GB/T 41712-2022 脱氧核糖核酸酶I 酶活及杂质检测方法

　　ICS 07 . 080 CCS C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 41712—2022

　　脱氧核糖核酸酶 I 酶活及杂质检测方法

　　Assay method of deoxyribonuclease I activity and impurity

　　2022-10-12 发布 2023-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 41712—2022

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 试剂或材料 1

　　5 仪器设备 2

　　6 试验步骤 2

　　7 质量控制 5

　　I

　　GB/T 41712—2022

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)提出并归口 。

　　本文件起草单位:福建南生科技有限公司 、夏禾(深圳)生物技术有限公司 、深圳市中鼎检测技术有限公司 、苏州坤琪生物科技有限公司 、蚌埠产品质量监督检验研究院 、南京诺唯赞生物科技股份有限公司 、西安国联质量检测技术有限公司 、福建华灿制药有限公司 、上海鹰姿生命科技有限公司 、雷谷(厦门)生物医药有限公司 、北京中天标科标准化技术研究院有限公司 、复旦大学 、厦门致善生物科技股份有限公司 、山东大学 、安琪酵母股份有限公司 、上海楚豫生物科技有限公司 、武汉科技大学 、中国计量科学研究院计量与分析科学研究所 、厦门艾德生物医药科技股份有限公司 。

　　本文件主要起草人:黄发灿 、郑登忠 、阚广磊 、赵毅 、郭庆 、王翠 、周高怀 、钟江 、朱力 、陈秀兰 、姚鹃 、宋娜杰 、全灿 、许文来 、邢志刚 、杨忠华 、李超 。

　　Ⅲ

　　GB/T 41712—2022

　　Ⅳ

　　引

　　

　　言

　　脱氧核糖核酸酶 I (DNase I, EC3 . 1 . 21 . 1)是最有代表性的核酸内切酶,降解单链和双链 DNA,产生具有 5 I -磷酸末端的分解物,在一般条件下其分解产物含有单核苷酸或 8 个 ~ 12 个碱基的寡核苷酸,平均大小约 4 个核苷酸 。制定脱氧核糖核酸酶 I 国家标准,用以推动该类工具酶的产业化,对于脱氧核糖核酸酶 I 的生产和使用具有重要意义 。

　　GB/T 41712—2022

　　脱氧核糖核酸酶 I 酶活及杂质检测方法

　　1 范围

　　本文件描述了脱氧核糖核酸酶 I 酶活及杂质的检测方法 。

　　本文件适用于脱氧核糖核酸酶 I 酶活及杂质的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 , 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3.1

　　脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease

　　水解脱氧核糖核酸(DNA)中磷酸二酯键 , 生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶 。

　　3.2

　　脱氧核糖核酸酶 I deoxyribonuclease I

　　水解单链和双链 DNA, 产生具有 5 I -磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸(8 个 ~12 个碱基)的核酸内切酶 。

　　3.3

　　脱氧核糖核酸酶 I 活力单位 activity unit of deoxyribonuclease I

　　以小牛胸腺 DNA为底物 , 在 25 ℃ 、PH 5 . 0 的溶液中 , 在 260 nm 处每毫升每分钟变化 0. 001 吸光度值为一个酶活性单位(kunitz unit) 。

　　3.4

　　杂质 impurity

　　影响底物的其他核酸内切酶或核酸外切酶 。

　　4 试剂或材料

　　4 . 1 水

　　符合 GB/T 6882 规定的二级水 。

　　4 . 2 1 mol/L醋酸钠缓冲液

　　精密称取 8. 2 g 无水乙酸钠 , 溶于水中 , 用 5 mol/L Hcl , 调至 PH5 . 0 , 混匀后 , 定容至 100 mL。

　　1

　　GB/T 41712—2022

　　4 . 3 0 . 1 mol/L硫酸镁溶液

　　精密称取 1 . 2 g 无水硫酸镁 , 溶于水中 , 混匀后 , 定容至 100 mL。

　　4 . 4 0 . 85%氯化钠溶液

　　精密称取 0. 85 g 氯化钠 , 溶于水中 , 混匀后 , 定容至 100 mL。

　　4 . 5 小牛胸腺 DNA溶液

　　精密称取 33 mg 小牛胸腺 DNA, 用冷水定容至 100 mL, 置 4 ℃过夜溶解。 4 . 6 0 . 1%酵母 RNA溶液

　　精密称取 0. 1 g 酵母 RNA, 用 0. 1 mol/L醋酸钠缓冲液溶解并定容至 100 mL。

　　4 . 7 供试品

　　取固体或液体待测供试品适量 , 用冷的 0. 85% 氯化钠溶液溶解并稀释。

　　5 仪器设备

　　紫外-可见分光光度计、PH计 、微量进样器 、恒温水浴锅 、电子天平 、电泳仪 、分析天平(万分之一) 。

　　6 试验步骤

　　6 . 1 酶活性检测

　　6 . 1 . 1 底物溶液

　　按表 1 配制底物溶液并进行标定:用 0. 85%氯化钠溶液作空白对照清零 , 取底物溶液 2 . 5 mL, 加入0. 5 mL0. 85%氯化钠溶液 , 混匀后在紫外分光光度计中测定波长 260 nm 处的吸光度值 A260 应为0. 60±0 . 05 , 否则应调整小牛胸腺 DNA 的加样量。

　　表 1 底物溶液的配制

　　试剂

　　体积/mL

　　1 mol/L醋酸钠缓冲液

　　5 . 0

　　0. 1 mol/L硫酸镁溶液

　　2.5

　　小牛胸腺 DNA溶液

　　6 . 0

　　纯化水

　　36 . 5

　　总体积

　　50 . 0

　　6 . 1 . 2 酶促反应(25 ℃ )

　　按表 2 配制酶促反应液 , 混匀后立即置紫外分光光度计中测波长 260 nm 处的吸光度值 A260 , 每分钟读数一次 , 共计 3 次 , 取相邻两个读数差值 ΔA260 /min 的最大值。 ΔA260 /min 的最大值应在 0. 067 ~

　　2

　　GB/T 41712—2022

　　0. 083 之间 , 否则需调整供试品的稀释度 。

　　表 2 酶促反应配制表

　　试剂

　　供试品/mL

　　对照品/mL

　　底物溶液

　　2.5

　　2.5

　　供试品

　　0.5

　　—

　　0. 85% 氯化钠溶液

　　—

　　0.5

　　总体积

　　3 . 0

　　3 . 0

　　6 . 1 . 3 酶活性计算

　　6 . 1 . 3 . 1 单位体积中酶活性按式(1)计算 。

　　UDV ……………………( 1 )

　　式中:

　　UDV — 酶活性每单位体积 , 单位为酶活性单位每毫升(kunitz unit/mL) ;

　　Ad — ΔA260 /min 的最大值 ;

　　3 — 酶促反应液的总体积 , 单位为毫升(mL) ;

　　0. 5 — 酶促反应液中供试品的加样量 , 单位为毫升(mL) ;

　　df — 稀释倍数 ;

　　0. 001 —260 nm处每毫升每分钟变化 0. 001 吸光度值 。

　　6 . 1 . 3 . 2 单位固体质量中酶活性按式(2)计算 。

　　UDS ……………………( 2 )

　　式中:

　　UDS— 酶活性每单位质量 , 单位为酶活性单位每毫克(kunitz unit/mg) ;

　　UDV— 酶活性每单位体积 , 单位为酶活性单位每毫升(kunitz unit/mL) ;

　　cd — 供试品的浓度 , 单位为毫克每毫升(mg/mL) 。

　　6 . 2 RNase 杂质检测

　　6 . 2 . 1 溶液配制

　　6 . 2 . 1 . 1 溶液 1 :13 . 61 g 三水合乙酸钠 、800 mL纯化水 , 用 2 mol/L乙酸调 PH5 . 0 , 定容至 1 L。

　　6 . 2 . 1 . 2 溶液 2:0 . 1 g 酵母 RNA、100 mL溶液 1 , 溶解 30 min 。

　　6 . 2 . 2 供试品溶液

　　6 . 2 . 2 . 1 溶液 Ef :取固体/液体待测供试品适量 , 用冰预冷的纯化水溶解并稀释 。

　　6 . 2 . 2 . 2 溶液 E0 :将溶液 Ef 稀释 2 倍 。

　　6 . 2 . 3 RNase活性检测

　　6 . 2 . 3 . 1 水解速率测试(E0 )

　　用纯化水作空白对照 , 按表 3 配制水解速率测试反应液 , 混匀后立即在 25 ℃条件下在线检测 , 每分

　　3

　　GB/T 41712—2022

　　钟读数一次 , 即为 E0 值 , 共计 10 min 。

　　表 3 水解速率测试(E0 )反应液配制表

　　试剂

　　测试 1/mL

　　测试 2/mL

　　测试 3/mL

　　空白/mL

　　溶液 2

　　1 . 50

　　1 . 50

　　1 . 50

　　—

　　纯化水

　　1 . 30

　　1 . 35

　　1 . 40

　　3 . 00

　　溶液 E0

　　0 . 20

　　0 . 15

　　0 . 10

　　—

　　总体积

　　3 . 00

　　3 . 00

　　3 . 00

　　3 . 00

　　6 . 2 . 3 . 2 总水解度测试(Ef )

　　用纯化水作空白对照 , 按表 4 配制总水解度测试反应液 , 混匀后立即在 25 ℃条件下在线检测 , 每分钟读数一次 , 共计 20 min , Ef 值为 ΔA300 /min ≤0 . 002 时的读数 。

　　表 4 总水解度测试(Ef )反应液配制表

　　试剂

　　测试/mL

　　空白/mL

　　溶液 2

　　1 . 50

　　—

　　溶液 Ef

　　1 . 50

　　—

　　纯化水

　　—

　　3 . 00

　　总体积

　　3 . 00

　　3 . 00

　　6 . 2 . 3 . 3 ln(E0 —Ef )与时间的直线斜率按式(3)计算 。

　　S ……………………( 3 )

　　式中:

　　S — 每分钟(E0 —Ef )对数直线斜率 ;

　　E0 — 水解速率测试值 ;

　　Ef — 总水解度测试值 ;

　　Δt — 反应时间 10 min 。

　　6 . 2 . 3 . 4 RNase活性按式(4)计算 。

　　URS ……………………( 4 )

　　式中:

　　URS —RNase活性每单位质量 , 单位为酶活性单位每毫克(kunitz unit/mg) ;

　　S — 每分钟(E0 —Ef )对数直线斜率 ;

　　3 — 反应液的总体积 , 单位为毫升(mL) ;

　　df — 稀释倍数 ;

　　v0 — 速率测试(E0 )中酶的加样体积 , 单位为毫升(mL) ;

　　cd — 供试品的浓度 , 单位为毫克每毫升(mg/mL) 。

　　6 . 2 . 4 RNase杂质含量按式(5)计算 。

　　4

　　GB/T 41712—2022

　　RNase ……………………( 5 )

　　式中:

　　URS— 供试品中 RNase活性 , 单位为酶活性单位每毫克(kunitz unit/mg) ;

　　UDS— 供试品中 DNaseI 活性 , 单位为酶活性单位每毫克(kunitz unit/mg) 。

　　7 质量控制

　　在重复性条 件 下 , 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 大 于 这 两 个 测 定 值 的 算 术 平 均 值的 10% 。