GB/T 44342-2024 苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65.020.20 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 44342—2024

　　苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification of

　　Didymella glomerata( Corda ) Qian Chen & L. Cai

　　2024-08-23 发布 2025-03-01 实施

　　发

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　布

　　GB/T 44342—2024

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 苏铁叶枯病菌基本信息 1

　　5 方法原理 1

　　6 试剂、材料和培养基 1

　　6.1 试剂和材料 1

　　6.2 培养基 2

　　7 仪器和用具 2

　　7.1 仪器 2

　　7.2 用具 2

　　8 检疫鉴定方法 2

　　8.1 病害症状 2

　　8.2 病原菌分离培养和形态鉴定 2

　　8.3 分子生物学鉴定 3

　　9 结果判定 3

　　10 样品和档案保存 3

　　10.1 样品保存与处理 3

　　10.2 菌株保存与处理 3

　　10.3 结果记录与资料保存 3

　　附录 A (资料性) 苏铁叶枯病菌的其他信息 4

　　A.1 病害情况 4

　　A.2 寄主范围 4

　　A.3 分布范围 4

　　A.4 传播方式 4

　　A.5 病害症状 4

　　A.6 病原菌形态特征 7

　　附录 B (资料性) 苏铁叶枯病菌培养基配制方法 10

　　B.1 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 培养基 10

　　B.2 燕麦片琼胶(OA) 培养基 10

　　附录 C (资料性) 苏铁叶枯病菌 DNA 提取 11

　　C.1 DNA 提取方法(改良 CTAB 提取法) 11

　　C.2 DNA 纯度与浓度的测定 11

　　Ⅰ

　　GB/T 44342—2024

　　附录 D (规范性) 苏铁叶枯病菌实时荧光 PCR 检测方法 12

　　D.1 引物和探针序列 12

　　D.2 实时荧光 PCR 反应体系 12

　　D.3 结果判定 12

　　附录 E (规范性) 苏铁叶枯病菌 β 微管蛋白 tub2 片段 PCR 扩增方法 13

　　E.1 引物序列 13

　　E.2 PCR 反应体系及参数 13

　　参考文献 15

　　Ⅱ

　　GB/T 44342—2024

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第 1 部分 ：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 (SAC/TC 271)提出并归口。

　　本文件起草单位： 中国检验检疫科学研究院、 中国科学院微生物研究所、深圳仙湖植物园、宁波海关技术中心、福建省热带作物科学研究所、西藏自治区高原生物研究所。

　　本文件主要起草人： 刘芳、黄英、程颖慧、蔡磊、徐晗、段维军、蔡江桥、罗金水、王聪、严进、普布多吉。

　　Ⅲ

　　GB/T 44342—2024

　　苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了苏铁叶枯病菌(Didymella glomerata) 的分离培养 、形态学鉴定 、分子生物学鉴定方法。

　　本文件适用于植物及其产品中苏铁叶枯病菌的筛查鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 苏铁叶枯病菌基本信息

　　学名 ：Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L . Cai

　　异名： Coniothyrium glomeratum Corda, Icon. Fungorum (Prague) 4: 39. 1840.

　　Aposphaeria glomerata (Corda) Sacc. , Syll. Fung. (Abellini) 3: 175. 1884.

　　Phoma glomerata (Corda) Wollenw. & Hochapfel, Z . Parasitenk. 3 (5): 592. 1936.

　　Peyronellaea glomerata (Corda) Goid. ex Togliani, Ann. Sperim. Agrar. Ⅲ 6: 93. 1952.

　　中文学名： 团集亚隔孢壳

　　中文异名 ：葡萄茎枯病菌

　　分类地位： 真菌界 Fungi，子囊菌门 Ascomycota，座囊菌纲 Dothideomycetes，格孢腔菌目 Pleospor﹘ ales，亚隔孢壳科 Didymellaceae，亚隔孢壳属Didymella。

　　苏铁叶枯病菌与亚隔孢壳属中其他物种的形态特征相似，难以单纯依靠形态特征进行区分 。近缘种包括 D. anserina 、D. aurea 、D. musae 等。

　　苏铁叶枯病菌的其他信息见附录 A。

　　5 方法原理

　　根据病害症状、分离菌的形态特征(见附录 A) ，以及实时荧光聚合酶链式反应(PCR) 检测方法或 β 微管蛋白tub2 序列特征对苏铁叶枯病菌进行检测鉴定。

　　6 试剂、材料和培养基

　　6.1 试剂和材料

　　除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。

　　分离培养所需试剂和材料：马铃薯、燕麦片、蒸馏水、葡萄糖、琼脂粉、次氯酸钠、75% 乙醇、无菌水。

　　1

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　　提取 DNA 所需试剂或相应的 DNA 提取试剂盒： 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 提取缓冲液 [2% CTAB, 1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L 乙二胺四乙酸 (EDTA), 100 mmol/L Tris•HCl pH8.0]、 三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70% 乙醇、无菌双蒸水。

　　实时荧光 PCR 所需试剂：2× TaqMan Universal PCR Master Mix、 无菌双蒸水。

　　普通 PCR 和电泳所需试剂：2× Taq PCR Master Mix(含 PCR 缓冲液、dNTPs、 Taq 聚合酶、 MgCl2)、 无菌双蒸水、DL2000 DNA Marker、琼脂糖、GelRed 核酸染料。

　　6.2 培养基

　　马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 培养基，燕麦片琼胶(OA) 培养基，具体配方见附录 B。

　　7 仪器和用具

　　7.1 仪器

　　体视镜、显微镜(放大倍数 400 倍以上)、 培养箱、高压灭菌器、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅 、离心机 、 电子天平 、超纯水仪 、漩涡振荡器 、冰箱 、微量移液器(0.5 µL、2.5 µL、10 µL、 20 µL、200 µL、1 000 µL)、 实时荧光 PCR 仪、常规 PCR 仪、凝胶电泳仪。

　　7.2 用具

　　培养皿 、纱布 、滤纸 、酒精灯 、量筒 、烧杯 、镊子 、载玻片 、盖玻片 、玻璃珠 、 吸头 、离心管(2 mL)、PCR 管(0.2 mL) 等。

　　8 检疫鉴定方法

　　8.1 病害症状

　　观察有无叶枯 、茎枯 、枯萎 、 叶斑 、坏死等症状(见附录 A) ，利用手持放大镜在部分患病植物组织上可见浅棕色至深棕色或黑色的小斑点，即分生孢子器 。 如发现可疑症状，取受害部位进行分离培养。

　　8.2 病原菌分离培养和形态鉴定

　　8.2.1 分离培养

　　采用 PDA 培养基用于病原菌的分离和菌种保存 。 将坏死和健康交界处发病组织剪成 4 mm2 ~ 9 mm2 的小块，依次在 75% 乙醇中消毒 30 s、5%次氯酸钠溶液中消毒 90 s，然后用无菌水冲洗 3 次，灭菌滤纸吸干水分后放置在 PDA 培养基上，将平皿放置在 25 ℃ 培养箱中培养3 d~4 d。挑取疑似菌落边缘的菌丝，转接至 PDA 或 OA 培养基上， 25 ℃ 培养 7 d，必要时采用 12 h 光照/12 h 近紫外光周期性照射以促进分生孢子器的形成。

　　8.2.2 形态鉴定

　　菌落特征 ：在 PDA 培养基上， 7 d 后菌落直径 76 mm~78 mm，菌落正面烟灰色，气生菌丝絮状 、 白色或灰色 ;菌落背面白霜灰色至灰橄榄色。在 OA 培养基上， 7 d 后菌落直径 70 mm，菌落正面烟灰色至灰色橄榄色，气生菌丝绒毛状、 白色至灰色，菌落表面可见黑色分生孢子器和玫瑰色分生孢子堆 ;菌落背面浅鼠灰色。

　　2

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　　显微特征：分生孢子器单生或聚生，球形或近球形，直径 100 μm~300 μm，无毛，表生或半埋生，具乳突，孔口 1 个~3 个。分生孢子器器壁拟薄壁组织状， 由 4 层~7 层等轴细胞组成，外层细胞棕色。瓶梗产孢，无色透明，光滑，多为安瓿状，有时近球形， (3.5~9) μm × (4~8) μm。分生孢子长圆形至圆柱形，有时卵圆形或倒卵形，无色透明，光滑，壁薄，无分隔， (4.5~6.5) μm × (2~3) μm(平均值 = 5.7 μm × 2.3 μm)，部分孢子具油滴。厚垣孢子褐色，顶生，通常为 2 个~20 个或更多的分枝或不分枝链，最初光滑，后来变粗糙，(18~80) μm ×(12~35) μm。

　　形态特征见A.6。

　　8.3 分子生物学鉴定

　　8.3.1 DNA 提取

　　采用基因组提取试剂盒制备 DNA，或采用改良的 CTAB 提取法(见附录 C)。

　　8.3.2 实时荧光 PCR检测

　　采用实时荧光 PCR 特异性引物 DGF/DGR 和 TaqMan 探针 DGP，按照附录 D 对疑似菌株或疑似病害组织样本进行实时荧光 PCR 检测。

　　8.3.3 序列扩增测序

　　利用 tub2 片段的通用引物对疑似菌株 DNA 进行扩增，测序后，将序列在国际权威数据库进行比对，与国际权威数据库中苏铁叶枯病菌的序列进行相似性分析，分析方法按照附录 E。

　　9 结果判定

　　病害症状和分离物的形态特征分别与 8.1 和 8.2 描述的一致，且实时荧光 PCR 检测结果为阳性或tub2 序列与国际权威数据库中苏铁叶枯病菌序列相似性大于 99%，可判定检出苏铁叶枯病菌。

　　10 样品和档案保存

　　10.1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出苏铁叶枯病菌的样品应保存于4 ℃ 冰箱中，以备复核，保存期满后需经高压灭菌后方可处理。

　　10.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为苏铁叶枯病菌的菌株，应妥善保存 。将菌种转入 PDA 斜面和装有灭菌蒸馏水的冻存管，保存于 4 ℃ 冰箱中，至少保存 6 个月以备复核，保存期满后高压灭活处理。

　　10.3 结果记录与资料保存

　　完整的试验记录包括 ：样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法和结果等，并要有试验人员和审核人员签字 。序列扩增应有测序结果文件，实时荧光 PCR 检测应有检测结果照片 。相关资料保存 6 个月以上。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　苏铁叶枯病菌的其他信息

　　A.1 病害情况

　　苏铁叶枯病菌 Didymellaglomerata( 中文学名： 团集亚隔孢壳 ; 中文异名： 葡萄茎枯病菌) 是造成植物叶枯、茎枯、坏死或枯萎等症状的主要病原真菌之一，严重影响植物的生长发育，甚至导致植株死亡。

　　A.2 寄主范围

　　经济作物： 蚕豆(Viciafaba)、 大豆( Glycine max)、 大麦(Hordeum vulgare)、 甘蔗属(Sac﹘ charum sp . )、开心果(Pistacia vera)、 马铃薯(Solanum tuberosum)、 小麦( Triticum aestivum)、燕麦属(Avena sp . )。

　　水果： 番石榴(Psidium guajav)、 柑橘属( Citrus spp . )、荔枝属(Litchi spp . )、苹果属(Mallus sp . )、葡萄科(Vitaceae)、 桃属(Amygdalus sp . )、杏(Armeniaca vulgaris)、 中华猕猴桃(Actin﹘ idia chinensis)。

　　其他植物： 橄榄属( Canarium sp . )、 花旗松( Pseudotsuga menziesii )、 蓝花楹属(Jacaranda sp . )、梨果仙人掌(Opuntia ficus﹘indica)、 苜蓿属(Medicago sp . )、玫瑰(Rosa rugosa)、 山茱萸( Cornus officinalis)、 檀香属(Santalum sp . )、橡皮树(Ficus elastica)、 杨属(Populus sp . )、棕榈属( Trachycarpus sp . )。

　　此外，该病原菌还可侵染人体、动物，或存活于土壤中。

　　A.3 分布范围

　　大洋洲 ：澳大利亚、 巴布亚新几内亚、新西兰。

　　非洲 ：津巴布韦、肯尼亚、马拉维、坦桑尼亚、赞比亚。

　　美洲： 巴西、加拿大、美国、墨西哥。

　　欧洲 ：波兰、德国、俄罗斯、荷兰、立陶宛、瑞典、土耳其、西班牙、希腊、匈牙利。

　　亚洲： 巴基斯坦、马来西亚、缅甸、沙特阿拉伯、伊朗、印度、 中国(零星分布 ：河南省南阳市西峡县、浙江省温州市泰顺县)。

　　A.4 传播方式

　　近距离主要由媒介昆虫和雨水滴溅等方式传播，远距离主要通过带病植株和繁殖材料传播。

　　A.5 病害症状

　　苏铁叶枯病菌造成的植物病害症状见图 A.1~图A.5。

　　4

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　　(来源： Nayab and Akhtar ，2016)

　　图 A.1 苏铁病害症状

　　(来源： Laureano-Ahuelicán 等，2021)

　　图 A.2 梨果仙人掌病害症状

　　5

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　　(来源： Moral 等，2018)

　　图 A.3 开心果病害症状

　　(来源： Pan 等，2018)

　　图 A.4 猕猴桃病害症状

　　图 A.5 大麦病害症状

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　　A.6 病原菌形态特征

　　苏铁叶枯病菌附加模式菌株 CBS 528.66 的形态特征见图 A.6~图A.12。

　　a) 菌落正面 b) 菌落反面

　　图 A.6 在 PDA 培养基上培养 14 d 的菌落形态图

　　a) 菌落正面 b) 菌落反面

　　图 A.7 在 OA培养基上培养 14 d 的菌落形态图

　　图 A.8 分生孢子器

　　7

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　　图 A.9 分生孢子堆

　　(来源： Valenzuela-Lopez 等，2018)

　　图 A.10 厚垣孢子

　　图 A.11 产孢细胞和分生孢子

　　8

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　　图 A.12 分生孢子

　　9

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　苏铁叶枯病菌培养基配制方法

　　B.1 马铃薯葡萄糖琼脂( PDA )培养基

　　称取去皮马铃薯 20 g，切片，加适量蒸馏水煮沸15 min~20 min，双层纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖 20 g、琼脂粉 17 g，加蒸馏水补足至 1 000 mL ，121 °C 高压灭菌 20 min。

　　B.2 燕麦片琼胶( OA )培养基

　　燕麦片 30 g 加水 1000 mL，煮沸 15 min~20 min，用纱布过滤后补足水至 1 000 mL，加入琼脂粉17 g ，121 °C 高压灭菌 20 min。

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　苏铁叶枯病菌 DNA提取

　　C.1 DNA 提取方法(改良 CTAB 提取法)

　　提取步骤如下：

　　a) 取适量菌丝体或病害组织样本(500 mg)和灭菌的玻璃珠放在2 mL离心管中，加入500 μL 2× CTAB(60 ℃) ,置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温30 min~60 min，偶尔振荡混匀;

　　b) 加入 500 μL(1∶1 ，等体积 )三氯甲烷 /异 戊醇 (24∶1) ，上下翻转离心管，混匀， 12 000 r/min离心15 min;

　　c) 提取上清液，加入等体积的三氯甲烷 /异 戊醇 (24∶1) ，上下翻转离心管，混匀， 12 000 r/min离心15 min;重复此步骤一次;

　　d) 提取上清液，加入等体积异丙醇，上下翻转离心管，混匀，沉淀30 min;

　　e) 12 000 r/min离心10 min;

　　f) 弃去液相，加入400 μL 70%乙醇，轻微振荡洗涤， 12 000 r/min离心5 min;重复此步骤一次;

　　g) 弃去液相，超净工作台内干燥DNA，约20 min;

　　h) 加入50 μL或100 μL 双蒸水(视情况而定) 溶解DNA样品，将样品于-20 ℃保存备用。

　　C.2 DNA 纯度与浓度的测定

　　用核酸蛋白检测仪测定 DNA 的纯度与浓度，分别取得 260 nm和 280 nm处的吸光值，计算核酸的纯度和浓度，按照公式(C.1)计算 DNA 纯度，按照公式(C.2) 计算 DNA 质量浓度：

　　conc …………………………(C.1)

　　C = 50 × OD260 …………………………(C.2)

　　式中：

　　conc. ─DNA纯度;

　　C ─DNA质量浓度，单位为微克每毫升 (μg/mL);

　　OD260 ─核酸在260 nm的吸光值;

　　OD280 ─蛋白质在280 nm的吸光值。

　　PCR 级 DNA 溶液的 OD260与 OD280 的比值应为 1.7~1.9。

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　　附 录 D

　　(规范性)

　　苏铁叶枯病菌实时荧光 PCR检测方法

　　D.1 引物和探针序列

　　引物 DGF/DGR 和 TaqMan﹘MGB 探针 DGP 的序列见表 D.1。

　　表 D.1 实时荧光 PCR 引物序列和探针

　　引物和探针

　　序列(5'﹘3')

　　DGF

　　5'﹘TGCATTGCGCTCGCTGTA﹘3'

　　DGR

　　5'﹘GGGCGACCGACAATGGA﹘3'

　　DGP

　　5'﹘FAM﹘TGAGAACCACTTTCTGACAAA﹘MGB﹘3'

　　D.2 实时荧光 PCR反应体系

　　反应体系：0.2 mL 离心管中加入 2×TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL ，DGF(0.6 μmol/L)、DGR (0.6 μmol/L) 各 1.2 μL，探针DGP(0.6 μmol/L)1.2 μL，疑似菌株或疑似病害组织样本的 DNA 模板 1 μL，补水至20 μL。 以苏铁叶枯病菌的 DNA 或含有目标片段的合成质粒作阳性对照、不含苏铁叶枯病菌的 DNA 作阴性对照、 以无菌蒸馏水作空白对照 。将反应体系混合均匀后置于荧光 PCR 仪中进行反应。

　　反应程序：94 °C 10 min ，94 °C 15 s ， 60 °C 60 s ，40 个循环。

　　注： PCR 反应体系中各试剂的量根据具体情况进行适当调整。

　　D.3 结果判定

　　在阴性对照和空白对照无 Ct 值且无扩增曲线、 阳性对照 Ct 值≤30 并出现典型扩增曲线的条件下：

　　—待测样品Ct值≥40时，判定为苏铁叶枯病菌阴性;

　　—待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，判定为苏铁叶枯病菌阳性;

　　—待测样品Ct值在35~40之间时，重新测试 ;增加DNA用量2倍~10倍再次测试，待测样品出现典型扩增曲线，且Ct值≤35，判定为苏铁叶枯病菌阳性 ;否则判定为阴性。

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　　附 录 E

　　(规范性)

　　苏铁叶枯病菌 β 微管蛋白tub2 片段 PCR扩增方法

　　E.1 引物序列

　　引物序列见表E.1。

　　表 E.1 常规 PCR扩增引物

　　目标基因

　　引物名称

　　序列 (5' - 3')

　　扩增片段

　　tub2

　　tub2fd

　　5'-GTBCACCTYCARACCGGYCARTG-3'

　　343 bp左右

　　tub4rd

　　5'-CCRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC-3'

　　E.2 PCR 反应体系及参数

　　E.2.1 PCR 反应体系

　　以 25 μ L 为例 ：0 . 2 m L 离心管中加入 2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正向引 物 tub2fd (10 μmol/L) 和反向引物 tub4rd(10 μmol/L) 各 1 μL ，DNA 模板 1 μL ，ddH2O 9.5 μL。

　　E.2.2 PCR 反应程序

　　PCR 反应程序见表E.2。

　　表 E.2 PCR 反应程序

　　步骤

　　反应温度/℃

　　时间

　　循环数

　　预变性

　　95

　　5 min

　　1

　　变性

　　95

　　30 s

　　35

　　退火

　　52

　　30 s

　　延伸

　　72

　　1 min

　　延伸

　　72

　　10 min

　　1

　　E.2.3 对照设置

　　阳性对照： 以苏铁叶枯病菌的 DNA 样品或含有目标片段的合成质粒为阳性对照。

　　阴性对照： 以健康寄主植物 DNA 为阴性对照。

　　空白对照： 以无菌双蒸水代替 DNA 模板。

　　E.2.4 测序

　　利用表 E.1 中的引物对，对上述 PCR 产物进行序列测定。

　　E.2.5 DNA 序列拼接

　　利用 MEGA 软件或其他序列分析软件，对测序获得的双向峰图文件(后缀名.AB1) 进行拼接 。为确保序列可靠性，首先对测序质量进行评估(如是否有杂峰 、是否双峰 、长度是否与目的条带吻合

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　　等) ，然后去除双向测序结果两端峰形杂乱的低质量序列，再将利用反向引物 tub4rd 测得的序列进行反向互补，最后拼接得到可靠的结果序列。

　　E.2.6 BLAST 结果分析

　　将待测样品序列与已知序列进行相似度比对 。若 BLAST结果显示待测样品序列与已知的苏铁叶枯病菌 Didymella glomerata 或其同物异名Peyronellaea glomerata、Ph oma glomerata 的序列相似性达99%以上，与其他物种相似性小于 99%，可判定为苏铁叶枯病菌。

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　　参 考 文 献

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