GB/T 41234-2022 水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范 假病毒

　　ICS 65 . 020 . 30 CCS B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 41234—2022

　　水生动物 RNA病毒核酸检测参考物质

　　质量控制规范 假病毒

　　SpecificationofqualitycontrolofreferencematerialsforRNA Virus

　　detectionofaquaticanimals—ArmoredRNA

　　2022-03-09 发布 2022-10-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 41234—2022

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口 。

　　本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、连云港海关、北京海关。

　　本文件主要起草人：张炅、林祥梅、王娜、吴绍强、景宏丽、邓俊花、周毅、谷强、任彤、江育林。

　　Ⅰ

　　GB/T 41234—2022

　　水生动物 RNA病毒核酸检测参考物质

　　质量控制规范 假病毒

　　1 范围

　　本文件给出了作为水生动物 RNA 病毒核酸检测参考物质的假病毒，其质量控制规范的术语和定义、缩略语、原理、试剂或材料、仪器设备，规定了假病毒的质量控制、假病毒的保存、假病毒的验证，以及假病毒质量评价方法。

　　本文件适用于水生动物 RNA病毒核酸检测中假病毒(装甲 RNA)类参考物质的质量控制。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　变异系数 coefficientofvariation

　　概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为数据标准差与数据平均值之比。

　　3.2

　　初始样 frontsample

　　按照制备先后顺序，最先制备的 1/3 批次产品。

　　3.3

　　假病毒 armoredRNA

　　外膜蛋白包裹病毒 RNA 片段形成的病毒样粒子。

　　3.4

　　均匀性 uniformity

　　同一生产批次的假病毒，每支含有等量目的基因的状态。

　　3.5

　　溯源性 traceability

　　假病毒中 目 的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。

　　3.6

　　稳定性 stability

　　假病毒在特定保存条件和保存时间范围内，保证检测结果为阳性的能力。

　　1

　　GB/T 41234—2022

　　3.7

　　阳性参考物质 positivereferencematerial

　　与病原拥有某些完全相同的特征，如相同的 目 的基因序列、抗原性、敏感性等，用于该病原检测一定会得出理想的阳性检测结果，通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性。

　　3.8

　　中间样 middlesample

　　按照制备先后顺序，中间制备的 1/3 批次产品。

　　3.9

　　终止样 finalsample

　　按照制备先后顺序，最后制备的 1/3 批次产品。

　　3 . 10

　　最小有效取样量 minimum effectivesamplevolume

　　使用病原检测方法，可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　Amp：氨苄青霉素(ampicillin)

　　Ct：扩增循环数(cycle threshold)

　　cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)

　　DEPC：焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 (deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosine triphosphate)

　　dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)

　　dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidine triphosphate)

　　EB：溴化乙锭(ethidium bromide)

　　IPTG：异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)

　　LB：营养肉汤(luria-bertani broth)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)

　　RT-qPCR：逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative real-time pol- ymerase chain reaction)

　　Taq：水生嗜热菌(Thermusaquaticus)

　　X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)

　　5 原理

　　假病毒为一种病毒样粒子，外膜蛋白为 MS2 噬菌体蛋白，包裹用于检测病毒的 目 的 RNA 片段。假病毒与 MS2 噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，且不具备自我复制能力和感染能力。

　　2

　　GB/T 41234—2022

　　假病毒表达载体含有 MS2 噬菌体的成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下

　　游影响噬菌体包装的 19bp 发夹结构(见附录 A);在多克隆位点中插入病毒 目的 cDNA 片段后形成重

　　组假病毒表达载体;该载体在蛋白表达系统中能够将插入的外源片段转录成 RNA,同时合成的 MS2 噬菌体蛋白能够选择性包裹 RNA, 自组装成病毒样粒子，成为假病毒。 目前假病毒的制备方法主要为：先利用酶切连接法制备表达载体，再利用原核或真核表达系统组装假病毒粒子，制备流程按照附录 B进行。

　　作为 RNA病毒检测参考物质的假病毒，应具备以下特征：包含有病毒 RNA,可利用 RT-PCR、RT-

　　qPCR 等核酸检测方法特异性检测到病毒 RNA;具有良好的核酸酶耐受性，保护病毒 目的 RNA 不被核酸酶降解;不含有病毒 cDNA。

　　6 试剂或材料

　　6 . 1 本文件中所有化学试剂，除特别注明外，全部为分析纯试剂。

　　6 . 2 水：符合 GB/T 6682 中一级水规定。

　　6 . 3 DEPC水：商品化试剂。

　　6.4 RT-PCR试剂和 RT-qPCR试剂：商品化试剂。

　　6 . 5 病毒 目 的 DNA 的扩增引物：可参照相应的国家标准、行业标准合成。

　　6 . 6 Trizol：商品化试剂 。

　　6 . 7 RNase：商品化试剂。

　　6 .8 RNase 灭活处理的 EP 管、试管、PCR 管、移液器枪头：商品化耗材。

　　6 . 9 假病毒载体：由商品化载体构建。

　　6 . 10 制备假病毒所需的其他试剂：按照附录 C 配制。

　　7 仪器设备

　　7 . 1 超净工作台。

　　7 . 2 冷冻高速离心机。

　　7 . 3 电子天平。

　　7 . 4 高压灭菌锅。

　　7 . 5 PCR仪 。

　　7 . 6 电泳仪。

　　7 . 7 荧光定量 PCR仪。

　　7 . 8 紫外分光光度计。

　　7 . 9 凝胶成像系统。

　　7 . 10 移液器 。

　　8 假病毒的质量控制

　　8 . 1 假病毒中病毒目的 RNA片段的检测和溯源性

　　8 . 1 . 1 病毒目的 RNA片段的 RT-PCR检测

　　以所制备的假病毒溶液作为待测样品，定性检测样品中是否含有病毒 目 的 RNA 片段。

　　a) 提取假病毒的 RNA。

　　b) 以 RNA 为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行 RT-PCR 扩增。设置以

　　3

　　GB/T 41234—2022

　　水为模板的阴性对照，以病毒 RNA 为模板的阳性对照。

　　c) 反应产物进行电泳观察。

　　8 . 1 . 2 扩增产物的溯源性分析

　　将 8 . 1 . 1 的扩增产物回收、测序。 测序结果与相应病毒参考毒株的序列进行比对。

　　8 . 1 . 3 假病毒中病毒目的 RNA片段的质量判定

　　在 RT-PCR 阴性对照和阳性对照都成立的情况下，若同时满足以下两点，则说明病毒 目 的 RNA 片段包裹入外膜蛋白：

　　a) 假病毒 RNA 的 RT-PCR结果为阳性;

　　b) 扩增产物序列比对结果显示与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于 99%。

　　若假病毒 RNA RT-PCR产物为阴性，则表明假病毒未包裹病毒 目 的 RNA 片段，或假病毒提纯失败，应重新制备假病毒或提纯假病毒。

　　8 .2 假病毒中病毒 CDNA杂质的检测

　　8.2. 1 PCR或 qPCR检测

　　分别以未抽提的假病毒溶液和抽提的假病毒 RNA 为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和

　　实验条件进行 PCR 或 qPCR 扩增。设置以水为模板的阴性对照，以假病毒重组质粒为模板的阳性

　　对照。

　　8 . 2 . 2 结果判定

　　在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：

　　a) 未抽提的假病毒溶液或假病毒 RNA, PCR 或 qPCR 结果为阳性，则表明溶液或外膜蛋白中有病毒来源的 cDNA 杂质，则假病毒不能作为 RNA参考物质使用，应重新消化去除 cDNA;

　　b) 未抽提的假病毒溶液和假病毒 RNA, PCR 或 qPCR 结果为阴性，则说明病毒 cDNA 已全部去除。

　　8 . 3 假病毒中病毒目的 RNA片段的定量

　　使用 RT-qPCR方法，对假病毒中病毒 目的 RNA 片段进行定量。所使用的 RT-qPCR 方法应为针

　　对该病毒 目 的 RNA 片段设计建立的方法。

　　标准品可以为病毒 RNA,或病毒 cDNA,或含有病毒 目的 DNA 片段的重组质粒，使用紫外分光光

　　度计测定标准品浓度。

　　将标准品 10 倍梯度稀释至少 5 个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液为模板，进行 RT-qPCR 反应，根据各梯度标准品的 Ct值和浓度制定标准曲线和公式。

　　根据假病毒 RNA 的 Ct值，利用标准曲线和公式计算出假病毒溶液中病毒 目的 RNA 片段的浓度。也可以先计算假病毒 RNA 和标准品的 Ct值的差，再根据公式(1)计算出假病毒 RNA 和标准品之

　　间的浓度比。

　　X =10(ΔCt/3.3) …………………………( 1 )

　　式中：

　　ΔCt — 标准品 Ct值和假病毒 RNA Ct值的差;

　　X — 假病毒 RNA 和标准品之间的浓度比。

　　4

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　　8 . 4 假病毒最小有效取样量的确证

　　8.4. 1 取样量的设定和 RT-PCR、RT-qPCR确证

　　8.4. 1 . 1 分别取 10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL 和 500 μL假病毒。

　　8 . 4 . 1 . 2 分别提取 6 组假病毒的 RNA。

　　8.4. 1 .3 以 8.4.1.2 为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件，进行 RT-PCR 或 RT-qPCR扩增。 设置以水为模板的阴性对照，以病毒 RNA 为模板的阳性对照。

　　8.4. 1 .4 RT-PCR产物电泳，或 RT-qPCR产物读数。

　　8 . 4 . 2 最小有效取样量的确证

　　在阴性对照和阳性对照都成立的情况下，样品扩增产物可同时满足以下三点要求的最小有效取样量：

　　a) 取样量可保证 RNA提取过程正常完成;

　　b) RT-PCR 扩增出的 目的 DNA条带亮度不低于分子量标准(上样量 5 μL,浓度约 50 ng/μL)的条带亮度;

　　c) RT-qPCR 检测结果的 Ct值介于 25±3.3 之间。

　　8 . 5 假病毒均匀性检测

　　8 . 5 . 1 检测方法

　　8 . 5 . 1 . 1 以初始样、中间样、终止样三阶段分别随机抽取共 10 份假病毒样品。

　　8 . 5 . 1 . 2 依据同人同机原则，分别提取 10 份样品的 RNA。

　　8 . 5 . 1 . 3 分别以 10 份假病毒 RNA 为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行 RT- PCR 或 RT-qPCR 扩增，每份样品做 3 个平行对照，取平均 Ct值。

　　8.5. 1 .4 RT-PCR产物电泳，或 RT-qPCR产物读数并计算变异系数。

　　8 . 5 . 2 假病毒均匀性判定

　　判定标准如下：

　　a) 10 份假病毒样品的检测结果全部为阳性，且 RT-PCR 扩增的 10 条 DNA 条带亮度相同;或RT-qPCR 得出的 10 份样品 Ct值变异系数 ≤10%,则表明假病毒样品均匀性良好;

　　b) RT-PCR有样品为弱阳性或阴性;或 RT-qPCR 10 份样品 Ct 值变异系数>10%,则表明假病毒样品均匀性不良，需重新混匀分装。

　　8 . 6 假病毒稳定性检测

　　8 . 6 . 1 假病毒温度稳定性检测

　　设置 2 组假病毒样品，分别放置于 4 ℃和- 20 ℃保存。分别在第 1 天、第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 2 周、第 3 周、第 1 月和第 1 年时间段，每组各取 3 支样品，1 个样品应至少设三个重复，取 500 μL 假

　　病毒溶液提取 RNA,使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行检测。

　　8 .6 .2 假病毒 RNase耐受性检测

　　根据假病毒中病毒 RNA 的浓度，取假病毒溶液，含病毒 RNA 约 10 μg;加入 100 U RNase,孵育1 h, 孵育温度根据 RNase说明书设置。取 500 μL 假病毒溶液提取 RNA,进行 RT-PCR 或 RT-qPCR

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　　GB/T 41234—2022

　　检测。

　　8 . 6 . 3 假病毒稳定性判定

　　假病毒经以下 3 种方法平行处理后，RT-PCR 或 RT-qPCR 检测结果仍为阳性，说明稳定性良好，

　　否则需重新制备假病毒：

　　a) 4 ℃至少保存 7 d ;

　　b ) -20 ℃至少保存 1 年 ;

　　c) RNase 处理 1 h。

　　9 假病毒的保存

　　低于-20 ℃条件下保存时间不超过 1 年，避免反复冻融;4 ℃条件下保存时间不超过 7 d。

　　10 假病毒的验证

　　假病毒作为水生动物 RNA病毒核酸检测参考物质，经过至少 5 家具备核酸提取和分子生物学检测能力的水生动物检测实验室平行测定。 测定内容包括病毒 目 的 RNA 片段的特异性、定性检测、定量

　　检测等。定性检测要求检测结果为阳性，定量检测要求 Ct值误差不超过 ±3.3。测定结果都合格后，才

　　能投入使用。

　　1 1 假病毒质量评价方法

　　经 8.1~8.6 步骤检测，假病毒应同时满足以下 7 点要求，才能作为水生动物 RNA 病毒核酸检测参

　　考物质使用：

　　a) 外膜蛋白包裹病毒 目的 RNA 片段，扩增片段序列与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于 99% ;

　　b) 假病毒溶液中和外膜蛋白里都不含有病毒 cDNA;

　　c) 最小有效取样量能同时满足 RNA 提取和 RT-PCR 或 RT-qPCR 的需求;

　　d) 同批次样品均匀性良好，检测结果基本一致;

　　e) 4 ℃保存 7 d,-20 ℃保存 1 年，检测结果仍为阳性;

　　f) 拥有一定的核酸酶耐受性，RNase 处理 1 h后仍可使用;

　　g) 经过至少 5 家水生动物疫病研究实验室的平行测定，且测定结果全部合格。

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　　附 录 A (资料性)基 因 序 列

　　假病毒载体中插入的 MS2 基因(GenBank MK213795,成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的 19 bp 发夹结构)，全长 1706 bp。

　　1 CTATCGCTGT AGGTAGCCGG AATTCCATTC CTAGGAGGTT TGACCTGTGC GAGCTTTTAG TACCCTTGAT

　　71 AGGGAGAACG AGACCTTCGT CCCCTCCGTT CGCGTTTACG CGGACGGTGA GACTGAAGAT AACTCATTCT

　　141 CTTTAAAATA TCGTTCGAAC TGGACTCCCG GTCGTTTTAA CTCGACTGGG GCCAAAACGA AACAGTGGCA

　　211 CTACCCCTCT CCGTATTCAC GGGGGGCGTT AAGTGTCACA TCGATAGATC AAGGTGCCTA CAAGCGAAGT

　　281 GGGTCATCGT GGGGTCGCCC GTACGAGGAG AAAGCCGGTT TCGGCTTCTC CCTCGACGCA CGCTCCTGCT

　　351 ACAGCCTCTT CCCTGTAAGC CAAAACTTGA CTTACATCGA AGTGCCGCAG AACGTTGCGA ACCGGGCGTC

　　421 GACCGAAGTC CTGCAAAAGG TCACCCAGGG TAATTTTAAC CTTGGTGTTG CTTTAGCAGA GGCCAGGTCG

　　491 ACAGCCTCAC AACTCGCGAC GCAAACCATT GCGCTCGTGA AGGCGTACAC TGCCGCTCGT CGCGGTAATT

　　561 GGCGCCAGGC GCTCCGCTAC CTTGCCCTAA ACGAAGATCG AAAGTTTCGA TCAAAACACG TGGCCGGCAG

　　631 GTGGTTGGAG TTGCAGTTCG GTTGGTTACC ACTAATGAGT GATATCCAGG GTGCATATGA GATGCTTACG

　　701 AAGGTTCACC TTCAAGAGTT TCTTCCTATG AGAGCCGTAC GTCAGGTCGG TACTAACATC AAGTTAGATG

　　771 GCCGTCTGTC GTATCCAGCT GCAAACTTCC AGACAACGTG CAACATATCG CGACGTATCG TGATATGGTT

　　841 TTACATAAAC GATGCACGTT TGGCATGGTT GTCGTCTCTA GGTATCTTGA ACCCACTAGG TATAGTGTGG

　　911 GAAAAGGTGC CTTTCTCATT CGTTGTCGAC TGGCTCCTAC CTGTAGGTAA CATGCTCGAG GGCCTTACGG

　　981 CCCCCGTGGG ATGCTCCTAC ATGTCAGGAA CAGTTACTGA CGTAATAACG GGTGAGTCCA TCATAAGCGT

　　1051 TGACGCTCCC TACGGGTGGA CTGTGGAGAG ACAGGGCACT GCTAAGGCCC AAATCTCAGC CATGCATCGA

　　1121 GGGGTACAAT CCGTATGGCC AACAACTGGC GCGTACGTAA AGTCTCCTTT CTCGATGGTC CATACCTTAG

　　1191 ATGCGTTAGC ATTAATCAGG CAACGGCTCT CTAGATAGAG CCCTCAACCG GAGTTTGAAG CATGGCTTCT

　　1261 AACTTTACTC AGTTCGTTCT CGTCGACAAT GGCGGAACTG GCGACGTGGC TGTCGCCCCA AGCAACTTCG

　　1331 CTAACGGGGT CGCTGAATGG ATCAGCTCTA ACTCGCGTTC ACAGGCTTAC AAAGTAACCT GTAGCGTTCG

　　1401 TCAGAGCTCT GCGCAGAATC

　　GCAAATACAC

　　CATCAAAGTC

　　GAGGTGCCTA

　　AAGTGGCAAC

　　CCAGACTGTT

　　1471 GGTGGTGTAG AGCTTCCTGT

　　AGCCGCATGG

　　CGTTCGTACT

　　TAAATATGGA

　　ACTAACCATT

　　CCAATTTTCG

　　1541 CTACGAATTC CGACTGCGAG

　　CTTATTGTTA

　　AGGCAATGCA

　　AGGTCTCCTA

　　AAAGATGGAA

　　ACCCGATTCC

　　1611 CTCAGCAATC GCAGCAAACT

　　CCGGCATCTA

　　CTAATAGACG

　　CCGGCCATTC

　　AAACATGAGG

　　ATTACCCATG

　　1681 TCGAAGACAA CAAAGAAGTT

　　CAATCT

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　　GB/T 41234—2022

　　附 录 B

　　(规范性)

　　假病毒制备方法

　　B.1 试剂或材料

　　B.1 . 1 DEPC水：商品化试剂。

　　B.1 . 2 DNA凝胶回收试剂、原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统：商品化试剂盒。

　　B.1 . 3 质粒载体：T 载体，商品化试剂。

　　B.1 . 4 假病毒质粒载体：由使用实验室 自 己合成，或采购其他实验室已经构建的载体。 载体多克隆位点中应成功插入 MS2 蛋白基因片段，基因方向应正确，也可再插入 6 × His 基因，使表达出的假病毒外膜蛋白包含 6 × His 标签，可使用 Ni-NTA 亲和层析法纯化。

　　B.1 .5 dNTP：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 2.5 mmol/L, -20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

　　B.1 .6 Taq DNA 聚合酶：5 U/μL, -20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

　　B.1 .7 逆转录酶 AMV: 10 U/μL,-20 ℃保存，避免反复冻融和温度剧烈变化。

　　B.1 . 8 病毒 目 的 DNA 的扩增引物：可参照相应的国家标准或行业标准合成。

　　B.1 .9 T4 DNA 连接酶：350 U/μL, -20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

　　B.1 . 10 限制性内切酶：-20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

　　B.1 . 1 1 IPTG : 20% ,按照 C. 1 配制 。

　　B.1 . 12 X-gal:2%,按照 C.2 配制。

　　B.1 . 13 LB 培养基：按照 C. 3 配制。

　　B.1 . 14 Trizol、DNase I、RNase A、Triton X-100、Amp：商品化试剂。

　　B.1 . 15 溴化乙锭：10 mg/mL,按照 C.4 配制，也可选择商品化试剂。

　　B.1 . 16 50 × TAE 电泳缓冲液：按照 C.5 配制，也可选择商品化试剂。

　　B.1 . 17 6×上样缓冲液：按照 C.6 配制，也可选择商品化试剂。

　　B.1 . 18 RNase 灭活处理的 EP 管、试管、PCR 管、移液器枪头：商品化耗材。

　　B.2 仪器设备

　　B.2 . 1 水浴锅 。

　　B.2 . 2 恒温摇床。

　　B.2 . 3 超净工作台。

　　B.2 . 4 冷冻高速离心机。

　　B.2 . 5 电子天平。

　　B.2 . 6 高压灭菌锅。

　　B.2 . 7 PCR仪 。

　　B.2 . 8 电泳仪。

　　B.2 . 9 荧光定量 PCR仪。

　　B.2 . 10 紫外分光光度计。

　　B.2 . 1 1 凝胶成像系统。

　　B.2 . 12 移液器 。

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　　GB/T 41234—2022

　　B.3 假病毒参考物质的制备

　　B.3 . 1 病毒总 RNA 的提取

　　按照待检目的病毒检测的国家标准或行业标准中推荐的方法，从病毒液中提取总 RNA。 对于还未建立检测标准的病毒，可按照非标方法提取总 RNA。

　　B.3 .2 目的 CDNA的选择、引物设计和扩增

　　B.3.2. 1 目的 cDNA 的选择：选择该病毒检测标准中推荐的 目的 DNA序列。

　　B.3.2.2 引物设计：根据该病毒检测标准中推荐的引物序列，在 2 条引物 5′端分别加入酶切位点。酶切位点的选择应遵循以下原则：

　　a) 应从假病毒载体上的酶切位点中选择;

　　b) 2 条引物所带的酶切位点不能相同;

　　c) 应确保目的 DNA不含有该酶切位点;

　　d) 确保引入酶切位点后，引物也不易产生发卡结构;

　　e) 两个酶切位点在载体上的位置，不能有重叠碱基。

　　针对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒和草鱼呼肠孤病毒

　　( Ⅰ 型和 Ⅱ 型)等重要水生动物 RNA病毒，根据 OIE水生动物疾病诊断手册和相关国家标准推荐的病毒 目的 DNA序列，可尝试使用以下酶切位点：正向引物，Not Ⅰ 或 Kpn Ⅰ;反向引物，HindⅢ。

　　B.3.2.3 使用 Taq酶和反转录酶，以总 RNA 为模板进行 RT-PCR 扩增。反应体系和反应条件参照相

　　应病毒检测标准进行。为增加 DNA 的回收量，RT-PCR 的总反应体系至少为 200 μL。

　　B.3 . 3 反应产物的上样和电泳

　　将 50 × TAE 电泳缓冲液稀释 50 倍，再配制 1%的琼脂糖(含 0.5 μg/mL EB)凝胶平板。将全部

　　PCR 扩增产物和 1/5 体积的上样缓冲液混匀后加入样品孔。 在电泳时使用核酸分子量标准参照物作

　　对照。5 V/cm 电泳 20 min~30 min,当溴酚蓝到达凝胶平板 2/3 处时停止。

　　B.3 . 4 目的 DNA 的回收

　　在紫外灯下观察电泳后的凝胶，切下含目的 DNA 的条带，放入离心管中。 根据商品化凝胶回收试

　　剂盒说明书，提取目的 DNA。使用 20 μL水溶解 DNA。

　　B.3 . 5 目的 DNA质量检测

　　取 2 μL 目的 DNA溶液上样和电泳，在紫外灯下观察电泳结果：若 DNA分子量位置与检测标准中

　　规定的 目 的 DNA位置相同，则 目 的 DNA 回收成功;若位置不同，或无明显 DNA 条带出现，则 目 的DNA 提取失败，应重新扩增回收。

　　使用紫外分光光度计测量目的 DNA浓度。

　　B.3 . 6 目的 DNA连接入 T 载体

　　根据分子量计算 目 的 DNA 和 T 载体的浓度，载体连接外源基因体系应符合表 B. 1 要求。

　　9

　　GB/T 41234—2022

　　表 B.1 载体连接外源基因体系

　　试剂

　　加入量

　　10 × T4 DNA Ligase Buffer

　　2.5 μL

　　目 的 DNA

　　0 . 3 pmol

　　T 载体

　　0 . 03 pmol

　　T4 DNA 连接酶

　　1 μL

　　ddH 2 O

　　加水至总体积 25 μL

　　反应条件：16 ℃ ,至少 12 h。

　　B.3 . 7 T 载体连接产物的转化与蓝白斑筛选

　　B.3.7. 1 取 100 μL 大肠杆菌 DH5α感受态溶液于 1.5 mL离心管中，加入 10 μL 连接产物，将离心管置冰浴 30 min, 42 ℃水浴 90 s,再冰浴 5 min;加入 900 μL LB 培养液，混匀，37 ℃振荡培育 1 h。

　　B.3.7.2 取 100 μL 菌液，加入 40 μL X-gal 溶液(2%)和 7 μL IPTG(20%) ,混匀后，均匀涂布于含

　　100 μg/mL Amp 的 LB平板(90 mm 直径)上;室温放置 5 min后，37 ℃倒置培养 12 h~16 h。

　　B.3.7.3 另取 100 μL感受态溶液，不加连接产物，为阴性对照，操作方法见 B.3.7.2。

　　B.3 . 7 . 4 培养结果观察：蓝色菌落携带空质粒，乳白色菌落携带重组质粒;若阴性对照也生长出菌落，说明培养基中 Amp 失效，需重新制备平板进行蓝白斑筛选。

　　B.3.7.5 将平板置于 4 ℃保存备用，保存时间不超过 1 个月。

　　B.3 . 7 . 6 T 载体重组质粒的提取：

　　a) 挑白斑单菌落，放入 3 mL 含 100 μg/mL Amp 的 LB 液体培养基中，37 ℃摇菌过夜。取

　　1.5 mL 菌液 4 ℃保存，保存时间不超过 1 个月。剩余 1.5 mL 菌液用于提取 T 载体重组质粒。

　　b) 使用商品化质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，加入 50 μL 超纯水溶解，-20 ℃保存备用。

　　B.3 . 8 T 载体重组质粒和假病毒空载体的双酶切

　　双酶切体系应符合表 B. 2 要求。

　　表 B.2 酶切体系

　　试剂

　　加入量/μL