GB/T 22260-2023 饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 65 . 120 CCS B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22260—2023代替 GB/T22260—2008

　　饲料中蛋白质同化激素的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determinati0n 0f anab0lic 5ter0id5 in feed5—

　　Liquid chr0mat0graphy-tandem ma55 5pectr0metry

　　2023-08-06 发布 2024-03-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22260—2023

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 22260—2008《饲 料 中 甲 基 睾 丸 酮 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法》' 与GB/T 22260—2008 相比 ' 除结构调整和编辑性改动外 ' 主要技术变化如下:

　　a) 增加了检出限(见第 1 章) ;

　　b) 更改了原理(见第 4 章 ' 2008 年版的第 3 章) ;

　　c) 更改了试样的提取和净化(见 8 . 1 、8 . 2 ' 2008 年版的 7 . 1 、7 . 2) ;

　　d) 更改了液相色谱和质谱参考条件(见 8 . 3 . 1 和 8 . 3 . 2 ' 2008 年版的 7 . 3 . 1 和 7 . 3 . 2) ;

　　e) 更改了液相色谱-串联质谱法定性和定量要求(见 8 . 3 . 4 和 8 . 3 . 5 ' 2008 年版的 7 . 3 . 3) ;

　　f) 更改了试验数据处理(见第 9 章 ' 2008 年版的 8 . 1) ;

　　g) 更改了精密度(见第 10 章 ' 2008 年版的第 9 章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口 。

　　本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心 、中国农业科学院饲料研究所 。

　　本文件主 要 起 草 人: 黄 士 新 、王 博 、谷 旭 、曹 莹 、张 婧 、严 凤 、商 军 、吴 剑 平 、贾 铭 、王 杰 、李 军 国 、张文刚 、黄家莺 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:

　　—2008 年首次发布为 GB/T 22260—2008 ;

　　— 本次为第一次修订 。

　　I

　　GB/T 22260—2023

　　饲料中蛋白质同化激素的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本文件描述了饲料中蛋白质同化激素的液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本文件适用于配合饲料 、浓缩饲料 、精料补充料 、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中睾酮 、甲基睾丸酮 、勃地龙 、美雄酮 、雄烯二酮 、脱氢异雄酮 、诺龙 、丙酸诺龙 、司坦唑醇 、醋酸美伦孕酮 、黄体酮的测定 。

　　本文件甲基睾丸酮 、司坦唑醇 、醋酸美伦孕酮的检出限为 0. 005 mg/kg'睾酮 、勃地龙 、美雄酮 、雄烯二酮 、脱氢异雄酮 、诺龙 、丙酸诺龙 、黄体酮的检出限为 0. 02 mg/kg;甲基睾丸酮 、司坦唑醇 、醋酸美伦孕酮的定量限为 0. 01 mg/kg'睾酮 、勃地龙 、美雄酮 、雄烯二酮 、脱氢异雄酮 、诺龙 、丙酸诺龙 、黄体酮的定量限为 0. 05 mg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 ' 注 日期的引用文件 ' 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件 ' 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 原理

　　试样中的蛋白质同化激素用乙腈提取 ' 经吸附剂净化后 ' 用液相色谱-串联质谱仪检测 ' 内标法定量 。

　　5 试剂或材料

　　5 . 1 水: GB/T 6682 ' 一级 。

　　5 . 2 乙腈:色谱纯 。

　　5 . 3 甲酸:色谱纯 。

　　5 . 4 50%乙腈溶液:取 50 mL乙腈(5 . 2) ' 加水稀释至 100 mL' 混匀 。

　　5 . 5 0. 01%甲酸溶液:取 100 μL 甲酸(5 . 3) ' 加水稀释至 1 000 mL' 混匀 。

　　5 . 6 标准储备溶液(1 mg/mL):准确称取睾酮 、甲基睾丸酮 、勃地龙 、美雄酮 、雄烯二酮 、脱氢异雄酮 、诺龙 、丙酸诺龙 、司坦唑醇 、醋酸美伦孕酮 、黄体酮各 0. 01 g(精确至 0. 000 01 g) ' 分别置于 10 mL棕色容

　　1

　　GB/T 22260—2023

　　量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)溶解并定容 ' 混匀 。 于 — 18 ℃以下保存 ' 有效期为 6 个月 。 蛋白质同化激素标准品等具体信息见附录 A。

　　5 . 7 混合标准中间溶液 I (10 μg/mL) :分别准确移取标准储备溶液(5 . 6)各 100 μL于 10 mL棕色容量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)稀释 、定容 ' 混匀 。 于 —18 ℃以下保存 ' 有效期为 3 个月 。

　　5 . 8 混合标准中间溶液 Ⅱ (1 μg/mL) :准确移取混合标准中间溶液 I (5 . 7)1 mL于 10 mL棕色容量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)稀释 、定容 ' 混匀 。 临用现配 。

　　5 . 9 同位素内标储备溶液(1 mg/mL):称取睾酮-D3 、甲基睾丸酮-D3 、勃地龙-D3 、美雄酮-D3 、雄烯二酮- D7 、脱氢异雄酮-D2 、诺龙-D3 、丙酸诺龙-D3 、司坦唑醇-D3 、醋酸美伦孕酮-D3 、黄体酮-D9 各 0. 01 g(精确至 0. 000 01 g) ' 分别置于 10 mL棕色容量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)溶解并定容 ' 混匀 。 于 —18 ℃以下保存 ' 有效期为 6 个月 。 同位素内标标准品等具体信息见附录 A。

　　5 . 10 同位素内标混合标准中间溶液 I (10 μg/mL) :分别准确移取同位素内标储备溶液(5 . 9)各100 μL于 10 mL棕色容量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)稀释 、定容 ' 混匀 。 于 —18 ℃以下保存 ' 有效期为 3 个月 。

　　5 . 1 1 同位素内标混合标准中间溶液 Ⅱ (1 μg/mL) :准确移取同位素内标混合标准中间溶液 I (5 . 10) 1 mL于 10 mL棕色容量瓶中 ' 用乙腈(5 . 2)稀释 、定容 ' 混匀 。 临用现配 。

　　5 . 12 混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液 Ⅱ (5 . 8)于棕色容量瓶中 ' 加入适量同位素内标混合标准中间溶液 Ⅱ (5 . 11) ' 用 50%乙腈溶液(5 . 4)稀释 、定容 ' 混匀 ' 配制成质量浓度分别为1 . 00 ng/mL、5 . 00 ng/mL、10. 00 ng/mL、20. 00 ng/mL、50. 00 ng/mL、100. 00 ng/mL 混合标准系列溶液 ' 同位素内标质量浓度均为 10 ng/mL。 临用现配 。

　　5 . 13 微孔滤膜:0 . 22 μm ' 有机系 。

　　5 . 14 吸附剂:乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) ' 粒径 40 μm ' 或性能相当者 。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源 。

　　6 . 2 天平:精度 0. 000 01 g 和 0. 001 g 。

　　6 . 3 涡旋振荡器:转速不低于 1 500 r/min 。

　　6 . 4 离心机:转速不低于 9 000 r/min 。

　　6 . 5 涡旋混合器 。

　　6 . 6 氮吹仪 。

　　7 样品

　　按 GB/T20195 制备样品 ' 至少 200 g' 粉碎使其全部通过 0. 425 mm孔径的分析筛 ' 充分混匀 ' 装入磨口瓶中 ' 备用 。

　　8 试验步骤

　　8 . 1 提取

　　平行做两份试验 。称取试样 1 g(精确至 0. 001 g)于 50 mL离心管中 ' 准确加入 100 μL同位素内标混合标准中间溶液 Ⅱ (5 . 11) 、20 mL 乙腈(5 . 2) ' 涡旋混匀 1 min ' 1 500 r/min 涡旋振荡提取 20 min ' 9 000 r/min离心 5 min ' 上清液备用 。

　　2

　　GB/T 22260—2023

　　8 . 2 净化

　　移取 3 mL上清液(8 . 1)于 50 mL离心管中 ' 加入 100 mg PSA 粉 ' 涡旋 1 min ' 9 000 r/min 离心5 min ' 准确移取 2 mL上清液于 50 ℃下用氮气吹干 ' 准确加入 1 mL50%乙腈溶液(5 . 4) ' 涡旋混匀 ' 过膜(5 . 13) ' 待测 。

　　8 . 3 测定

　　8 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　液相色谱参考条件如下:

　　a) 色谱柱: C18 柱 ' 长 100 mm ' 内径 2 . 1 mm ' 粒径 2 . 6 μm ' 或性能相当者 ;

　　b) 流动相: A相为乙腈(5 . 2) ' B相为 0. 01%甲酸溶液(5 . 5) ' 梯度洗脱程序见表 1 ;

　　c) 流速:0 . 3 mL/min ;

　　d) 柱温:35 ℃ ;

　　e) 进样量 : 10 μL。

　　表 1 梯度洗脱程序

　　时间min

　　A

　　%

　　B

　　%

　　0 . 00

　　40

　　60

　　2 . 00

　　40

　　60

　　5 . 00

　　100

　　0

　　6 . 50

　　100

　　0

　　6 . 60

　　40

　　60

　　7 . 50

　　40

　　60

　　8 . 3 . 2 质谱参考条件

　　质谱参考条件如下:

　　a) 离子源模式:电喷雾电离源 ;

　　b) 扫描方式:正离子 ;

　　c) 监测方式:多反应监测(MRM) ;

　　d) 电离电压:3 . 0 kv ;

　　e) 源温度 : 150 ℃ ;

　　f) 鞘气 :800 L/H;

　　g) 反吹气 : 50 L/H;

　　H) 雾化器温度 : 500 ℃ 。

　　多反应监测(MRM)离子对 、锥孔电压及碰撞能量见表 2 。

　　3

　　GB/T 22260—2023

　　表 2 蛋白质同化激素及其内标多反应监测(MRM)离子对 、锥孔电压及碰撞能量参考值

　　被测物名称

　　监测离子对m /≈

　　锥孔电压v

　　碰撞能量ev

　　睾酮

　　289 . 0>96 . 9 a

　　32

　　22

　　289 . 0>108 . 5

　　24

　　甲基睾丸酮

　　302 . 9>96 . 9

　　32

　　26

　　302 . 9>109 . 0 a

　　28

　　勃地龙

　　286 . 9>120 . 9 a

　　20

　　22

　　286 . 9>134 . 9

　　14

　　美雄酮

　　300 . 9>92 . 9

　　20

　　32

　　300 . 9>120 . 9 a

　　24

　　雄烯二酮

　　286 . 9>96 . 9 a

　　24

　　20

　　286 . 9>108 . 9

　　26

　　脱氢异雄酮

　　288 . 9>212 . 9

　　12

　　16

　　288 . 9>253 . 0 a

　　10

　　诺龙

　　275 . 0>108 . 9 a

　　30

　　28

　　275 . 0>239 . 0

　　28

　　丙酸诺龙

　　330 . 9>56 . 9

　　26

　　22

　　330 . 9>257 . 0 a

　　12

　　司坦唑醇

　　329 . 0>80 . 9 a

　　40

　　44

　　329 . 0>94 . 9

　　40

　　醋酸美伦孕酮

　　397 . 1>294 . 5

　　25

　　20

　　397 . 1>337 . 1 a

　　15

　　黄体酮

　　314 . 9>96 . 9 a

　　30

　　22

　　314 . 9>108 . 9

　　28

　　睾酮-D3

　　292 . 2>97 . 0 a

　　30

　　22

　　甲基睾丸酮-D3

　　306 . 2>97 . 0 a

　　32

　　28

　　勃地龙-D3

　　290 . 2>121 . 1 a

　　20

　　26

　　美雄酮-D3

　　304 . 5>286 . 2 a

　　20

　　10

　　雄烯二酮-D7

　　294 . 2>113 . 0 a

　　30

　　26

　　脱氢异雄酮-D2

　　291 . 5>273 . 2 a

　　15

　　10

　　诺龙-D3

　　278 . 2>109 . 0 a

　　32

　　30

　　丙酸诺龙-D3

　　334 . 5>257 . 2 a

　　25

　　15

　　司坦唑醇-D3

　　332 . 0>80 . 9 a

　　20

　　44

　　醋酸美伦孕酮-D3

　　400 . 2>337 . 1 a

　　24

　　12

　　黄体酮-D9

　　324 . 3>100 . 0 a

　　30

　　24

　　a 定量离子 。

　　4

　　GB/T 22260—2023

　　8 . 3 . 3 标准系列溶液和试样溶液测定

　　在仪器的最佳条件下 ' 分别取混合标准系列溶液(5 . 12)和试样溶液(8 . 2)上机测定 。混合标准溶液的特征离子质量色谱图见附录 B。

　　8 . 3 . 4 定性

　　在相同试验条件下 ' 试样溶液与标准系列溶液(浓度相当)中蛋白质同化激素色谱峰的保留时间 一致 ' 其相对偏差在 ±2 . 5%之内 。根据表 2 选择的监测离子对 ' 比较试样谱图中蛋白质同化激素监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中监测离子对的相对离子丰度 ' 若偏差不超过表 3 规定的范围 ' 则可判定为样品中存在此蛋白质同化激素 。

　　表 3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

　　%

　　相对离子丰度

　　>50

　　>20~50

　　>10~20

　　≤10

　　最大允许偏差

　　±20

　　±25

　　±30

　　±50

　　8 . 3 . 5 定量

　　以蛋白质同化激素标准溶液浓度为横坐标 ' 蛋白质同化激素与同位素内标峰面积比值为纵坐标 ' 绘制标准曲线 ' 其相关系数应不低于 0. 99 。试样溶液(8 . 2)中蛋白质同化激素的响应值应在标准曲线线性范围内 。如超出范围 ' 应重新试验 。单点校准定量时 ' 试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过 30% 。

　　9 试验数据处理

　　试样中待测物的含量以质量分数 wi 计 ' 数值以毫克每千克(mg/kg)表示 。 多点校准按公式(1)计算 ' 单点校准按公式(2)计算:

　　wi …………………………( 1 )

　　式中:

　　P — 由标准曲线得到的试样液中蛋白质同化激素的质量浓度 ' 单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　v1 — 提取溶液的体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　v3 — 试样的最终定容体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　v2 — 用于氮吹的上清液体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　m — 试样质量 ' 单位为克(g) 。

　　wi

　　式中:

　　A — 试样溶液中蛋白质同化激素的峰面积 ;

　　Ps — 标准溶液中蛋白质同化激素的质量浓度 ' 单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　Ai(I)s — 标准溶液中蛋白质同化激素同位素内标的峰面积 ;

　　Pis — 试样溶液中蛋白质同化激素同位素内标的质量浓度 ' 单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　v1 — 提取溶液的体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　5

　　GB/T 22260—2023

　　V3 — 试样的最终定容体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　As — 标准溶液中蛋白质同化激素的峰面积 ;

　　Ais — 试样溶液中蛋白质同化激素同位素内标的峰面积 ;

　　Pi(’)s — 标准溶液中蛋白质同化激素同位素内标的质量浓度 ' 单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　V2 — 用于氮吹的上清液体积 ' 单位为毫升(mL) ;

　　m — 试样质量 ' 单位为克(g) 。

　　测定结果以平行测定的算术平均值表示 ' 保留三位有效数字 。

　　10 精密度

　　在重复性条件下 ' 两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的 15% 。

　　6

　　GB/T 22260—2023

　　附 录 A

　　(资料性)

　　1 1 种蛋白质同化激素及其同位素内标中英文名称 、化学分子式 、CAS号和纯度

　　11 种蛋白质同化激素及其同位素内标中英文名称 、化学分子式 、CAS号和纯度见表 A. 1 。

　　表 A. 1 1 1 种蛋白质同化激素及其同位素内标中英文名称 、化学分子式 、CAS号和纯度

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　化学分子式

　　CAS号

　　纯度

　　睾酮

　　Testosterone

　　C19 H28 O2

　　58-22-0

　　≥ 98. 0%

　　甲基睾丸酮

　　MetHyl-testosterone

　　C20 H30 O2

　　58-18-4

　　≥97 . 0%

　　勃地龙

　　Boldenone

　　C19 H26 O2

　　846-48-0

　　≥ 93 . 0%

　　美雄酮

　　Metandienone

　　C20 H28 O2

　　72-63-9

　　≥ 99 . 0%

　　雄烯二酮

　　Androstenedione

　　C19 H26 O2

　　63-05-8

　　≥ 99 . 0%

　　脱氢异雄酮

　　DeHydroepiandrosterone

　　C19 H28 O2

　　53-43-0

　　≥ 96 . 0%

　　诺龙

　　Nandrolone

　　C18 H26 O2

　　434-22-0

　　≥ 98. 0%

　　丙酸诺龙

　　Nandrolone 17-propionate

　　C21 H30 O3

　　7207-92-3

　　≥ 98. 0%

　　司坦唑醇

　　Stanozolol

　　C21 H32 N2 O

　　10418-03-8

　　≥ 99 . 0%

　　醋酸美伦孕酮

　　Melengestrol acetate

　　C25 H32 O4

　　2919-66-6

　　≥ 97 . 0%

　　黄体酮

　　progesterone

　　C21 H30 O2

　　57-83-0

　　≥99 . 0%

　　睾酮-D3

　　Testosterone-D3

　　C19 H25 D3 O2

　　77546-39-5

　　≥ 99 . 9%

　　甲基睾丸酮-D3

　　MetHyltestosterone-D3

　　C20 H27 D3 O2

　　96425-03-5