 . 1 . 6 酶与缓冲液

　　4 . 1 . 6 . 1 5 × AMV RT Buffer , AMV RTase(10 U/μL) 。

　　4 . 1 . 6 . 2 RNase inhibitor(40 U/μL) 。

　　4 . 1 . 6 . 3 DEPC-H2 O 。

　　4 . 1 . 6 . 4 随机引物 9mers(500 μg/mL) 。

　　4 . 1 . 6 . 5 dNTP mixture(2 . 5 mmol/L each) 。

　　4 . 1 . 6 . 6 MgCl2 (25 mmol/L) , 10 × PCR Buffer, Taq DNA polymerase(5 U/μL) 。

　　4 . 1 . 7 培养基

　　4 . 1 . 7 . 1 LB 培养基

　　tryptone 10 g

　　yeast extract 5 g

　　NaCl 10 g

　　去离子水 1 000 mL

　　4 . 1 . 7 . 2 LB/Amp

　　tryptone 10 g

　　yeast extract 5 g

　　NaCl 10 g

　　ampicillin 100 μg/mL

　　去离子水 1 000 mL

　　4 . 1 . 8 琼脂糖凝胶 Agarose L03 。

　　4 . 1 . 9 感受态细胞与载体

　　4 . 1 . 9 . 1 适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞 。

　　4 . 1 . 9 . 2 DNA 片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒 。

　　4 . 1 . 9 . 3 可用于连接 PCR产物的商品化 T 载体 。

　　4 . 1 . 9 . 4 质粒小量提取试剂盒 。

　　4 . 2 器材

　　4 . 2 . 1 微量振荡器 。

　　4 . 2 . 2 微量血凝反应板(U 型或 V 型)。

　　4 . 2 . 3 微量加样器(容量 0 . 5 μL ~ 10 μL , 10 μL ~ 100 μL , 20 μL ~ 200 μL , 100 μL ~ 1 000 μL) 。

　　4 . 2 . 4 生物安全柜 。

　　4 . 2 . 5 冷冻离心机 。

　　4 . 2 . 6 紫外分光光度仪 。

　　2

　　GB/T 14926 . 21—2008

　　4 . 2 . 7 PCR仪 。

　　4 . 2 . 8 电泳仪 。

　　4 . 2 . 9 紫外透射仪 。

　　4 . 2 . 10 恒温培养箱 。

　　4 . 2 . 1 1 恒温摇床 。

　　4 . 2 . 12 恒温水浴箱 。

　　4 . 2 . 13 超纯水系统 。

　　4 . 2 . 14 冰箱 。

　　5 操作步骤

　　5 . 1 采用 HA方法(见 GB/T 14926 . 53)进行病毒抗原检测 。

　　5 . 2 采用 HAI 方法(见 GB/T 14926 . 54)进行病毒抗体检测 。

　　5 . 3 病毒核酸检测

　　5 . 3 . 1 引物设计

　　根据 RHDV FDR株序列(GenBank 登录号：NC_001543) ,针对 VP60 基因区段设计引物 。 引物在RHDV基因组中的位置 、核苷酸组成及预期扩增 目 的基因长度见表 1 。

　　表 1 RT-PCR引物

　　引物

　　位置

　　序列

　　产物大小

　　正向引物 P1

　　nt 6254-nt 6271

　　5 ’-ATGCCAATGCTGGGTCTG-3 ’

　　368bp

　　反向引物 P2

　　nt 6621 -nt 6602

　　5 ’-TTGAGGCGTGTATGTGATGG-3 ’

　　—

　　5 . 3 . 2 RNA 提取

　　5 . 3 . 2 . 1 在生物安全柜内，取 RHDV 感染的兔肝组织 50 mg ~ 100 mg,置 于 灭 菌 玻 璃 研 磨 器 中，加1 mL灭菌 PBS(pH 7 . 4)充分研磨 。

　　5 . 3 . 2 . 2 将 肝 组 织 匀 浆 转 移 至 1 . 5 mL 洁 净 离 心 管 中，加 入 1 mL TRIzol Reagent ,混 匀，室 温 放 置10 min 。

　　5 . 3 . 2 . 3 加 0 . 2 mL 三氯甲烷，充分混匀 10 s,室温放置 10 min , 4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min 。

　　5 . 3 . 2 . 4 取上清，加等体积异丙醇，室温 20 min , 4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min 。

　　5 . 3 . 2 . 5 弃上清，沉淀以 1 mL 75%乙醇(现用现配)洗涤后，室温干燥至 RNA呈透明膜状 。

　　5 . 3 . 2 . 6 加 40μL DEPC-H2 O 溶解 RNA(沉淀)，紫外分光光度仪测定所提取的 RNA,立即进行反转录(RT)或 -70℃保存 。

　　警告：DEPC对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴口罩，不小心沾到手上应立即冲洗 。

　　5 . 3 . 3 反转录(RT)

　　5 . 3 . 3 . 1 RT反应体系为 25 μL , 依次加入如下成分：5 μL 5 × AMV RT Buffer , 5 μL dNTP mixture (2 . 5 mmol/L each) , 1 μL 随机引物(500 μg/mL) , 0 . 5 μL RNase inhibitor(40 U/μL) , 12 . 5 μL RNA模版，1 μL AMV RTase(10 U/μL) 。

　　5 . 3 . 3 . 2 反转录反应条件为：37 ℃ 90 min , 95 ℃ 5 min,所得 cDNA 可用作 PCR 反应模板 。

　　5 . 3 . 3 . 3 每次进行 RT 时均设标准阳性 、阴性及空白对照 。

　　5 . 3 . 4 RT-PCR

　　5 . 3 . 4 . 1 PCR反应体系为 50 μL , 依次加入如下成分：5 μL 10 × PCR Buffer , 2 μL MgCl2 (25 mmol/L) , 2 μL dNTP mixture , 1 μL 正 向 引 物 P1 ( 50 pmol/L) , 1 μL 反 向 引 物 P2 ( 50 pmol/L) , 2 μL cDNA , 0 . 5 μL TaqDNA polymerase(5 U/μL) , 36 . 5 μL ddH2 O 。

　　GB/T 14926 . 21—2008

　　GB/T 1 4 92 6 2 1 2 0 0 8

　　—

　　.

　　5 . 3 . 4 . 2 PCR 反应参数为：95 ℃预变性 5 min ; 94 ℃ 1 min , 59 ℃ 1 min , 72 ℃ 1 min, 共 30 次循环;最后一次循环后 72 ℃再延伸 10 min 。

　　5 . 3 . 4 . 3 每次进行 RT-PCR 时均设标准阳性 、阴性及空白对照 。

　　5 . 3 . 5 琼脂糖凝胶电泳

　　5 . 3 . 5 . 1 配制 2%琼脂糖凝胶(含 0 . 5 μg / mL溴化乙锭)。

　　5 . 3 . 5 . 2 取 PCR 扩增产物 8 μL,分别与 2 μL 的 6×载样缓冲液混匀，加到凝胶孔格中 。

　　5 . 3 . 5 . 3 电泳缓冲液为 1×TAE缓冲液，电泳条件为 100 V恒压电泳 30 min ~ 60 min,紫外透射仪下观察结果 。

　　5 . 3 . 6 RHDV基因的克隆 、鉴定及序列测定

　　5 . 3 . 6 . 1 RHDV RT-PCR 和 RT-nested PCR 产物经 2 . 0%琼脂糖凝胶电泳后，用洁净锋利的手术刀切下 目 的条带，用 Wizard PCR Preps DNA Purification System 回收纯化，取 1 μL 电泳检测 。

　　5 . 3 . 6 . 2 10 μL 的连接反应体系中依次加入下列成分：5 μL 2 × Rapid Ligation Buffer, pGEM-T Easy Vector 1 μL,回收纯化的 PCR 目 的片段 3 μL , 1 μL T4 DNA Ligase 。 连接反应条件为：室温 1 h , 4 ℃ 12 h 。

　　5 . 3 . 6 . 3 取 5 μL 连接产物转化 E.coliDH 5 α 感受态细胞，然后将转化的菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的 LB平 板 上，37 ℃培 养 过 夜 。 挑 取 光 滑 、圆 整 的 白 色 菌 落，接 种 于 含 氨 苄 青 霉 素(100 μg/mL)的 LB液体培养基，37 ℃ 200 r / min摇振培养 6 h ,然后用质粒小量提取试剂盒制备质粒DNA供限制性酶切分析，并进行 PCR 鉴定 。

　　5 . 3 . 6 . 4 将筛选到的阳性克隆分别送检测单位，以 T7 和 SP6 通用引物，用 ABI测序仪进行序列测定 。测序结果经计算机软件分析与 GenBank 中相关序列进行同源性比较 。

　　6 结果判定

　　6 . 1 HA

　　经研磨制 成 10% 的 兔 肝 上 清 液，HA 滴 度 小 于 等 于 1 ∶ 16 判 为 阴 性 。 对 阳 性 ( HA 滴 度 大 于1 ∶ 16)检测结果，选用同一种方法重试，如仍为阳性则判为阳性 。

　　6 . 2 HAI

　　6 . 2 . 1 基础级兔：如接种疫苗，HAI抗体效价大于 1 ∶ 10 ,同时免疫抗体合格率[(被检动物抗体阳性数/被检动物总数)×100%]大于等于 70%判定该兔群免疫合格 。

　　6 . 2 . 2 清洁级 兔 、SPF 兔：HAI 抗 体 效 价 小 于 等 于 1 ∶ 10 判 为 阴 性;对 阳 性 ( HAI 抗 体 效 价 大 于1 ∶ 10)检测结果，选用同一种方法重试，如为阳性则判为阳性 。

　　6 . 3 RT-PCR

　　每个样本均进行两次试验检测，以标准 Marker及阳性对照为基准，在 368 bp 处见到电泳条带并测序结果正确者为阳性 。

　　7 结果报告

　　根据判定结果，作出报告 。

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