GB/T 42475-2023 化学品 中华蜜蜂急性经口毒性试验

　　ICS 13 . 300 ; 13 . 020 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 42475—2023

　　化学品 中华蜜蜂急性经口毒性试验

　　Chemicals—Apis cerana cerana Fabricius acute oral toxicity test

　　2023-03-17 发布 2023-10-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 42475—2023

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口 。

　　本文件起草单位:中国科学院生态环境研究中心 、北京科润天朗环境技术有限公司 、中检科健(天津)检验检测有限责任公司 、中国检验检疫科学研究院 、厦门尹巢科技有限公司 、广东铭凯科技有限公司 、浙江辉日环境检测有限公司 、金久科技有限公司 。

　　本文件主要起草人:万斌 、王会利 、李建中 、徐鹏 、李伟 、王瀛寰 、韩永涛 、张艳峰 、姜福平 、周丽丽 、李季 、易仲辉 、万青兰 、毛晓尧 。

　　I

　　GB/T 42475—2023

　　化学品 中华蜜蜂急性经口毒性试验

　　1 范围

　　本文件规定了使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂急性经口毒性的试验原理 、试验方法 、结果计算与表示 、质量保证与质量控制和试验报告。

　　本文件适用于使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂的急性经口毒性。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中,注 日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB5749 生活饮用水卫生标准

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。 3.1

　　急性毒性 acute toxicity

　　生物体短时间(1 d~4 d)内一次或多次暴露于某种化学物质而产生的明显不良反应。

　　注 : 在本试验中,急性经口毒性用半数致死浓度(LC50 )来表示,即在特定时间内(最高 96 h)导致 50%数量的受试蜜蜂死亡的物质浓度。

　　4 试验原理

　　用受试物与蜂蜜水混合成不同浓度的溶液饲喂中华蜜蜂,生物学背景见附录 A。 以 48 h 为一个试验周期,在 24 h 、48 h 时记录蜜蜂的死亡数,并计算各组死亡率,分别确定 50%试验蜜蜂死亡时的受试物浓度,用 24 h-LC50 或 48 h-LC50 表示。 若研究时间延长,则继续记录 72 h 、96 h蜜蜂的死亡数。

　　5 试验方法

　　5 . 1 仪器设备

　　5 mL小烧杯 、温度控 制 及 连 续 测 温 设 备 、加 湿 器 及 温 湿 度 仪 、饲 喂 管 、精 密 天 平(至 少 精 确 到±0 . 1%) 。

　　5 . 2 试验容器

　　试验容器可为长 、宽 、高分别为 10 cm 、10 cm 和 10 cm,以网纱衬里的蜂笼;或恒温恒湿培养箱, 以保证试验温度和湿度稳定。 当受试物具有挥发性时,实验室应装有通风装置;当受试物不具有挥发性时,试验容器底部 、顶部应敞开。 试验前对容器进行清洗,干燥后备用。 将试验容器在试验区域随机放

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　　置 。使用分组设计可以控制实验窒中的系统影响 , 每个区域每个处理组应随机设计 。试验过程中 , 容器应避免不必要的干扰 , 如搬动或移动容器 、人员频繁走动 。

　　5 . 3 受试蜜蜂

　　中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius)成年工蜂 , 试验应选择同一批体长和年龄相似的成年工蜂 。人工饲养的成年工蜂在试验前需要转入到试验用蜂笼进行为期一周的驯化 , 在驯化期间饲喂试验用蜂蜜水或蔗糖水 , 没有出现明显死亡状况则可以选取身体健康 、大小一致的工蜂进行试验 。受试中华蜜蜂的驯养方法按照附录 B进行 。

　　5 . 4 试验用水

　　试验用水使用饮用水(需除氯)或纯净水应符合 GB5749 的要求 。 除氯后的试验用水中氯化物含量应小于或等于 250 mg/L。试验用水的 PH应为 6 . 5~8 . 5 。

　　5 . 5 试验条件

　　试验在 23 ℃ ~27 ℃ 、相对湿度为 50%~70%的黑暗环境中进行;试验开始 2 h前停止喂食 , 试验过程中用小烧杯法或饲喂管法进行喂食;对照组中试验蜜蜂的存活率应大于 90% 。

　　5 . 6 受试样品制备

　　将已知量的受试物溶于一定体积去离子水或蒸馏水中 。如果受试物为水溶性 , 则可直接溶于喂饲的蔗糖溶液中 。贮备液应当天配制 。对于化学性质较稳定的物质 , 可配制供 2 d 以上使用的溶液 , 配好后低温保存 。对于水溶解度低的物质 , 可使用超声波分散混匀 , 也可加入对蜜蜂低毒的有机溶剂 、乳化剂或分散剂助溶(如二甲基亚砜 、二甲基甲酰胺 、丙酮等) , 配制试验物质储备液应使用分析纯试剂 。所有受试物测试浓度组中助溶剂的用量应该相同 , 且其浓度一般不超过 1% 。贮备液的配制推荐使用机械方式(例如搅拌或超声) , 使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动 。通过稀释储备液来配制所选定浓度的试验溶液 。

　　5 . 7 试验步骤

　　5 . 7 . 1 预试验

　　5 . 7 . 1 . 1 剂量设置

　　正式试验前先进行预试验 , 以确定试验中的浓度范围 。配制一系列浓度 , 该系列浓度一般以 10 为等比做间距 , 例如 :0 . 1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L, 也可根据需要以其他公比进行配制 。设空白对照组 , 对照组至少设置 3 个重复 , 如果使用助溶剂还应增加溶剂对照组 。

　　5 . 7 . 2 预试验方法

　　5 . 7 . 2 . 1 小烧杯法

　　试验可在长 、宽 、高均为 10 cm 的网纱衬里的木质蜂笼中进行 。用质量浓度为 0. 5 g/mL的蜂蜜水与药剂母液混合 , 按等比序列配制成不同浓度的药液 。 取 10 mL配制好的药液移至放有脱脂棉的5 mL小烧杯内 , 再将小烧杯倒扣于蜂笼顶部供蜜蜂取食 。每个蜂笼放 20 只成年工蜂 。 每个处理组(包括空白对照组)设置 3 个重复 。试验开始后每隔 24 h检查 、记录各组蜜蜂中毒和死亡情况 。

　　5 . 7 . 2 . 2 饲喂管法

　　试验在网纱衬里的木质蜂笼中进行 。笼顶部安装一个饲喂管 , 供试蜜蜂可将喙伸入管内吸取药液 。

　　2

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　　药液配制同小烧杯法 , 将 10 mL配好的药液放入饲喂管中供蜜蜂取食。 每 4 h 记录一次药液消耗量。每只笼中一次性移入 20 只成年工蜂。 每处理(包括空白对照)设置 3 个重复。 在小烧杯法与饲喂管法结果不一致的情况下 , 以饲喂管法为仲裁法。

　　5 . 7 . 3 正式试验

　　5 . 7 . 3 . 1 剂量设计

　　在预试验中 , 根据蜜蜂最低全致死浓度与最高全存活浓度之间 , 以几何级数做间距 , 公比不超过2 . 2 , 至少选择 5 个浓度为正式试验的浓度 , 使死亡率分布在 0%~100% 。其浓度范围在 3 个依次的几何系列浓度中最好能够测得 20%~80%的死亡率以估算 LC50 值 。

　　5 . 7 . 3 . 2 试验方法

　　每个浓度组至少设置 3 个重复 , 供试蜂数量至少为 20 只 , 测试持续时间为 48 h 。 试验初始的4 h , 观察蜜蜂死亡数 , 从结果中减去。 每隔 24 h 对蜜蜂进行观察。 如果试验蜂蜷缩于蜂笼底部不动 , 可视为已死亡。 同时 , 记录内容还应包括各种观察到的异常行为(如蜜蜂在笼底部乱转 , 挤成一堆等) 。记录 24 h 、48 h 的蜜蜂死亡数 , 对试验数据进行数理统计 , 求出 LC50 值及 95%置信限。 如研究时间延长 , 可记录直至 96 h 。化学品浓度 、重复次数 、死亡率和症状样本数据记录见附录 C。

　　5 . 7 . 3 . 3 饲喂管法应每天补充添加药物的蜜水 , 以保证蜜蜂随时取食。

　　5 . 7 . 4 限度试验

　　在预计一种受试物为低毒等情况下 , 应进行限度试验 , 以确定 LC50 是否大于限度值。 在本文件规定的试验条件下 , 若受试物的最大水溶解度大于 2 000 mg/L时 , 则以 2 000 mg/L为限度试验浓度进行试验。 若受试物的最大水溶解度无法达到 2 000 mg/L, 则以受试物在介质中的最大水溶解度(或者是形成稳定分散溶液的最大浓度)为限度试验浓度进行测定。 取 20 只中华蜜蜂成年工蜂进行试验 , 试验时间为 48 h , 试验结束时若无受试蜂死亡 , 则不再进行下一步试验。 限度试验中若有死亡发生 , 应进行完整试验。 如果观察到致死效应 , 则应进行记录。 试验结果以 48 h-LC50 大于该物质的最大水溶解度或大于 2 000 mg/L表示。

　　6 结果计算与表示

　　中华蜜蜂急性经口毒性半数致死剂量 LC50 值的计算可采用寇氏法 、直线内插法或概率单位图解法估算 , 也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。

　　7 质量保证与质量控制

　　7 . 1 正式试验至少设 3 组重复试验。 试验结束时 , 对照组死亡率不应超过 10% 。如果在第一个 24 h之后死亡率持续增加了 10%以上 , 则需要延长实验 , 最长至 96 h 。

　　7 . 2 试验期间 , 试验环境温度恒定控制在 23 ℃ ~27 ℃ , 相对湿度控制在 50% ~70% , 且在黑暗环境下。

　　7 . 3 试验开始前 , 检测配制的受试物实际浓度 , 应不低于理论浓度的 80% 。

　　8 试验报告

　　试验结果报告应包括以下内容:

　　3

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　　— 受试物物理性质和相关物理化学性质 ;

　　— 化学标识数据,包括受试物的纯度及定量分析方法 ;

　　— 中华蜜蜂大致年龄(周) 、采集方法 、采集日期 、健康状况 、是否处理等信息 ;

　　— 蜂蜜水来源及配置方法 ;

　　— 贮备液的制备方法,如果受试物难溶于水,则记录配制贮备液和试验液的方法,所用助溶剂物质的浓度 ;

　　— 温度 、湿度条件,保证试验全过程黑暗 ;

　　— 选择试验方法的原因和详细过程 ;

　　— 试验设计(如试验容器数量 、试验浓度 、重复) ;

　　— 试验理论浓度 、实测浓度平均值和试验容器间标准差,以及分析试验方法 ;

　　— 所用化学分析法的方法步骤以及试验结果 ;

　　— 如果进行了限度试验,报告结果 ;

　　— 在每次建议的观察时间,记录各浓度下的累积死亡数及对照组结果 ;

　　— 试液浓度及每一推荐观察时间的 LC50 值(置信度 95%) ;

　　— 试验过程中死亡率为 0 的最大试验浓度(LC0 ),试验过程中死亡率为 100%的最小试验浓度

　　(LC100 ) ;

　　— 蜂所有异常反应的发生率,以及所有因受试物而引起的反应 。

　　4

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　中华蜜蜂生物学背景资料

　　中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius),动物界,节肢动物门,昆虫纲,膜翅 目 ,细腰亚 目 ,蜜蜂科 。又称中华蜂 、中蜂 、土蜂,是东方蜜蜂的一个亚种,是中国独有的蜜蜂当家品种,是以杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫,有利用零星蜜源植物 、采集力强 、利用率较高 、采蜜期长及适应性 、抗螨抗病能力强等优点 。 中华蜜蜂工蜂腹部颜色因地区不同而有差异,有的较黄,有的偏黑;吻长平均 5 mm 。蜂王有两种体色:一种是腹节有明显的褐黄环,整个腹部呈暗褐色;另一种是腹节无明显褐黄环,整个腹部呈黑色 。雄蜂一般为黑色 。南方蜂种一般比北方的小,工蜂体长约 10 mm~13 mm,雄蜂体长约 11 mm~13 . 5 mm,蜂王体长约 13 mm~16 mm 。成年工蜂体长约 10 mm±2 mm 。

　　5

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　受试中华蜜蜂的驯养方法

　　春夏季节将中华蜜蜂蜂箱置于实验室外搭建的遮雨棚内 , 定期查看蜜蜂酿蜜情况 , 酌情给予一定的蔗糖水或蜂蜜水防止食物短缺 。 中华蜜蜂飞行敏捷 , 嗅觉灵敏 , 出巢早 、归巢迟 , 每日外出采集的时间比意大利蜂多 2 h~3 h , 善于利用零星蜜源 。造脾能力强 , 喜欢新脾 , 爱啃旧脾;抗蜂螨和美洲幼虫腐臭病能力强 , 但容易感染中蜂囊状幼虫病 , 易受蜡螟危害;喜欢迁飞 , 在缺蜜或受病敌害威胁时特别容易弃巢迁居;易发生自然分蜂和盗蜂;不采树胶 , 分泌蜂王浆的能力较差;蜂王 日产卵量比西方蜜蜂少 , 群势小 。

　　冬季天冷后 , 于蜂箱内添加隔温板 , 往蜂排上添加一定量蜂蜜水以备蜂群过冬 , 并于蜂箱上添加稻草 。如果温度仍然较低 , 可以将蜂箱转移到温室内 。 温室内种植草莓等蜜源植物 , 蜜蜂可以为其授粉 , 提高产量 , 丰富的蜜源也有利于蜜蜂生存 , 为毒理试验提供活力强的中华蜜蜂 。 注意定期检查蜂箱 , 及时清除闯入蜂箱的外族蜂 , 以防中华蜜蜂受攻击 。保持蜂箱周围整洁干燥 , 防止传染病发生 。

　　受试蜜蜂的选择:应在试验温度的饲养室饲养一周以上 , 饲喂与试验中种类相同的足量蜂蜜水 。

　　训化期间 , 记录死亡率并按照以下的标准评判 。

　　1) 7 d 内试验蜂死亡率大于 10%:舍弃整批蜂 。

　　2) 7 d 内试验蜂死亡率在5%~10%:再饲养 7 d ; 如果接下来的 7 d 内试验蜂死亡率小于5%:接收本批蜂;如果接下来的 7 d 内 , 试验蜂死亡率超过 5% , 舍弃整批蜂 。

　　3) 7 d 内试验蜂死亡率小于 5%:接收本批蜂 。

　　保证试验中使用的蜂没有明显疾病 , 舍弃所有病蜂 。试验期间及试验前两周不应对蜂做任何疾病处理 。经抗生素等化学物质处理的蜜蜂 , 在最后一次处理结束后的 4 周内不应用本试验 。

　　驯养期间环境记录见表 B. 1 , 饲养记录见表 B. 2 。

　　表 B. 1 蜜蜂驯养环境记录表

　　控温空间面积 : 控温方式 : 自动 人工

　　温度 : T= ℃ 相对湿度 : %(相对湿度)

　　时间

　　示值

　　异常情况及处理记录

　　记录人

　　日期

　　h : min

　　温度/℃

　　温度/%

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　6

　　6

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　　表 B. 2 蜜蜂饲养记录表

　　日期

　　批号

　　喂食

　　活动状况

　　有无蜂王

　　病虫害

　　地方

　　备注

　　记录人

　　蜜 水

　　清 水

　　正 常

　　异 常

　　有

　　无

　　有

　　无

　　室 外

　　室 内

　　7

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　样本数据记录表

　　化学品浓度 、重复次数 、死亡率和症状样本数据记录表见表 C. 1 。

　　表 C. 1 化学品浓度 、重复次数 、死亡率和症状样本数据记录表

　　日期(精确到时间) : 观察周期 : 记录人 :

　　温度 : 湿度 : 光照 :

　　浓度

　　重复

　　死亡数

　　症状

　　浓度

　　重复

　　死亡数

　　症状

　　备注 :

　　计算所采用方法 :

　　LC50 值 : 95%置信限 :

　　8