GB/T 11446.10-2013 电子级水中细菌总数的滤膜培养测试方法

　　ICS 31-030 L 90

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 11446. 10—2013代替 GB/T 11446. 10—1997

　　电子级水中细菌总数的

　　滤膜培养测试方法

　　Testmethod fortotalbacterialcountin

　　electronicgradewaterby membrane filters

　　2013-12-31发布 2014-08-15实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 11446. 10—2013

　　前 言

　　GB/T 11446预计结构如下 :

　　—GB/T 11446. 1 电子级水 ;

　　—GB/T 11446. 2 (待定) ;

　　—GB/T 11446. 3 电子级水测试方法通则 ;

　　—GB/T 11446. 4 电子级水电阻率的测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 5 电子级水中痕量金属的原子吸收分光光度测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 6 电子级水中二氧化硅的分光光度测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 7 电子级水中痕量阴离子的离子色谱测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 8 电子级水中总有机碳的测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 9 电子级水中微粒的仪器测试方法 ;

　　—GB/T 11446. 10 电子级水中细菌总数的滤膜培养测试方法 。

　　本部分为 GB/T 11446的第 10部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009 给出的规则起草 。

　　本部分代替 GB/T 11446. 10—1997《电子级水中细菌总数的滤膜培养测试方法》。

　　本部分与 GB/T 11446. 10—1997相比 ,主要有下列变化 :

　　—“3 术语和定义 ”中去掉了 “无菌操作 ”定义 ,增加了 “细菌总数 ”和 “培养基 ”定义(见第 3 章) ;

　　— 增加了“5 干扰因素 ”(见第 5 章) ;

　　— 删除了“10 注意事项 ”(见 1997年版的第 10章) 。

　　本部分由中华人民共和国工业和信息化部提出 。

　　本部分由中国电子技术标准化研究院归 口 。

　　本部分起草单位 :信息产业部专用材料质量监督检验中心 、中国科学院半导体研究所 、中国电子技术标准化研究院 、中国电子科技集团公司第四十六研究所 。

　　本部分主要起草人 :王奕 、褚连青 、何秀坤 、段曙光 、提刘旺 、刘筠 。

　　本部分所代替标准的历次版本发布情况为 :

　　—GB/T 11446. 10—1989、GB/T 11446. 10—1997。

　　Ⅰ

　　GB/T 11446. 10—2013

　　电子级水中细菌总数的

　　滤膜培养测试方法

　　1 范围

　　GB/T 11446的本部分规定了电子级水中细菌总数(活菌)的滤膜培养测试方法 。

　　本部分适用于 EW-Ⅰ ~EW-Ⅳ级电子级水中细菌总数的测定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 11446. 1—2013 电子级水

　　GB/T 11446. 3—2013 电子级水测试方法通则

　　3 术语和定义

　　GB/T 11446. 3—2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　菌落 bacterium colony

　　将单个菌体或孢子在固体培养基上培养一定时间后 ,使其生长繁殖形成肉眼可见的微生物团 , 即为菌落 。

　　3.2

　　细菌培养法 bacterium culturemethod

　　将一定量水样经超滤膜过滤 ,再用适当的培养基将留在超滤膜表面的细菌培养以形成菌落 ,然后计数以测量水中活细菌的数量 。

　　3.3

　　细菌总数 totalbacterialcount

　　单位体积样品中存在的有生存能力的微生物总数 ,不包括厌氧有机体 。

　　3.4

　　培养基 medium

　　是提供食用菌等生物生长发育所需的营养与特定环境条件的基质 ,一般都含有碳水化合物 、含氮物质 、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等 。

　　4 方法原理

　　水中的细菌经过 0. 45 μm 微孔膜 过 滤 截 留 于 滤 膜 上 , 将 滤 膜 贴 在 衬 底(吸 透 了 TGY 培 养 基 的 滤纸)上 ,在适宜的条件下进行培养 ,细菌繁殖成肉眼可见的菌落 。 细菌体内存在的脱氢酶 , 与 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(简称 T. T. C)在胞内反应使菌体呈红色 ,反差增大 ,借此观测及计数 。

　　1

　　GB/T 11446. 10—2013

　　5 干扰因素

　　5. 1 外来微生物的污染影响分析结果 ,细菌分析时应特别注意 。

　　5.2 将载菌膜置于培养基上时 , 中间如有间隙或气泡影响分析结果的现象应严格避免 。

　　6 试剂

　　6. 1 空白用水 : GB/T 11446. 1—2013规定的 EW-Ⅰ 级电子级水于高压灭菌器内在 1. 4× 105 Pa压力下 ,灭菌 15 min。

　　6.2 TGY培养 基 : 1L 空 白 用 水 中 加 入 10. 0 g 胰 蛋 白 胨(B. R) 、6. 0 g 牛 肉 膏(B. R) 和 2. 0 g 葡 萄 糖(A. R) ,加热溶解 ,冷却至室温 , 以 1 mol/L氢氧化钠调节 pH 至 7. 4~ 7. 6,再加 15. 0 g琼脂 ,加热溶解并趁热过滤(以四层纱布 、一层脱脂棉为介质) ,装于 300 mL三角瓶中 ,灭菌后备用 。

　　注 : 在制备培养基的加热过程中 ,需补充所损失的水分 。

　　6.3 1 mol/L氢氧化钠溶液 :20g氢氧化钠(A. R)溶于 500 mL空白用水并储于聚乙烯瓶中 。

　　6.4 T. T. C溶液 1. 0 g/L灭菌备用 。

　　7 测量仪器和设备

　　7. 1 无菌室(或无菌工作台) :备有功率大于或等于 2 W/m2 的紫外灯 ,置于工作台上距离工作台面1.5 m处。

　　7.2 电热恒温培养箱 : (20 ℃ ~ 60 ℃) ±1 ℃ 。

　　7.3 高压蒸汽灭菌器 。

　　7.4 恒温箱 :0 ℃ ~ 300 ℃ 。

　　7.5 体视显微镜 。

　　7.6 微孔有机滤膜:ϕ50 mm ,孔径 0. 45 μm 格栅膜 。

　　7.7 过滤器:ϕ50 mm 杯式不锈钢过滤器 。

　　7. 8 各种玻璃器皿 :广口瓶 、三角瓶 、培养皿 、量筒等 。

　　7.9 酒精灯 、平头镊子 、纱布 、棉花 、定性滤纸等 。

　　7. 10 抽滤系统 :如图 1所示 。

　　说明 :

　　1— 滤杯 ;

　　2— 滤膜 ;

　　3— 载膜网 ;

　　4— 抽滤瓶 ;

　　5— 缓冲瓶 ;

　　6— 真空泵 。

　　图 1 抽滤系统示意图

　　2

　　GB/T 11446. 10—2013

　　8 操作步骤

　　8. 1 检测前的准备

　　8. 1. 1 开启无菌室或无菌工作台 1 h~ 2 h后 ,使之进入稳定工作状态 。

　　8. 1.2 器皿的灭菌 :将培养皿 、取样瓶等玻璃器皿 ,先用电子级水 EW-Ⅰ 级水洗净 、烘干 ,用纸包严后置于铝制专用容器中放入恒温箱(160 ℃ ~ 165 ℃)内 ,干热灭菌 2 h。

　　8. 1.3 有机滤膜的灭菌 :于电子级水中煮沸 15 min,弃去沸水后 ,再加新的水煮沸 ,反复进行 3 次即可 。或在紫外灯下照 1 h~ 2 h灭菌 。

　　注 : 灭菌时注意安全 。

　　8.2 水样测定

　　取 2. 0 mLT. T. C溶液滴于 100 mL温度为 46 ℃ ±1 ℃的培养基中 ,在培养皿中混匀(约 3 mm~ 4 mm厚) ,冷却备用 。取摇匀 后 的 适 量 水 样 : EW-Ⅰ ~ EW-Ⅲ级 水 取 20 mL~ 100 mL, EW-Ⅳ级 水 取1 mL,经过过滤装置过滤 ,用 50 mL空白用水冲洗 ,抽干 。用镊子将滤膜置于备好的培养基上 ,膜面朝上 ,盖好皿盖 ;待凝固后 ,将平皿翻转置于培养箱中 , 于 37 ℃ ± 1 ℃下恒温培养 48 h 后取出 ,在体视显微镜下观察菌落并计数 。按同样步骤进行空白试验 。每个样品平行进行 3 次测定 ,取其平均值 。

　　9 测量结果计算

　　水中的细菌总数按式(1)计算 :

　　A ……………………( 1 )

　　式中 :

　　A — 每毫升水样中细菌总数 ,单位为个每毫升(个/mL) ;

　　n — 滤膜上的菌落数 ,单位为个 ;

　　n0 — 空白试验的菌落数 ,单位为个 ;

　　V — 被测水样的体积 ,单位为毫升(mL) 。

　　10 报告

　　测试报告应按 GB/T 11446. 3—2013给定格式进行编制 。

　　GB T 11446 10 2013

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　　滤膜培养测试方法

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　　2014年 4 月第一版

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