GB/T 45033-2024 饲用微生物制剂中产朊假丝酵母的测定

　　ICS 65.120 CCS B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 45033—2024

　　饲用微生物制剂中产朊假丝酵母的测定

　　Determination of Candida utilis in microbial feed additives

　　2024-11-28 发布 2025-06-01 实施

　　发

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　布

　　GB/T 45033—2024

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 试剂或材料 1

　　5 仪器和设备 1

　　6 采样 1

　　7 试验步骤 2

　　8 试验数据处理 3

　　附录 A (资料性) 培养基 5

　　附录 B (规范性) 生理生化试验 6

　　附录 C (规范性) 分子生物学鉴定 9

　　Ⅰ

　　GB/T 45033—2024

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分 ：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 (SAC/TC 76)提出并归口。

　　本文件起草单位： 山东宝来利来生物工程股份有限公司、安琪酵母股份有限公司、北京大北农科技集团股份有限公司、浙江科峰生物技术有限公司、唐山拓普生物科技有限公司、益海嘉里(防城港) 生物科技有限公司。

　　本文件主要起草人 ：谷巍、单宝龙、徐海燕、谢全喜、辛国芹、汪祥燕、亓秀晔、覃先武、刘雪连、章亭洲、周雪玲、马立周。

　　Ⅲ

　　GB/T 45033—2024

　　饲用微生物制剂中产朊假丝酵母的测定

　　1 范围

　　本文件描述了饲用微生物制剂中产朊假丝酵母(Candida utilis) 菌数的测定方法。

　　本文件适用于含有产朊假丝酵母饲用微生物制剂的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 42959 饲料微生物检验 采样

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 试剂或材料

　　除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

　　4.1 水： GB/T 6682，三级。

　　4.2 0.85% 灭菌生理盐水： 准确称取 8.5 g 氯化钠加入 1 000 mL 水中，搅拌至完全溶解，分装后， 121 ℃灭菌 30 min，备用 。

　　4.3 孟加拉红琼脂培养基 ：见附录 A 中 A.1。

　　4.4 酵母膏胨葡萄糖 (YPD) 琼脂培养基 ：见 A.2。

　　5 仪器和设备

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他仪器设备如下。

　　5.1 培养箱 ：可控精度 ±1 ℃。

　　5.2 天平 ：感量为 0.1 g。

　　5.3 光学显微镜：400 倍～1 000 倍。

　　5.4 拍击式均质器及无菌均质袋。

　　5.5 旋涡混合器。

　　5.6 无菌培养皿 ：直径 90 mm。

　　5.7 聚合酶链式反应(PCR) 仪。

　　6 采样

　　按照 GB/T 42959 执行。

　　1

　　GB/T 45033—2024

　　7 试验步骤

　　7.1 样品稀释

　　7.1.1 固体 、半固体或液体样品： 称取 25 g 样品或以无菌吸管吸取 25 mL 样品，置于装有 225 mL 0.85% 灭菌生理盐水(4.2) 的 500 mL 无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中或无菌均质袋(5.4) 中，充分振摇或用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液。

　　7.1.2 取 1 mL 1:10 样品匀液注入含有 9 mL 0.85% 灭菌生理盐水(4 . 2) 的试管中，在旋涡混合器(5.5) 中混匀，此液为 1:100 的样品匀液。

　　7.1.3 按 7.1.2 操作，制备 10 倍递增系列稀释样品匀液 。每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸管或吸头。

　　7.1.4 将 15 mL～20 mL 冷却至46 ℃~50 ℃ 的孟加拉红琼脂培养基(4.3)(可放置于48 ℃±2 ℃) 倾注于无菌培养皿(5.6) 中，水平放置待琼脂凝固。

　　7.1.5 选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品稀释匀液(液体样品可包括原液) ，吸取 0.1 mL该样品稀释匀液于两个培养皿的孟加拉红琼脂上 。 同时，分别吸取 0.1 mL 0.85%灭菌生理盐水(4.2) 加入另两个培养皿的孟加拉红琼脂上做空白对照。使用无菌涂布棒快速地涂布均匀。

　　7.2 培养

　　涂布结束后水平放置 10 min，将平板倒置，置于 28 ℃±1 ℃ 培养箱(5.1) 中，培养 72 h±2 h。

　　7.3 观察菌落形态

　　典型产朊假丝酵母菌落平坦，表面湿润，菌落表面中心呈白色( 略带浅粉色 )或粉红色，边缘整齐。

　　7.4 菌落计数

　　选取产朊假丝酵母疑似菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

　　7.5 确证

　　7.5.1 菌种纯化

　　挑取同一稀释度的 5 个产朊假丝酵母疑似菌落进行确证试验 。将产朊假丝酵母疑似菌落分别划线转接培养于 YPD 琼脂培养基(4.4) 上，28 ℃±1 ℃ 培养 24 h，获得单菌落纯培养物。

　　7.5.2 形态观察

　　挑选 7.5.1 培养的纯培养物， 于 400 倍光学显微镜(5.3) 下观察菌体形态 。产朊假丝酵母细胞为椭圆形，大小为(3.5～4.5)µm×(7.0～13.0)µm，多边出芽。

　　7.5.3 生理生化试验

　　按附录 B 规定的生理生化试验进行鉴定。产朊假丝酵母菌种主要生理生化特性应符合表 1 的要求。

　　2

　　GB/T 45033—2024

　　表 1 产朊假丝酵母菌种主要生理生化特性

　　试验项目

　　结果

　　糖类发酵

　　D﹘葡萄糖

　　+

　　蔗糖

　　+

　　麦芽糖

　　-

　　半乳糖

　　-

　　乳糖

　　-

　　海藻糖

　　-

　　碳源同化

　　D﹘葡萄糖

　　+

　　D﹘木糖

　　+

　　纤维二糖

　　+

　　蔗糖

　　+

　　松三糖

　　+

　　D﹘山梨醇

　　+

　　注： “+” 表示阳性反应， “ - ” 表示阴性反应 。

　　7.5.4 分子生物学鉴定

　　如有必要按附录 C 进行分子生物学鉴定。

　　8 试验数据处理

　　8.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间时，计算两个平板菌落数的平均值。根据菌落计数结果和证实为产朊假丝酵母的菌落数，计算出平板内的菌数，然后乘其稀释倍数即得每克样中产朊假丝酵母活菌数 N，按公式(1) 计算。

　　N …………………………(1)

　　式中：

　　N ─ 每克或每毫升样品中产朊假丝酵母菌落数，单位为菌落形成单位每克(CFU/g) 或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);

　　A ─产朊假丝酵母疑似菌落数的数值，单位为菌落形成单位(CFU);

　　B ─5个鉴定的菌落中确认为产朊假丝酵母菌落数的数值，单位为菌落形成单位(CFU);

　　f ─稀释倍数的数值，单位为克(g)或毫升(mL);

　　5 ─选出的产朊假丝酵母疑似菌落的数值，单位为菌落形成单位(CFU)。

　　8.2 如两个连续稀释度平板上的菌落数均在 15 CFU～150 CFU 之间时，按公式(2) 计算。

　　N …………………………(2)

　　式中：

　　N ─ 每克或每毫升样品中产朊假丝酵母菌落数，单位为菌落形成单位每克(CFU/g) 或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);

　　3

　　GB/T 45033—2024

　　∑ C ─适宜稀释度平板产朊假丝酵母疑似菌落数的总和，单位为菌落形成单位(CFU);

　　B

　　─5个鉴定的菌落中确认为产朊假丝酵母菌落数的数值，单位为菌落形成单位(CFU);

　　f

　　─低稀释倍数的数值，单位为克(g)或毫升(mL);

　　5

　　─选出的产朊假丝酵母疑似菌落的数值，单位为菌落形成单位(CFU);

　　n1

　　─第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;

　　n2

　　─第二稀释度(高稀释倍数)平板个数。

　　4

　　GB/T 45033—2024

　　附 录 A (资料性) 培养基

　　A.1 孟加拉红琼脂培养基A.1.1 成分

　　蛋白胨

　　5.0 g

　　葡萄糖

　　10.0 g

　　磷酸二氢钾

　　1.0 g

　　硫酸镁(无水)

　　0.5 g

　　孟加拉红

　　0.033 g

　　琼脂

　　20.0 g

　　氯霉素

　　0.1 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A.1.2 制法

　　上述各成分加入水中，加热溶解，用水补足至 1 000 mL，分装后， 121 ℃ 灭菌 15 min，避光保存备用。

　　A.2 YPD 琼脂培养基

　　A.2.1 成分

　　酵母膏

　　10.0 g

　　蛋白胨

　　20.0 g

　　葡萄糖

　　20.0 g

　　琼脂

　　20.0 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A.2.2 制法

　　上述各成分加入水中，搅拌至完全溶解，用水补足至 1 000 mL ，分装后， 121 ℃ 灭菌 15 min ，备用。

　　5

　　GB/T 45033—2024

　　附 录 B (规范性)生理生化试验

　　B.1 糖类发酵

　　B 1.1 糖发酵管

　　B.1.1.1 成分

　　酵母提取物

　　5.0 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　B.1.1.2 制法

　　糖发酵管按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL ，115 ℃ 高压灭菌30 min。 另将葡萄糖 、蔗糖 、乳糖 、半乳糖 、麦芽糖和海藻糖分别配成 20%(m/m) 溶液，过滤除菌 。 将 0.4 mL 上述各种糖溶液和3.6 mL 培养基分别以无菌操作分装于有一个倒置小管的小试管内。

　　B.1.2 试验方法

　　将 7.5.1 培养的纯培养物接种于 YPD 琼脂培养基中， 28 ℃±1 ℃ 培养 24 h，用灭菌水制成细胞悬浮液，调整 A640≈1.0，以每试管 0.1 mL 的量接种于 B.1.1.2 制备的糖发酵管内，摇匀， 28 ℃±1 ℃ 培养2 周，期间观察发酵管内是否有气体积存及其积存量。

　　B.1.3 结果判定

　　产朊假丝酵母糖类发酵观察结果及释义应符合表 B.1 的要求。

　　表 B.1 产朊假丝酵母糖类发酵观察结果及释义

　　观察结果

　　释义

　　+

　　强发酵，7 d内气体迅速充满倒置管

　　L

　　延迟发酵，7 d后倒置管才迅速充满气体

　　W

　　弱发酵，倒置管内有气体，但直到最后也未充满

　　-

　　不发酵，倒置管内无气体积存

　　V

　　同一种内有的菌株发酵，有的不发酵或弱发酵

　　B.2 碳源同化

　　B.2.1 酵母氮源基础( YNB )培养基B.2.1.1 成分

　　硫酸铵 5.0 g

　　L﹘组氨酸盐酸盐 0.01 g

　　LD﹘蛋氨酸 0.02 g

　　LD﹘色氨酸 0.02 g

　　6

　　GB/T 45033—2024

　　生物素

　　0.000 002 g

　　泛酸钙

　　0.000 4 g

　　叶酸

　　0.000 002 g

　　肌醇

　　0.002 g

　　烟酸

　　0.000 4 g

　　对氨基苯甲酸

　　0.000 2 g

　　盐酸吡哆醇

　　0.000 4 g

　　核黄素

　　0.000 2 g

　　盐酸硫胺素

　　0.000 4 g

　　硼酸

　　0.000 5 g

　　硫酸铜

　　0.000 04 g

　　碘化钾

　　0.000 1 g

　　氯化铁

　　0.000 2 g

　　硫酸锰

　　0.000 4 g

　　钼酸钠

　　0.000 2 g

　　硫酸锌

　　0.000 4 g

　　磷酸二氢钾

　　1.0 g

　　硫酸镁

　　0.5 g

　　氯化钠

　　0.1 g

　　氯化钙

　　0.1 g

　　B.2.1.2 制法

　　将上述各成分研磨混合均匀，备用。

　　B.2.2 碳源同化管

　　B.2.2.1 成分

　　酵母氮源基础 (YNB) 培养基

　　6.7 g

　　D-葡萄糖(碳源)

　　5.0 g

　　蒸馏水

　　100 mL

　　B.2.2.2 制法

　　D-葡萄糖同化母液按上述各成分配好后，过滤除菌备用 。分别取 3.6 mL 灭菌水和 0.4 mL D-葡萄糖同化母液以无菌操作分装于小试管内。

　　其他各种碳源需与 5.0 g D-葡萄糖含有等摩尔浓度的碳。

　　B.2.3 试验方法

　　将 7.5.1 培养的纯培养物接种于 YPD 琼脂培养基中， 28 ℃±1 ℃ 培养 24 h，用灭菌水制成细胞悬浮液，调整 A640≈1.0，以每试管 50 µL 的量接种于 B.2.2 制备的碳源同化管内，摇匀， 28 ℃±1 ℃ 培养1 周、2 周和 4 周。取一片白色卡片，其上用墨汁或黑色墨水划上约 0.75 mm宽的直线，将同化管贴在该卡片上，透过培养液观察卡片上的黑线。

　　B.2.4 结果判定

　　产朊假丝酵母碳源同化观察结果及释义应符合表 B.2 的要求，产朊假丝酵母碳源同化结果及释义应符合表 B.3 的要求。

　　7

　　GB/T 45033—2024

　　表 B.2 产朊假丝酵母碳源同化观察结果及释义

　　观察结果

　　释义

　　+++

　　透过试管完全看不见黑线

　　++

　　可见黑线但呈一发散的模糊现条

　　+

　　黑线可见但边缘模糊

　　-

　　黑线清晰可见且边缘不模糊

　　表 B.3 产朊假丝酵母碳源同化结果及释义

　　同化结果

　　释义

　　+

　　强同化，2周内为++或+++

　　L

　　延滞同化，2周后迅速变为++或+++

　　S

　　缓慢同化，2周后缓慢变为++或+++

　　W

　　弱同化，记录为+

　　-

　　不同化

　　(+)

　　少数情况可同化

　　V

　　有些菌株同化反应为+，有些菌株同化反应为-

　　+/W

　　可同化或弱同化，所有菌株都可生长，有些生长较弱

　　W/-

　　弱同化或不同化

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　分子生物学鉴定

　　C.1 原理

　　采用 26S rDNA 的 D1/D2 区序列扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物并测序，将测序结果与GenBank 等国际核酸序列数据库中Candida utilis 序列进行同源性比较，序列一致性≥99% 时，判定为产朊假丝酵母 Candida utilis(Candida utilis 现用名为 Cyberlindnerajadinii)。

　　C.2 纯培养同 7.5.1。

　　C.3 DNA 模板制备

　　利用商业化酵母基因组提取试剂盒制备 DNA 模板。

　　C.4 PCR 反应体系

　　总反应体系体积 为 50 μL：10×PCR 缓冲 液 5 μL、 上下游引物 (25 μmol/L) 各 1 μL、 dNTPs(2.5mmol/L)4 μL、 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、 模板 DNA 2 μL、 灭菌去离子水补足至 50 μL。 每个反应均应设置至少两个平行。

　　注： 反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

　　C.5 PCR 反应条件

　　94 ℃ 预变性 2 min ，94 ℃ 变性 1 min、55 ℃ 退火 1 min、72 ℃ 延伸 1 min、进行 30 个循环， 72 ℃ 延伸 10 min。

　　产朊假丝酵母鉴定用引物应符合表 C.1 的要求。

　　表 C.1 产朊假丝酵母鉴定用引物

　　引物名称

　　扩增引物序列

　　测序引物序列

　　NL1

　　5/﹘GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG﹘3/

　　同扩增引物

　　NL4

　　5/﹘GGTCCGTGTTTCAAGACGG﹘3/

　　C.6 琼脂糖凝胶电泳条件

　　取 5 μL PCR 产物和 2 μL 6×上样缓冲液，混匀后加入上样孔， 80 V 恒压电泳20 min～40 min，凝胶成像系统检测结果。

　　C.7 测序

　　琼脂糖凝胶电泳验证正确的 PCR 产物送测序公司测序。

　　C.8 对照设置

　　检测过程(包括 DNA 提取) 中，每个反应均应设置空白对照。空白对照模板为无菌水。

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　　GB/T 45033—2024

　　C.9 结果判读

　　C.9.1 空白对照的结果判读

　　空白对照无典型扩增条带。否则，结果视为无效。

　　C.9.2 样品的结果判读

　　当检测样品在500 bp～750 bp 出现特征扩增条带时，将测序结果与 GenBank 等国际核酸序列数据库中 Candida utilis 模式菌株标准序列进行同源性比较，序列一致性≥99% 时，判定为产朊假丝酵母(Candida utilis)。

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