GB/T 14926.10-2008 实验动物 泰泽病原体检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 14926 . 10—2008代替 GB/T 14926 . 10—2001

　　实验动物 泰泽病原体检测方法

　　Laboratory animal—Method forexamination ofTyzzer’s organism

　　2008-12-03 发布 2009-03-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 14926 . 10—2008

　　前 言

　　GB/T 14926《实验动物》共 54 个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法 。

　　本部分自实施之日起代替 GB/T 14926 . 10—2001《实验动物 泰泽病原体检测方法》。

　　本部分与 GB/T 14926 . 10—2001 相比主要技术差异如下：

　　a) 删除了可的松激发试验;

　　b) 修改了两种血清学方法 。

　　本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归 口 。

　　本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会 。

　　本部分主要起草人：李红 。

　　本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 14926 . 10—1994 , GB/T 14926 . 10—2001 。

　　Ⅰ

　　GB/T 14926 . 10—2008

　　实验动物 泰泽病原体检测方法

　　1 范围

　　GB/T 14926 的本部分规定了实验动物泰泽病原体的检测方法 。

　　本部分适用于小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠和兔泰泽病原体的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过 GB/T 14926 的本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本 适 用 于 本部分 。

　　GB/T 14926 . 50 实验动物 酶联免疫吸附试验

　　GB/T 14926 . 52 实验动物 免疫荧光试验

　　3 原理

　　动物感染泰泽病原体后血清中可产生相应的抗体 。依据免疫学原理，采用泰泽病原体抗原检测小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠和兔血清中相应的抗体 。

　　4 主要设备和材料

　　4 . 1 普通恒温培养箱 。

　　4 . 2 荧光显微镜 。

　　4 . 3 生物显微镜 。

　　4 . 4 酶标仪 。

　　4 . 5 组织研磨器 。

　　4 . 6 聚苯乙烯板，40 孔 、55 孔或 96 孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，紫外光照射 1 h 。

　　4 . 7 微量加样器，容量 5 μL ~ 50 μL、50 μL ~ 200 μL 。

　　4 . 8 印有 10 个 ~ 40 个小孔的载玻片 。

　　4 . 9 盖玻片 。

　　4 . 10 超低温冰箱或液氮罐 。

　　5 培养基和试剂

　　5 . 1 ELISA抗原

　　5 . 1 . 1 泰泽病原体抗原

　　受泰泽病原体感染的 、带有严重坏死灶的动物肝脏按 1 ∶ 10 加入 PBS 后在冰浴中用组织研磨器制成匀浆，3 600 r/min离心，取上清液作抗原 。

　　5 . 1 . 2 阴性对照抗原

　　未受泰泽病原体感染的动物肝脏，按 5 . 1 . 1 的方法制成 。

　　5 . 2 抗原片

　　5 . 2 . 1 抗原

　　受泰泽病原体感染的 、带有严重坏死灶的动物肝组织用 PBS 按 1 ∶ 10 在冰浴中制成匀浆，调整浓

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　　GB/T 14926 . 10—2008

　　度至每个显微镜油镜视野有适当的菌量，即细菌 、肝细胞 、细胞碎片完全铺开，不重叠 。泰泽病原体自溶现象严重，应尽快完成该过程 。

　　5 . 2 . 2 抗原片制备

　　将上述抗原液适量滴于玻片孔中，室温干燥后，冷丙酮(4 ℃) 固定 10 min 。PBS 漂洗后充分干燥，置于 -20 ℃备用 。

　　5 . 3 酶结合物

　　辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠 IgG 抗体，用于检测相应动物的抗体;辣根过氧化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 抗 体，用 于 检 测 兔 血 清 抗 体;辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 葡 萄 球 菌 蛋 白 A (SPA) ,用于检测大鼠血清以外的动物血清抗体 。

　　5 . 4 荧光结合物

　　荧光标记的羊或兔抗小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠 IgG 抗体用于检测相应动物的血清抗体;荧光标记的羊抗兔 IgG抗体，用于检测兔血清抗体 。

　　5 . 5 阳性血清

　　上述抗原免疫清洁级或 SPF级小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠或无泰泽病原体感染的兔获得的抗血清 。

　　5 . 6 阴性血清

　　清洁级或 SPF级小鼠 、大鼠 、豚鼠 、地鼠血清;或无泰泽病原体感染的兔血清 。

　　5 . 7 50%甘油 PBS 。

　　5 . 8 其他试剂溶液的配制见 GB/T 14926 . 50 和 GB/T 14926 . 52 。

　　6 检测方法

　　6 . 1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

　　6 . 1 . 1 包被抗原

　　根据 滴 定 的 最 适 工 作 浓 度，将 两 种 抗 原 分 别 用 包 被 液 稀 释，两 种 抗 原 隔 行 包 被，每 孔 包 被 抗 原

　　100 μL,置 37 ℃ 1 h后在 4 ℃过夜 。

　　6 . 1 . 2 用洗涤液洗 3 次，每次 5 min,叩干 。

　　6 . 1 . 3 加样

　　待检血清用稀释液做 1 ∶ 40 稀释，分别加入两孔(泰泽病原体抗原孔和阴性对照抗原孔)，每一抗原板至少设置两份阳性血清和阴性血清对照 。每孔加入稀释后的待检血清 、对照血清 100 μL , 37 ℃ 1 h ,洗涤同上 。

　　6 . 1 . 4 加酶结合物

　　用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔 100 μL , 37 ℃ 1 h ,洗涤同上 。

　　6 . 1 . 5 加底物溶液

　　每孔加入新配制的底物溶液 100 μL,置 37 ℃ ,避光显色 10 min ~ 15 min 。

　　6 . 1 . 6 终止反应

　　每孔加入终止液 100 μL 。

　　6 . 1 . 7 测 A值

　　在酶标仪上，于 490 nm处读出各孔 A值 。

　　6 . 1 . 8 结果判定

　　在阴性和阳性对照成立的情况下，进行结果判定 。

　　6 . 1 . 8 . 1 同时符合下列 3 个条件者，判为阳性 。对阳性结果需重试，如仍为阳性则判为阳性：

　　a) 待检血清与阴性对照抗原和泰泽病原体抗原反应有明显的颜色区别;

　　b) 待检血清与泰泽病原体抗原反应的 A值大于等于 0 . 2 ;

　　c) 待检血清与泰泽病原体抗原反应的 A值/阴性对照血清与泰泽病原体抗原反应的 A值大于等于 2 . 1 。

　　2

　　GB/T 14926 . 10—2008

　　6 . 1 . 8 . 2 均不符合上述 3 个条件者，判为阴性 。

　　6 . 1 . 8 . 3 仅有 1 条 ~ 2 条符合者，判为可疑，需重试 。

　　6 . 2 免疫荧光试验(IFA)

　　6 . 2 . 1 取出抗原片，室温干燥后，将适当稀释的待检血清(推荐 1 ∶ 10) 和阴性 、阳性血清分别滴于抗原片上，每张玻片上应分别有阳性和阴性血清各 1 孔，置湿盒内，37 ℃ 30 min ~ 45 min 。

　　6 . 2 . 2 PBS洗 3 次，每次 5 min,室温干燥 。

　　6 . 2 . 3 取适当的荧光结合物，滴加于抗原片上，置湿盒内，37 ℃ 30 min ~ 45 min 。

　　6 . 2 . 4 PBS洗 3 次，每次 5 min 。

　　6 . 2 . 5 玻片用蒸馏水漂洗 1 次 。

　　6 . 2 . 6 50%甘油 PBS封片，荧光显微镜下观察结果 。

　　6 . 2 . 7 结果判定：阳性血清孔菌体呈强的荧光着色，而阴性对照无荧光或仅有微弱非特异荧光时进行结果判定 。待检血清孔较阴性血清孔菌体荧光着色强，即可判断为阳性反应 。

　　7 结果报告

　　对血清抗体阳性者作血清抗体检测阳性报告，否则作阴性报告 。

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　　实验动物 泰泽病原体检测方法

　　GB/T 14926 . 10—2008

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　　2009 年 2 月第一版 2009 年 2 月第一次印刷

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