GB/T 46249-2025 化学品 快速雄激素干扰活性报告试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46249—2025

　　化学品 快速雄激素干扰活性报告试验

　　Chemicals—Rapid androgen disruption activity reporter(RADAR) assay

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46249—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语 、定义和缩略语 1

　　4 试验原理 2

　　5 受试物信息 2

　　6 参比物 3

　　7 仪器设备 3

　　8 方法概述 3

　　9 试验准备 5

　　10 试验过程 7

　　11 试验的有效性 8

　　12 数据与报告 9

　　13 试验报告 11

　　附录 A (规范性) 试验条件 13

　　附录 B (资料性) 最佳成像设置条件的确定校准 14

　　附录 C (资料性) 收集胚胎 :驯化和批量收集 18

　　附录 D (资料性) 日本青鳉胚胎孵化所需的培养基化学特性 19

　　附录 E (资料性) 鉴别正常与异常游离胚胎的拍摄方法 20

　　附录 F (资料性) 胚胎定位 21

　　附录 G (资料性) 试验数据的统计分析方法 22

　　参考文献 24

　　Ⅰ

　　GB/T 46249—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :上海交通大学 、北京师范大学 、科之华检验检测(福建)有限公司 、江苏省产品质量监督检验研究院 、生态环境部南京环境科学研究所 、生态环境部华南环境科学研究所 、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 、南京财经大学 、中国科学院广州能源研究所 、中检科健(天津) 检验检测有限责任公司 、江苏雅信昆成检测科技有限公司 。

　　本文件主要起草人 :于云 江 、刘 济 宁 、彭 颖 、王 蕾 、刘 洪 英 、顾 爱 国 、刘 晓 建 、范 德 玲 、向 明 灯 、杨 倩 、周丽丽 、丁洁 、刘建梅 、张璐 、丁丰 、黄建梅 、周彤 、杨畅 、王雪芬 、杨光超 、王柳红 、李国晨 、张文轩 、文武 、方齐乐 、李良忠 、刘新会 、刘春艳 。

　　Ⅲ

　　GB/T 46249—2025

　　引 言

　　本文件利用携带 spg1-gfp遗传构建体的转基因品系日本青鳉(Oryziaslatipes,Japanese medaka)的胚胎 ,在多孔板上测定受试物是否具有雄激素干扰活性 ,简称 RADAR 试验(Rapid Androgen Disruption ActivityReporterassay) 。

　　由于日本青鳉雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR) 与人的相关受体表现出构象保守性 , 因此本文件采用携带 spg1-gfp基因遗传构建体的转基因品系 日本青鳉(Oryziaslatipes) 作为受试生物 ,该遗传构建体包含与绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因偶联的 spiggin1 基因的启动子 。Spiggin基因是 一种糖蛋白(黏液状胶质蛋白)的编码基因 ,该糖蛋白产自于性成熟的雄性三棘刺鱼(Gasterosteusaculea- tus)肾脏 。本文件中使用的 spg1-gfp转基因品系是在驱动 GFP 编码序列表达的起始密码子的上游携带 4. 159kb的三棘刺鱼 spiggin1 基因启动子 。 日本青鳉和三棘刺鱼中的 spiggin1 基因都具有组织特异性 ,spg1-gfp转基因品系完全复制了 spiggin1 的特性 , 因此 GFP 仅限在肾脏(中肾)中特异性表达 。

　　本文件的目的在于鉴定受试物在雄激素轴上是否具有潜在活性 , 而不是为了获得用于风险评估的毒性数据(例如无观察效应浓度或效应浓度) 。本文件可用于指导经济合作与发展组织(OECD)关于内分泌干扰物试验框架的第 3层级 ,见参考文献[33] ,OECD第 150号试验指南中试验结果在类群间的解释和外推 。

　　本文件只能采用 spg1-gfp转基因品系 日本青鳉 ,如需使用基于 spiggin1 启动子驱动 GFP表达或报告基因的其他转基因品系 ,则需要进行完整的方法验证 , 以调整相关有效性标准 、统计分析和荧光阈值 。

　　本试验的终点为诱导单个胚胎发出荧光 。与对照组相比 , 当胚胎暴露于受试物后会激活或抑制遗传构建体的转录时 ,胚胎会表达更多或更少的 GFP,从而表现出相应更强或更弱的荧光 。 另一种条件为 ,在有或无 17α-甲基-5α-二氢睾酮(17MT,3 μg/L,作为 AR激动剂)的情况下对受试物进行试验 。 由于胚胎阶段产生的雄激素水平较低 , 因此可在暴露溶液中添加 17MT,用于检测对 17MT可利用性有影响的受试物 ,或对 AR表现出拮抗作用的受试物 。 17MT 浓度筛选试验确定联合暴露的 17MT合适浓度为 3 μg/L和 5 μg/L,所选浓度(3μg/L)对促雄激素和抗雄激素的参考受试物有最高的敏感度 。

　　Ⅳ

　　GB/T 46249—2025

　　化学品 快速雄激素干扰活性报告试验

　　1 范围

　　本文件描述了化学品快速雄激素干扰活性报告的试验方法 。

　　本文件适用于试验和评价受试物的雄激素干扰活性 ,用于测定受试物在含有 spg1-gfp转基因品系日本青鳉(Oryziaslatipes)胚胎中的荧光强度 ; 也 适 用 于 不 挥 发 或 低 挥 发 性 、能 被 精 确 测 定 的 所 有 受试物 。

　　本文件不适用于易挥发的受试物 。

　　注 : 若用于测试混合物 、不明复杂物质(UVCB)或多组分物质 ,则对其成分进行表征 ,例如 ,其成分的化学特性 、定量情况和物质特性 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T

　　21801

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　呼吸计量法试验

　　GB/T

　　21802

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　改进的 MITI试验( Ⅰ )

　　GB/T

　　21803

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　DOC消减试验

　　GB/T

　　21831

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　密闭瓶法试验

　　GB/T

　　21856

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　二氧化碳产生试验

　　GB/T

　　21857

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　改进的 OECD筛选试验

　　GB/T

　　27850

　　化学品

　　快速生物

　　降解性

　　通则

　　3 术语、定义和缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1. 1

　　游离胚胎 eleutheroembryo

　　胚胎孵化后 ,但能独立进食提供的外源性食物之前的胚胎发育的阶段 。

　　注 : 在本试验中定义为 日本青鳉胚胎从发育阶段第 39期(孵化阶段) ~第 42期(捕获猎物所需的结构已形成 ,包括上颌的牙齿 、耳石和所有鳍的形状) 。

　　3. 1.2

　　加标模式 spiked mode

　　在添加 AR激动剂的情况下进行的快速雄激素干扰活性试验 。

　　3. 1.3

　　未加标模式 unspiked mode

　　未添加 AR激动剂的情况下进行的快速雄激素干扰活性试验 。

　　1

　　GB/T 46249—2025

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　AR:雄激素受体(Androgen receptors)

　　DMSO:二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide)

　　DPF:受精后的天数(Day postfertilisation)

　　DPH :孵化后的天数(Day posthatch)

　　GFP:绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein)

　　MS222: 甲基磺酸三卡因(Tricaine methanesulfonate)

　　mDHT:17α-甲基-5α-二氢睾酮(17α-Methyl-5α-dihydrotestosterone)

　　OECD:经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development)

　　RADAR:快速雄激素干扰活性报告(RapidAndrogen Disruption Activity Reporter)

　　UVCB:不明组分复杂物质 、复杂的反应产物或生物材料(Substances of unknown or variable com- position,complex reaction products or biological materials)

　　17MT:17α-甲基睾酮(17α-Methyltestosterone)

　　4 试验原理

　　利用携带 spg1-gfp遗传构建体的转基因品系 日本青鳉(Oryziaslatipes) 胚胎 ,检测具有潜在雄激素干扰活性的受试物 。spg1-gfp 遗传构建体包含与 GFP 的报告基因偶联的 spiggin1 基因的启动子 。

　　将受试生物暴露于受试物后 ,spiggin1 基因的转录可能被激活或抑制 ,GFP报告基因随之以不同程度发出荧光 , 因此能通过对其荧光强度的测定判断受试物是否具有雄激素活性 。本试验是在半静态暴露体系下 ,将含有 spg1-gfp遗传构建体的转基因品系 日本青鳉(Oryziaslatipes) 胚胎在有或无激动剂(3μg/L17MT)联合暴露的情况下(即 “加标模式 ”和 “未加标模式 ”) ,暴露于一定浓度范围的受试物溶液中 。至少设置 5个不同浓度的受试物处理组 , 以及相应空白(培养基和/或溶剂) 对照组 、激动剂对照组 、激动剂 +拮抗剂对照组等 。本文件通过采集转基因 spg1-gfp 青鳉胚胎的 GFP荧光图像 ,并对荧光信号进行定量统计 ,对具有雄激素活性的受试物进行鉴别 。

　　5 受试物信息

　　关于受试物信息的内容包括以下方面 。

　　a) 单组分物质 :物理外观 、水溶性和其他相关物理化学性质 ;化学标识号 ,如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)或化学物质登录号(CAS) 、简化分子线性输入规范(SMILES) 或国际化合物标识(InChI) 、结构式 、纯度 、杂质的化学标识(视情况而定)和实际可行性等(如适用 ,包括有机碳含量) 。还包括光稳定性、试验条件下的稳定性、解离常数(pKa) 、正辛醇-水分配系数(Kow ) 、归趋信息及其在试验系统中快速降解性等信息 ,按 GB/T 27850、GB/T 21801、GB/T 21802、 GB/T 21803、GB/T 21831、GB/T 21856 或 GB/T 21857 的 规 定 确 定 受 试 物 生 物 降 解 性 的内容 。

　　b) 多组分物质 、UVCB 和混合物 : 尽可能表征其化学特性 、定量组分及其成分的相关物理化学性质 。

　　c) 受试物的定量分析方法 ,包括定量限 。

　　d) 关于受试物稳定性或溶解性初步研究的现有数据或结果 。

　　2

　　GB/T 46249—2025

　　e) 胎(在)(λn~) 的(50)荧光范(0nm)(围(λ)E内(X)荧(50)光n的结果(m~50)0;以(n)及(m))在,这些波长下显示有(发 射 波 长 为 500n)但(550)在n胚(m)

　　必要时 ,应了解受试物在试验介质中的溶解性 ,并采用有已知准确性 、精度和灵敏性的有效分析方法定量暴露溶液中的受试物 ,并报告回收率和定量限 。

　　6 参比物

　　在使用本文件之前 ,应采用表 1 中列出的 4种参比物以验证方法的有效性 。

　　表 1 mDHT、利谷隆、头孢呋辛和色苷酸钠参比物信息表

　　参比物

　　CAS号

　　类别

　　试验浓度

　　预期统计显著性限值

　　mDHT

　　521-11-9

　　活性

　　16、8、4、2、1 (μg/L)

　　4 (μg/L)

　　利谷隆

　　330-55-2

　　活性

　　2. 5、1. 25、0. 625、0. 31、0. 16 (mg/L)

　　1. 25 (mg/L)

　　头孢呋辛

　　56328-63-2

　　无活性

　　10、1、0. 1、0. 01、0. 001 (mg/L)

　　无活性

　　色苷酸钠

　　15826-37-6

　　无活性

　　1 000、100、10、1、0. 1 (μg/L)

　　无活性

　　注 : 预期的统计显著性限值是指暴露于测定浓度的参比物处理组与对照相的荧光比值 。这些限值通过 OECD 的RADAR试验验证确定 。

　　7 仪器设备

　　所需仪器设备如下 :

　　a) 培养箱(或其他合适的温度与光照控制设备) ;

　　b) 化学惰性材料制成的透明细胞培养 6孔板 ;

　　c) 如果从下往上成像 ,用底部透明的黑色 96孔板进行荧光定量 ; 如果从上往下成像 ,使用黑色96孔板进行荧光定量 ;

　　d) 酸度(pH)计 ;

　　e) 配备光源的体式显微镜(用于观测受精卵/未受精卵) ;

　　f) 配备 GFP长波通滤光片和彩色照相机的荧光显微镜 ,用于荧光成像和定量 ;

　　g) 图像分析软件 ;

　　h) 适用于受试物的分析设备或外包分析服务 。

　　8 方法概述

　　8. 1 试验设计

　　利用 spg1-gfp遗传构建体的转基因青鳉胚胎(发育至 0 DPH 时期)在有或无 3 μg/L17MT联合暴露的情况下(即 “加标模式 ”和 “未加标模式 ”) ,在 6 孔板中进行受试物暴露 ,每个浓度 3 个平行 ,暴露周期为 72h。每次试验至少设置 5个不同浓度的受试物处理组 , 以及相应空白(培养基和/或溶剂)对照组 、激动剂对照组 、激动剂 +拮抗剂对照组等 。 在半静态暴露体系下 , 每个试验组(包括处理组和对照组)包括 4个孔 ,每个孔使用 5个胚胎 ,共 20个胚胎 ,每天更换暴露溶液(即 24h 和 48h后) 。若受试物为不挥发性物质 ,处理组或对照组可共用同一个孔板 。5个处理组和对照组分别设置 3 个重复试验 ,每

　　3

　　GB/T 46249—2025

　　个重复试验需要使用 280个胚胎 ,3个重复共需要 840个胚胎 。该试验通过荧光成像技术测定转基因spg1-gfp胚胎的 GFP荧光 ,并完成荧光信号的定量统计 。按照附录 A 的内容确定试验条件 。

　　8.2 试验对照

　　8.2. 1 本试验所有对照组的有机溶剂浓度应相同(如适用) ,但尽可能不使用有机溶剂或控制最大溶剂浓度为 100 mg/L(0. 01%) ,选用溶剂 DMSO 时浓度不超过 0. 2% 。

　　a) 空白(培养基)组和/或溶剂对照组 :4 个孔 ,每孔 5 个胚胎暴露于空白培养基中 。该对照组用于确定培养基中的荧光强度水平 。如果使用溶剂 ,则将该组暴露于增加溶剂的培养基 ,溶剂浓度与其他各组浓度相同 。在某些情况下 ,如使用的溶剂没有可用的历史数据 ,则可能需要同时设置空白对照组和溶剂对照组 。

　　b) 3 μg/L 17MT 激 动 剂 对 照 组 : 4 个 孔 , 每 孔 5 个 胚 胎 , 暴 露 于 3 μg/L 的 17MT, 用 于 确 定17MT浓度为 3 μg/L时的荧光强度 。如果需要设 置 下 述 的 附 加 对 照(包 括 1. 5 μg/L 17MT组 、3 μg/L 17MT+ 167 μg/L 氟 酰 胺 组 、3 μg/L 17MT+ 55. 6 μg/L 氟 酰 胺 组 和 3 μg/L 17MT+18. 5 μg/L氟酰胺组) ,则该组的结果可用于附加对照中 17MT标准曲线的计算 ,并可从标准曲线上读出任何具有促雄激素效应的受试物的 17MT 当量值(选做) 。

　　c) 10 μg/L 17MT 激 动 剂 对 照 组 : 4 个 孔 , 每 孔 5 个 胚 胎 , 暴 露 于 10 μg/L 的 17MT, 用 于 确 定17MT浓度为 10 μg/L的荧光强度 。如果需要设置下述的附加对照(见 8. 2. 2) ,则该组的结果可用于附加对照中 17MT标准曲线的计算 ,并可从标准曲线上读出任何具有促雄激素效应的受试物的 17MT 当量值(选做) 。

　　d) 3 μg/L17MT激动剂 +500μg/L氟酰胺拮抗剂对照组 :4个孔 ,每孔 5个胚胎 ,暴露于 3 μg/L的 17MT 和 500 μg/L 的 氟 酰 胺 , 用 于 与 单 独 使 用 17MT 3 μg/L 的 对 照 组 对 比 , 以 确 定500 μg/L浓度氟酰胺的荧光抑制作用 。如果需要设置下述的附加对照 ,则该组的结果可用于附加对照中氟酰胺标准曲线的计算 ,并可从标准曲线上读出作为 AR 拮抗剂的受试物的氟酰胺当量值 ,用于任何在加标模式(存在 3 μg/L的 17MT)下表现出抗雄激素活性的受试物 。

　　8.2.2 由于本试验结果只能证明受试物是否具有雄激素效应相关的活性 ,不要求计算上述的当量值 ,该数据仅供参考 。如果确定要计算相关当量值 ,则每次需设置以下可选的附加对照组 。

　　以下的附加对照组是选做的 ,建议用于实验室参数校准以及质量控制 。

　　a) 1. 5 μg/L17MT:4个孔 ,每孔 5个胚胎 ,暴露于 1. 5 μg/L的 17MT,可确定 17MT浓度为 1. 5 μg/L时的荧光强度 。该对照组可与 3 μg/L 17MT 组和 10 μg/L 17MT组共同用于计算 17MT 标准曲线 。可通过标准曲线 ,计算用于诱导雄性激素轴信号的受试物的 17MT 当量值 。

　　b) 3 μg/L17MT+167μg/L氟酰胺 :4个孔 ,每孔 5个胚胎 ,暴露于 3 μg/L17MT 和 167μg/L的氟酰胺 。该对照组作为氟酰胺标准曲线的一部分 ,用于与单独使用 17MT 3 μg/L的对照组相比 ,确定 167μg/L氟酰胺的荧光抑制作用 。

　　c) 3 μg/L 17MT+55. 6 μg/L氟酰胺 :4个孔 ,每孔 5个胚胎 ,暴露在 3 μg/L 17MT 和 55. 6 μg/L的氟酰胺 。该对照组作为氟酰胺标准曲线的一部分 ,用于与单独使用 17MT 3 μg/L的对照组相比 ,确定 55. 6 μg/L氟酰胺的荧光抑制作用 。

　　d) 3 μg/L 17MT+18. 5 μg/L氟酰胺 :4个孔 ,每孔 5 个胚胎 ,暴露在 3 μg/L17MT和 18. 5 μg/L的氟酰胺 。该对照组作为氟酰胺标准曲线的一部分 ,用于与单独使用 17MT 3 μg/L的对照组相比 ,确定 18. 5 μg/L氟酰胺的荧光抑制作用 。

　　如果试验中使用有机溶剂 ,所有的对照组和试验组都应保证含有相同浓度的溶剂 。此外 ,对照组的试验结果需通过用于读数的成像系统的有效性标准 ,如未通过 ,则试验结果无效 。

　　8.3 试验重复

　　整个试验包括 3个独立重复试验 ,每次试验按照 5 个胚胎/孔 ,4 孔/组的分配运行(见图 1) 。在添

　　4

　　GB/T 46249—2025

　　加或不添加 17MT 的情况下 ,受试物至少设置 5 个浓度处理组 。 每次试验应使用相同的浓度 , 每次平

　　行使用独立的溶液 。应使用在不同批次孵化的胚胎依次进行试验 。通过整合 3 次重复试验结果得到受

　　在 3 次试验均显示阳性反应的情况下不单独展示单个平行下的试验结果 , 以更准确地估计每个试验组

　　试物的原始试验数据 ,每个处理组共包括 60个胚胎(n= 60) , 因此可获得 60个荧光强度的量化数据 。

　　的平均荧光值 。

　　注 : +/-17MT指加标组和未加标组 。

　　图 1 试验概述

　　9 试验准备

　　9. 1 受试生物

　　9. 1. 1 本文件的受试生物是纯合的 spg1-gfp转基因品系 日本青鳉胚胎(由 2 个纯合的 spg1-gfp 日本青鳉交配得到) 。spg1-gfp转基因品系在多个实验室进行培育 , 当受试物在 spg1-gfp 构建体胚胎中可发出荧光时 ,可能还需要使用野生型胚胎来验证受试物是否在该胚胎中发出荧光 ,关于图像拍摄的详细信息见附录 B。

　　9. 1.2 本文件的暴露试验从胚胎发育至 0 DPH 时期开始(26℃约受精后 10 d) 。虽然要求应是0DPH时期胚胎 ,但它们的 DPF可以不同 。单次重复试验中的差异不应超过一个 DPF。 随机选择胚胎用于不同的暴露组 。理想情况下实验室应自行培育胚胎 ,或从其他实验室获取 ,试验开始之前尽可能延长胚胎的适应期 ,试验标准见附录 C。

　　9. 1.3 日本青鳉的饲养 、繁殖和护理在许多资料中都有描述 ,见参考文献[15][20] 、美国环境保护署 日本青鳉养殖指南 。

　　9. 1.4 每一代 spg1-gfp转基因品系都应通过运行全套完整的对照(包括附加对照) 进行验证 ,确保所有有效性符合标准 ,并获得 17MT 和氟酰胺对照的预期响应曲线 。

　　9. 1.5 每年应对随机选择的胚胎的发育阶段进行 1 次质量控制检查 , 以确保试验结束时游离胚胎的发育阶段不高于第 42期 。

　　5

　　GB/T 46249—2025

　　9.2 培养基

　　培养基可以是培养日本青鳉胚胎用水(见附录 D) 、矿泉水 、山泉水 、井水和木炭过滤的 自来水 。 由于不同地区的水质可能有很大差异 , 因此应进行水质分析以排查可能干扰测定结果的潜在污染物(包括重金属)和化学物质 ,尤其是在没有关于水质是否适合饲养日本青鳉的历史数据的情况下 。特别需要注意的是铜 、氯和氯胺 ,这些化学物质对日本青鳉胚胎具有毒性 。培养基中不应使用螯合剂 。水质分析结果应包含在报告中 。适用于日本青鳉胚胎孵育的培养基的化学特性如附录 D 中所列 。 同时 ,任何能够支持日本青鳉正常生长和发育并满足试验有效性标准的培养介质都适合作为培养基 。

　　9.3 喂食

　　该试验使用的 日本青鳉胚胎从发育至 0 DPH 时期开始试验 , 到 3 DPH 时期(约第 40期) 结束试验 。试验前和试验期间都不喂食 ,见参考文献[7] 。胚胎的卵黄囊作为青鳉胚胎发育的能量来源 ,直到发育至第 41期/第 42期仍然存在 。

　　9.4 检测受试物的潜在荧光

　　9. 4. 1 本试验不适用于在激发波长为 450 nm~ 500 nm(λEX=450 nm~ 500 nm) ,发射波长为500 nm~

　　受试物(550nm)。(具(λE)M这(50)两种特性的受试(0nm~550nm))物(的)可(荧)能(光)会(范)诱(围)发(内)荧(自)光(身),并(发)被(出)误(荧)解(光)为(的)GFP(受试物)信,号(以)及,导(可)致(以)受(在)试(胚)物(胎)被(内)错(发)误(出)鉴(荧)定(光)为(的)

　　对雄激素轴有活性 。

　　9. 4.2 鉴定受试物是否在这些波长下发出荧光的方法为 :在 96孔板的 10个孔中分别添加 200μL的受试物溶液 ,浓度为本文件处理组的最高浓度 ,在 96孔板的另外 10个孔中分别添加 200μL的空白介质 ,使用与胚胎荧光成像和定量相同的仪器和设置对荧光进行定量 。通过统计分析评估空白介质和受试物之间的潜在荧光强度差异 。首先 ,进行 D'Agostino-Pearson正态检验 。如果空白介质和受试物的荧光数据均符合正态分布 ,则进行双尾 T-检验 , 以确定两者的荧光数值是否 在 统 计 学 上 具 有 显 著 性 差 异 。如果其中一组或两组数据不符合正态分布 ,则应进行 Mann-Whitney检验 。若鉴定为荧光化学物质 ,应在 26 ℃ ±1 ℃的温度下 ,将 20个野生型 日本青鳉胚胎暴露于这种荧光化学物质 72 h±2 h,每天更换受试物溶液 。然后对荧光进行定量 ,并将其与在相同条件下仅暴露于空白介质的 20个野生型胚胎的荧光强度进行比较 。按照上述统计分析方法 ,对比空白介质与受试物 ,如果两者的荧光强度值在统计学上存在显著性差异 ,则认定该受试物是会发出荧光的 ,并且在胚胎内发出荧光 ,此时本文件不适用该受试物的检测 。如果受试物在未加标和加标模式下均能诱发荧光 ,则存在其已被代谢为荧光代谢物的可能 。在这些情况下 ,应检查图像以确定荧光是否仅限于肾脏 。如果不是 ,则应采用野生型胚胎进行上述暴露的步骤 , 以确定该受试物是否代谢为荧光代谢物 。

　　9.5 试验浓度的选择

　　9.5. 1 确定最高试验浓度

　　9.5. 1. 1 应使用 日本青鳉胚胎进行预试验确定暴露浓度范围 , 以评估可能的毒性 。

　　9.5. 1.2 确定暴露浓度范围的预试验应至少设置 3 个浓度组 。浓度的选择按几何级数排列 ,浓度间隔系数不超过 10倍 。在选定的试验浓度和对照条件下 ,只需进行 1 次试验(20个胚胎/组) 。 预试验可使用野生型或 spg1-gfp转基因胚胎 , 以 5个胚胎/孔的密度 ,在每孔中添加 8 mL 的暴露溶液 ,每个试验组和对照组均为 4孔 。通过整合暴露于相同试验浓度或对照的所有 20个胚胎的数据 ,计算得到死亡(和/或畸形)胚胎的百分比 。暴露浓度范围的确定中 ,设置的最高浓度应导致 10%以上的死亡率(和/或畸形) ,除非最高试验浓度已达到 100 mg/L或达到受试物最大溶解度 。

　　6

　　GB/T 46249—2025

　　9.5. 1.3 应根据受试物在试验介质中的溶解度限值 、最大无毒浓度(MTC) 、在胚胎中引起 10%以上死亡率(和/或畸形)的最大浓度或最大浓度为 100mg/L(以最低者为准)等参考指标确定受试物的最高试验浓度 。

　　9.5.2 试验浓度范围

　　本试验要求受试物至少有 5个试验浓度并通过有效性标准(见 11. 2) 。建议每个相邻试验浓度之间的浓度间隔(间隔系数)为 3倍 ~ 10倍 。

　　9.5.3 受试溶液

　　9.5.3. 1 通常通过稀释储备液得到所设浓度的试验溶液 。将每种试验溶液的 pH 调节至 6. 5~ 8. 0 之间 。配制储备液时 ,应根据需要使用机械方法(如搅拌 、搅动或超声波)或其他适当方法溶解受试物 。对于难以测试的受试物的处理见参考文献[35] 。

　　9.5.3.2 如果确认所使用的溶剂和溶剂浓度能够满足所有有效性标准 ,则尽可能不使用溶剂或限制最大溶剂浓度为 100 mg/L(0. 01%) 。这些有效性标准包括胚胎存活率和对照组的现象 。

　　9.5.3.3 如果使用溶剂 ,所有试验浓度组和对照组中的溶剂浓度应保持一致 。选择的溶剂是否合适取决于受试物的物理化学特性和在预试验中确定的 日本青鳉的敏感性 。考虑溶剂对生殖轴的潜在效应 ,见参考文献[6] 。

　　9.5.3.4 在开展试验的第 1 天配制对照组溶液 ,储存在 4 ℃条件下 ,并在每次更新对照组溶液时使用 ,或每天重新配制 。4 ℃条件下储存的溶液应在温度达到 26 ℃ ±1 ℃后再用于胚胎暴露 , 以防止温度对暴露试验的影响 。根据受试物的稳定性 ,含有受试物的暴露溶液应在试验的第一天配制并储存在 4 ℃下 ,或在每次更新试验溶液之前重新配制 。试验期间 ,对保存在 4 ℃的更新溶液 ,应在溶液更新时进行分析测量 。

　　10 试验过程

　　10. 1 暴露条件

　　10. 1. 1 将胚胎暴露于化学惰性塑料的细胞培养 6 孔板中(通常孔内径为 34 mm、高度为 20 mm) 。 每孔加入 8 mL溶液 ,放置 5 个 胚 胎 。 在 每 次 试 验 中 , 每 个 试 验 浓 度 下 有 20个 胚 胎 。 每 个 对 照 组 包 含20个胚胎 。如果塑料孔板不适用于检测特殊受试物 ,则替换为其他玻璃容器(如小直径皮氏培养皿) 。

　　10. 1.2 在整个试验过程中 ,胚胎在 26 ℃ ±1 ℃的恒温箱中孵育 72 h±2 h,并保持黑暗 。如果在光照周期下进行 ,则需要特定的波长和光强度来限制差异性 。另一优点是适用于测试光敏受试物 。

　　10. 1.3 在每次进行 3个 RADAR试验时 ,都应准备一套新的暴露溶液 。

　　10.2 分析检测

　　采用半静态换液方法 ,需记录受试物浓度的稳定性 。受试物的稳定性的理想情况是应能暴露浓度在 24h 内保持在名义浓度的 ±20%内 。更新暴露液的最长周期为 24h±2h。如果在试验系统中浓度不能维持在 ±20%以内 ,可以考虑缩短更新周期 。对于浓度不能保持在名义浓度 80% ~ 120%范围内的受试物 ,允许使用测量浓度的几何平均值 。

　　10.3 开展试验

　　10.3. 1 第 0 天

　　在胚胎孵化当天(0DPH;约受精后 10 d;温度为 26 ℃) ,将其放入暴露液中 。

　　7

　　GB/T 46249—2025

　　a) 在挑选试验生物时 ,观察胚胎并将出现明显畸形或身体损伤(如尾部损伤 、水肿 、脊柱侧弯) 的胚胎剔除(见附录 E) 。 收集健康和外观正常的胚胎至单独的含有合适体积培养基的容器中 。选择的胚胎应大小均匀 ,将大小差异明显的胚胎去除 。若在 0 DPH 时期健康和正常的游离胚胎数量低于 80% ,则认定该批次胚胎不适用于试验 。应在进行试验之前 ,从该批次中移除死亡和畸形胚胎时确认 。

　　b) 试验开始时 ,按 5胚胎/孔将胚胎放入 6孔板中 ,使用移液管滴入试验培养基 。第 1 次试验时 ,应去除培养基 ,并添加受试物溶液 。注意每次只处理 1个孔板 ,避免胚胎缺水 。

　　10.3.2 第 1 天和第 2 天

　　应在 24h±1h 和 48h±2h更换受试物溶液和对照组溶液 。检查每个孔内的生物是否有异常(损伤 、异常游泳行为等) 。移除死亡生物 、明显畸形或损伤的生物并实施安乐死 ,记录所有观察结果 。在每次试验中 ,如果在 1 个对照组或 1 个处理组中出现超过 10%的累积死亡率和可观察到的亚致死效应 ,而未受影响的试验浓度少于 5个 ,则应停止试验并查明导致死亡或异常的原因 。

　　10.3.3 第 3 天

　　暴露 72 h±2h后 ,对每个生物的荧光强度进行定量 。

　　a) 首先用 8 mL不含受试物的培养基更新试验溶液 ,并移除死亡生物或明显畸形的生物 ,记录所有观察结果 。如果在 1个对照组或 1 个处理组中出现超过 10%的累积死亡率和可观察到的亚致死效应 ,而未受影响的试验浓度少于 5 个 ,则应停止试验并查明导致死亡或异常的原因 。不对异常的试验数据进行分析 。如果需要对胚胎进行麻醉后成像 ,则应在 6 孔板中每孔加入2 mL 1 g/L的 MS222缓冲液 。

　　b) 建议在将胚胎进行成像的所有情况下都进行麻醉 。 只有当它们在自由游动时(如在 96孔板的孔中) ,才不需使用麻醉 。为了避免过度麻醉 , 只应麻醉一个系列中可读取的生物体数量 。 必要时 ,麻醉开始后(1 min~ 5 min) ,将胚胎转移到用于成像的支架上(如黑色塑料表面或黑色96孔板) 。然后用彩色相机和 GFP长波通滤光片进行成像 。使用校准过程中确定的参数 ,应拍摄到包括每个生物体肾脏在内的背侧区域图像 。

　　10.3.4 终止试验

　　在读取荧光强度之后 ,将每个胚胎持续暴露于 1 g/L的 MS222缓冲液中至少 20 min,对其进行安乐死 。

　　11 试验的有效性

　　11. 1 荧光定量分析

　　本试验依赖于对每个胚胎发出的荧光强度进行量化 。为了确保实现适当 、准确的定量 ,应开展预试验 。开展预试验是为了校准荧光成像系统并确保设备可读取合适动态范围的荧光测量值(见附录 B) 。如果使用替代的荧光测量系统 ,参考荧光成像系统的详细说明(见附录 B)对其进行校准和验证 。不过 ,最好使用配备照相机的荧光显微镜 , 因为这样方便对图片进行质量控制 , 以识别定位不佳的胚胎或与雄激素轴激活无关的荧光信号(包括荧光粉或纤维 ,荧光化学物质在胚胎内发出荧光的情况和异常的荧光模式) 。

　　11.2 试验的有效性

　　11.2. 1 为了保证试验结果的有效性 ,每次试验都应满足以下标准 ,不符合这些标准的试验结果无效 :

　　8

　　GB/T 46249—2025

　　a) 溶剂对 照 组 和 10 μg/L 17MT 对 照 组 之 间 测 量 到 的 荧 光 强 度 之 间 具 有 显 著 统 计 学 差 异 , 10 μg/L17MT对照组 的 平 均 荧 光 强 度 值 至 少 为 空 白 对 照 组 或 溶 剂 对 照 组 (如 使 用 溶 剂)的 300% ;

　　b) 在存在和不存在 17MT 的情况下 ,每个对照组和至少 5 个浓度处理组的死亡率和/或畸形率 ,以及胚胎定位不佳导致的无效数据(见附录 F)的总和不超过 10% 。

　　11.2.2 为了使试验有效 ,3组重复试验的整合数据应满足以下标准 ,否则所有 3 个重复的结果都被视为无效 。

　　a) 10 μg/L17MT对照组的平均荧光强度值至少比 3 μg/L 17MT对照组的高 10% 。这可确保17MT 10 μg/L组的平均荧光强度高于 3 μg/L组的平均荧光 ,历史数据表明这对于确保检测的准确性非常重要 。通常 ,两者之间的差异远大于 10% 。

　　b) 3 μg/L17MT对照组和 3 μg/L 17MT+500μg/L氟酰胺对照组之间的荧光抑制具有统计学差异 。

　　c) 对于 3 次重复试验 ,每次试验至少具有 5 个 “数据有效组 ”的试验浓度 。 “数据有效组 ”的鉴定标准如下 :如果 3 次重复试验(每次最好为 20个胚胎) 都通过了有效性标准(死亡率 、和/或畸形率以及胚胎位置不佳(见附录 F)而导致的无效数据的总和不应超过 10%) ,则该处理组(最好为 60个胚胎)可被视为 “数据有效组 ”。

　　如果进行了图像质量控制 ,则这些有效性标准适用于图像质量控制之后 。如果观察到与有效性标准有细微偏差 ,则考虑与试验数据可靠性有关的结果 ,并将这些考虑因素包含在报告中 。

　　12 数据与报告

　　12. 1 数据处理

　　12. 1. 1 在分析之前 ,应从数据中删除从位置不佳的胚胎图像得到的荧光测量值(见附录 F) 。每个处理组胚胎位置不佳导致的综合死亡率和/或畸形率以及无效数据的总和不应超过 10% 。

　　12. 1.2 使用合适的软件处理胚胎的彩色图像 , 提取 GFP 的荧光数值 ,见参考文献[40] 。 为了排除图像中的自发荧光(非 GFP荧光) ,建议将图像的红 、绿和蓝色层分开 。然后从绿色层减去红色层 ,或将红色层的值加倍并从绿色层中减去 ,接着可以对得到的图像应用强度阈值 , 以减少内源性色素沉着造成的背景干扰 。最后对所得图像中所有像素的荧光总和进行量化 。

　　12. 1.3 对于每个有效试验浓度处理组和对照组 ,合并 3 个独立试验的数据 , 以获得 54个 ~ 60个荧光数据 ,最多数据为 60个 。54个值的下限代表每次试验中 10%的死亡率和/或畸形率 , 因此每次平行试验最少获得 18个荧光数据 。

　　12. 1.4 进行 3 次独立重复试验可提高试验的稳定性 。 即使 3 次重复可能会产生不同的结果 ,该测试仍被视为有效 。 只有在根据整合的数据集发现受试物具有活性且观察到非单调浓度响应曲线的情况下 , 3 次独立重复试验的结果才可相互比较 。

　　12. 1.5 如果在试验中使用了溶剂 ,则应对溶剂的潜在影响进行评估 ,具体做法是对溶剂对照组和空白培养基的统计比较 。如果空白培养基和溶剂对照之间没有显著的统计学差异 ,则应使用空白和溶剂的混合对照 。如果在 3 次试验中检测到空白培养基和溶剂对照组之间存在统计学上的显著差异 ,则证明试验失败 。应单独分析每次重复试验 , 以确定溶剂在 3 次重复中的结果是否可重现 。如果显著性差异的确存在 ,则证明试验失败 ,应使用新批次的溶剂或其他溶剂进行新的试验 。所选溶剂是否符合所有有效性标准也应得到验证 。如果有历史数据表明所选溶剂在所选浓度下与空白培养基相比在统计学上没有显著性差异 ,则可能不需要设置空白对照组 。

　　9

　　GB/T 46249—2025

　　12.2 统计分析

　　12.2. 1 选择适用的统计方法 ,见参考文献[24] 。 与对照相比 ,使用双尾假设检验法(p<0. 05) 分析受试物对诱发荧光的影响 。

　　12.2.2 推荐通过 D'Agostino-Pearson正态检验来确定每个暴露组的数据是否符合正态分布 ,如果数据符合正态分布 ,则进行 Dunn’s检验 ,再进行 ANOVA检验 ;如果数据不符合正态分布 ,或违反齐次方差假设 ,则进行 Kruskal-Wallis检验 ,再进行 Dunn’s检验(见附录 G) 。 另外 ,也可使用嵌套 ANOVA分析(也称混合 ANOVA分析)来分析这类数据 ,该方法带有随机效应项 , 可反映每次平行或每个孔带来的差异性 。 随后可进行 Dunnett’s检验等事后检验 , 以确定差异的大小和显著性 。

　　12.3 决策逻辑

　　12.3. 1 本文件制定了决策逻辑流程图 ,为试验和结果解读提供帮助(见图 2) 。该决策逻辑基于 3 次有效重复试验的汇总统计分析 ,如果在 17MT 加标或未加标模式下 ,受试物至少有 1 个试验浓度具有活性 ,并且观察到单调的浓度-响应关系 ,则认为该受试物呈阳性结果 。

　　a) 17MT加标模式中 ,活性浓度的定义是 :与 3 μg/L17MT对照组相比 ,荧光强度显著增加或减少的受试物浓度 。

　　b) 17MT未加标模式中 ,活性浓度的定义是 :与溶剂对照相比 ,荧光强度在统计学上显著增加的受试物浓度 。

　　12.3.2 如果观察到非单调浓度响应 ,则应通过比较 3 次重复试验结果来确认结果的可靠性 。 如果结果不可靠 ,应重复试验 ,可使用不同的浓度范围 , 以验证结果(见图 2) 。如果结果可靠 ,则认为该受试物对雄激素轴具有活性 。如果在第 2 次重复的验证试验中得到相同的结果 ,则本文件可能不适用于该受试物 ,可能需要进行替代试验 。

　　12.3.3 由于胚胎发育阶段难以生 成 可 检 出 的 雄 激 素 水 平 , 因 此 在 未 加 标 模 式 下 不 会 出 现 荧 光 下 降 。如果在未加标模式下观察到荧光强度在统计学上显著降低 ,这可能表明本文件不适用于该受试物 ,或者生物体 、试验条件存在潜在问题 ,需要进一步调查 。应分析单次重复试验 , 以确定 3 次重复中是否存在统计学上的显著荧光下降 ,然后根据专业判断来决定是否重复开展试验 :可选择不重复多次 , 只使用 一批新的胚胎进行一次重复试验 ;或者使用较低的浓度范围进行一次完整的试验 ;或者进行不同的雄激素轴活性试验 。

　　10

　　GB/T 46249—2025

　　图 2 用于解释试验结果的决策逻辑图

　　关于对结果分类群之间的解释和外推 ,见参考文献[33] 。如果荧光强度在未加标模式下有统计学上的显著下降 ,详细描述见 12. 3。

　　13 试验报告

　　13. 1 受试物

　　详细信息按第 5 章的规定 。

　　13.2 受试生物

　　试验报告需要包含受试生物的以下相关信息 :

　　a) 学名 、转基因品系 、供应商或来源 、培养条件 ;

　　b) 试验前从批次中去除的死亡和畸形游离胚胎的百分比 。

　　13.3 试验条件

　　试验报告需要包含试验条件的以下相关信息 :

　　a) 试验程序(例如试验的浓度 、温度 、持续时间 、半静态 、体积 、每毫升的胚胎数量) ;

　　b) 培养基特性的详细信息[参照矿泉水或泉水 、自来水处理说明(如木炭过滤等)]或使用的人工培养基及所做的所有测试 ;

　　c) 储备液的配制方法和更新频率(如使用溶剂 ,应提供溶剂及其浓度信息) ;

　　11

　　GB/T 46249—2025

　　d) 用于暴露的 6孔板和用于荧光成像和定量的所有孔板的品牌和参考资料 ;

　　e) 用于定量的荧光显微镜的参考资料和设置 ,还应提供用于图像分析的方法 。

　　13.4 结果讨论

　　试验报告需要包含对结果讨论的以下相关内容 。

　　a) 确定试验浓度范围的结果 ,可用于确定 MTC和/或为选择用于正式试验的试验浓度 。

　　b) 试验浓度 ,在可能的情况下 ,还应报告为确定试验容器中受试物的浓度而进行的所有化学分析结果 ;如适用 ,报告以适当的统计平均值(例如算术平均值 、时间加权平均值等) 表示测得的暴露浓度 ;还应报告分析方法的回收率和定量限 。

　　c) 报告每次试验中死亡和畸形胚胎的数量 , 以及发生时间 。

　　d) 报告荧光定量原始数据(例如单个荧光原始数据) 。理想情况下 ,收集制表符(tab)格式或逗号分割值(csv) 格式的数据 ,文件中应包含以下数据 : 日期 、受试物名称 、使用浓度 、溶剂 、设备名称 、设备信号收集参数 、实验室名称 、胚胎批号和荧光值 。

　　e) 数据的统计分析和处理方法 ,包括所使用的统计检验 ,是否进行数据审查及原因 。

　　f) 所有满足有效性标准要求的证明材料 。

　　g) 每个试验组(包括所有对照组和受试物浓度组)的荧光平均值及其平均值的标准误差(SEM) ,以图像的形式表示 ,并与样本量一起在表格中显示 。

　　h) 在加标和未加标模式下 ,与其各自的对照组相比 ,每个浓度的荧光值增加或减少的百分比 。

　　i) 需要时 ,提供溶剂潜在影响的评估结果 :溶剂对照组与空白对照组的统计比较(如果包括在本文件中)或先前研究的结果 。

　　j) 其他已观察到的生物效应或测量结果 :报告观察到或测量到的任何其他生物效应(例如 ,行为异常 、畸形或异常色素沉着) 。

　　k) 对任何偏离试验或偏离有效性标准的解释 , 以及对试验结果的潜在后果的考虑 。

　　l) 在适用情况下 ,讨论在加标和/或未加标模式下发现的活性浓度 。

　　m) 得出结论 ,表明受试物对雄激素轴是有活性的还是无活性的 。

　　12

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 A (规范性)试验条件

　　按照表 A. 1 的内容确定本文件所需条件 。

　　表 A. 1 试验条件概述

　　试验参数

　　条件概述

　　受试生物

　　含 spg1-gfp的 Oryziaslatipes胚胎

　　终点

　　单个胚胎的荧光强度值

　　暴露期

　　0 DPH(试验开始) ~ 3 DPH(试验结束)

　　暴露时长

　　72 h±2h

　　暴露方法

　　分别在暴露后 24h 和 48h更换溶液 ,不喂食

　　pH

　　6. 5~ 8

　　暴露期间培养条件

　　26 ℃ ±1 ℃ , 暗

　　每个浓度组的生物个体数量

　　每孔 5个胚胎(6孔板) × 4个孔(每个浓度组共 20个胚胎)

　　培养基体积

　　每孔 8 mL

　　培养基

　　水溶液 ,可支持 Oryziaslatipes正常生长和发育(见 9. 2)

　　试验次数

　　用新配制的溶液对每种受试物进行 3 次试验

　　选择受试生物的标准

　　发育阶段(0DPH) 、受试生物健康(活的 、无畸形)

　　有效性标准

　　每次试验 :所有对照组的死亡率和/或畸形小于或等于 10% 。

　　在 17MT 10 μg/L对照组和溶剂对照组中 ,荧光诱导率大于 300% 。

　　对于 3 次重复的试验组 :17MT 10 μg/L对 照 组 的 荧 光 诱 导 率 大 于 10% 。应 观 察 到17MT 3 μg/L对照组的浓度-响应关系(见 11. 2)

　　至少包含 5个 “数据有效 ”

　　的试验浓度

　　“数据有效 ”的认定标准为 :

　　a) 当单次重复试验 组 的 胚 胎 死 亡 率 和 畸 形 合 并 小 于 或 等 于 10% , 该 试 验 浓 度 组(20个生物体)被认为在本次试验中是 “数据有效组 ”;

　　b) 当 3 次 重 复 中 的 每 一 次 均 被 认 为 “数 据 有 效 组 ”时 , 该 试 验 浓 度 被 视 为 “数 据有效 ”

　　对照组

　　培养基和/或溶剂对照组

　　培养基和/或培养基 +溶剂

　　17MT激动剂对照组

　　17MT(3μg/L,10 μg/L)

　　17MT+氟他胺拮抗剂对照组

　　17MT(3μg/L) +氟他胺(500μg/L)

　　13

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 B

　　(资料性)

　　最佳成像设置条件的确定校准

　　B. 1 图像校准设置

　　校准的目的是虽然采集试验结果的成像设备不同 ,但确保所有实验室对参比物 17MT 和氟他胺获得相似的响应程度和灵敏度 。

　　校准的两个步骤 :

　　a) 确定最佳成像设置条件 ,使浓度为 50 μg/L的 17MT获得合适的 GFP诱导结果 ;

　　b) 将这些设置应用于 17MT 和氟他胺的 3 次浓度反应试验 , 以通过使用增加的 17MT 和氟他胺浓度以及诱导可检测的 GFP反应的最低浓度的 17MT或氟他胺来检查诱导的幅度 。

　　以下两个步骤描述的操作中所有暴露溶液使用 0. 2%的 DMSO。仅作示例 ; 可使用替代溶剂进行相同的试验操作 。如果在进行本文件试验时更换了溶剂 ,或首次试验时没有使用溶剂 ,则校准过程不需要重复 。

　　B.2 选择图像拍摄设置

　　B.2. 1 配制暴露溶液 。

　　a) 试验组由 10个孔组成 ,每孔 5个 spg1-gfp转基因 日本青鳉鱼的胚胎 。

　　b) 所有孔中 DMSO 的最终浓度为 0. 2% 。

　　c) 配制 50 mg/L 17MT 的 DMSO溶液 :

　　1) 将 50 mg/L的 17MT溶液均分 ,每份 200 μL;

　　2) 均分溶液在 -20℃下保存 ,不超过 2个月 。

　　d) 配制含有 0. 2% DMSO 的 50 μg/L 17MT 的以下暴露溶液 :

　　1) 空白培养基 100 mL;

　　2) 含 17MT 50 mg/L的 DMSO 100 μL;

　　3) DMSO 100 μL。

　　B.2.2 开始暴露 :

　　a) 向每个孔中添加 5个 spg1-gfp转基因 日本青鳉鱼胚胎 ;

　　b) 在胚胎不缺水的情况下尽可能将液体完全去除(剩余量不超过 800μL) ;

　　c) 每个孔添加 8 mL暴露溶液 ;

　　d) 在黑暗中于 26 ℃下孵育孔板 ,试验期间 ,不能喂食 。

　　B.2.3 在 24h 和 48h更换暴露溶液 :

　　a) 记录死亡率 ,并移除所有死亡胚胎 ;

　　b) 根据 B. 2. 1 配制暴露溶液 ;

　　c) 去除最大体积的溶液 ;

　　d) 每个孔添加 8 mL暴露溶液 ;

　　e) 在黑暗中于 26 ℃下孵育孔板 ,试验期间 ,不能喂食 。

　　B.2.4 72 h 时期润洗胚胎 :

　　a) 准备含有 8 mL水的 6孔润洗板 ,可使每个孔中的胚胎正常生长和发育 ;

　　b) 将暴露组孔板中的所有胚胎转移至润洗孔板中 。

　　B.2.5 72 h 时期观察胚胎 。

　　14

　　GB/T 46249—2025

　　a) 必要时 ,在 6孔板的每孔暴露于 50 μg/L 17MT 的胚胎中加入 2 mL 浓度为 1 g/L的 MS222用于麻醉 。注意 1 次只能麻醉 1块孔板 。

　　b) 放置好胚胎 ,使成像系统可以对背侧进行成像 。

　　c) 调整荧光显微镜的变焦和聚焦,以确定允许两个肾脏成像的最大变焦 。

　　d) 检查孔板上的其他胚胎 , 以确保所选的缩放使两个肾脏在同一幅图像中显示 。 否则 ,则重新调整缩放 ,重新开始该过程 。

　　e) 如果可能 ,重置相机的白平衡 。

　　f) 将相机的增益设置为零 ,并调整曝光时间 ,调整到肾脏尽可能明亮而不显白 。

　　g) 如果曝光需要设置在 100 ms 以上 , 以导致 GFP信号饱和(GFP信号中的白色区域) ,则增加增益并重新启动 。

　　h) 检查孔板上的其他胚胎 , 以确保选定的暴露时间不会导致肾脏的很大一部分变白 。 否则 ,则重新调整缩放 ,重新开始该过程 。

　　i) 保存并记录相机的选定设置 ,并保存设置文件 , 以便在以后的每次成像过程中调用 。

　　j) 拍摄每个胚胎的图像 。

　　k) 拍摄完所有图像后 ,对胚胎进行安乐死 。

　　l) 根据第 12章的说明对图像进行分析 。

　　m) 暴露于雄激素后的胚胎的示例图像(背侧视图)见附录 F。

　　B.3 测定 17MT和氟他胺的线性和灵敏度

　　B.3. 1 配制暴露溶液

　　暴露溶液的配制及保存方式如下 。

　　a) 每个试验组由 4个孔组成 ,每孔 5个 spg1-gfp转基因 日本青鳉鱼胚胎 。

　　b) 所有孔中 DMSO 的最终浓度均为 0. 2% 。

　　c) 配制 10 mg/L 17MT 的 DMSO溶液 :

　　1) 将 10 mg/L17MT溶液均分 ,每份溶液为 200 μL;

　　2) 均分的溶液在 -20℃下保存 ,不超过 2个月 。

　　d) 配制 500 mg/L氟他胺溶于 DMSO 的溶液 :

　　1) 将 500 mg/L氟他胺溶液均分 ,每份溶液 200 μL;

　　2) 将均分的溶液在 -20℃下保存 ,不超过 2个月 。

　　根据表 B. 1 配制试验溶液 。

　　表 B. 1 试验溶液和中间溶液的配制

　　溶液名称

　　最终浓度μg/L

　　准备的

　　中间体积

　　mL

　　混合溶液

　　最终

　　体积

　　mL

　　含 0. 1% DMSO 的培养基

　　无

　　300

　　300 mL培养基 +300μLDMSO

　　20

　　溶剂对照

　　无

　　70

　　含 0. 1% DMSO 的 70 mL培养基 +70μLDMSO

　　45

　　17MT 10 0. 1% DMSO

　　无

　　175

　　175 mL培养基 +175μL 17MT 10 mg/L

　　35

　　17MT 3 0. 1%DMSO

　　无

　　300

　　90 mL含 0. 1% DMSO 的 17MT 10+含 0. 1% DMSO的 210 μL培养基

　　10

　　17MT 10

　　10

　　50

　　50 mL含 0. 1% DMSO 的 17MT 10+50μLDMSO

　　50

　　15

　　GB/T 46249—2025

　　表 B. 1 试验溶液和中间溶液的配制 (续)

　　溶液名称

　　最终浓度μg/L

　　准备的

　　中间体积

　　mL

　　混合溶液

　　最终

　　体积

　　mL

　　17MT 3

　　3

　　220

　　220 mL含 0. 1% DMSO 的 17MT 3+220μLDMSO

　　45

　　17MT 1. 5

　　1. 5

　　50

　　25 mL 17MT 3+25mL溶剂对照

　　50

　　氟他胺 500

　　500

　　70

　　70 mL 含 0. 1% DMSO 的 17MT 3+ 70 μL 氟 他 胺500 mg/L

　　45

　　氟他胺 167

　　167

　　75

　　25 mL氟他胺 500+50 mL 17MT 3

　　50

　　氟他胺 55. 6

　　55. 6

　　75

　　25 mL氟他胺 167+50 mL 17MT 3

　　50

　　氟他胺 18. 5

　　18. 5

　　75

　　25 mL氟他胺 55. 6+50 mL 17MT

　　75

　　B.3.2 试验组

　　试验组的具体分组如下 :

　　a) 溶剂对照(含 0. 2% DMSO 的培养基) ;

　　b) 含 0. 2% DMSO 的 17MT 1. 5 μg/L;

　　c) 含 0. 2% DMSO 的 17MT 3 μg/L;

　　d) 含 0. 2% DMSO 的 17MT 10 μg/L;

　　e) 氟他胺 18. 5 μg/L+含 0. 2% DMSO 的 17MT 3 μg/L;

　　f) 氟他胺 55. 6 μg/L+含 0. 2% DMSO 的 17MT 3 μg/L;

　　g) 氟他胺 167μg/L+含 0. 2% DMSO 的 17MT 3 μg/L;

　　h) 氟他胺 500 μg/L+含 0. 2% DMSO 的 17MT 3 μg/L。 B.3.3 暴露阶段

　　B.3.3. 1 开始暴露 :

　　a) 在每孔添加 5个 spg1-gfp转基因胚胎 ;

　　b) 在胚胎不缺水的情况下移除最大体积的液体(最大剩余体积 800μL) ;

　　c) 继续处理对照组 、17MT组和 17MT+氟他胺组 ;

　　d) 每个孔添加 8 mL暴露溶液 ;

　　e) 在黑暗中于 26 ℃下孵育孔板 ,试验期间 ,不能喂食 。 B.3.3.2 在 24h 和 48h更新暴露液 :

　　a) 记录死亡率 ,并移除所有死亡胚胎 ;

　　b) 根据 B. 2. 1 配制暴露溶液 ;

　　c) 使用软移液管移除最大体积的液体 ;

　　d) 每个孔添加 8 mL暴露溶液 ;

　　e) 在黑暗中于 26 ℃下孵育孔板 ,试验期间 ,不能喂食 。 B.3.3.3 在 72 h润洗胚胎 :

　　a) 准备 6孔润洗板 ,每孔含有 8 mL脱氯水或矿泉水 ;

　　b) 将暴露组的所有胚胎从暴露板转移到润洗板 ;

　　c) 将润洗板运送至将进行读数的位置 。

　　16

　　GB/T 46249—2025

　　B.3.3.4 在 72 h观察胚胎 :

　　a) 加载第 1 步校准试验结束时保存的图像拍摄参数 ;

　　b) 如有必要 ,在 6孔板的每孔中加入 2 mL 浓度为 1 g/L的 MS222,麻醉暴露于溶剂对照溶液的胚胎 ;

　　c) 注意 1 次只能麻醉 1块孔板 ;

　　d) 如果需要 ,在麻醉开始后(1 min~ 5 min) ,将胚胎转移到用于成像的载体上 ,如黑色塑料表面或透明底部黑色 96孔板 ;

　　e) 放置好胚胎 , 以便成像系统可以对背侧进行成像 ;

　　f) 拍摄每个胚胎的图像 ;

　　g) 在拍摄暴露组的所有图像后 ,对胚胎进行安乐死 ;

　　h) 继续拍摄 ,直到完成所有组的拍摄 ;

　　i) 根据第 12章的说明分析图像 。

　　B.3.4 结果分析

　　对得到的结果进行以下分析 :

　　a) 汇总数据进行统计分析并绘制图表 ,注意 17MT 和氟他胺的最低 LOEC;

　　b) 17MT 的 LOEC至少为 3 μg/L,氟他胺的 LOEC至少为 500 μg/L;

　　c) 17MT 和氟他胺在浓度试验范围内应呈现浓度-响应关系 ;

　　d) 如果由于低浓度时灵敏度低或较高浓度时信号饱和 , 和浓度-响应关系不明显 ,则调整图像拍摄参数以改善浓度-响应关系 。

　　17

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 C

　　(资料性)

　　收集胚胎:驯化和批量收集

　　试验所需胚胎最迟在试验开始前 3 天收集 , 以便恢复和适应 ;从接收胚胎到暴露开始时间内 ,死亡或异常胚胎数量少于总数的 20%时 ,才可收集该批胚胎 。

　　试验开始前 3 天收集胚胎方法 。

　　a) 不同受精日期的胚胎不宜混用 。

　　b) 对胚胎进行分类 , 以去除死亡和异常胚胎且少于 20% ,否则该批次不适用于本文件试验 。

　　c) 如将正常胚胎转移到 1 L玻璃容器或 15 cm 培养皿中 ,培养皿中装有适合培养 日本青鳉胚胎的培养基(见附录 D) 。

　　d) 每个玻璃容器的最大密度为 500个胚胎 ,每个培养皿的最大密度是 200个胚胎 。

　　e) 在约 26 ℃的温度和 14h ∶ 10 h 的光暗周期下孵育胚胎 。 根据需要调整孵化温度 ,控制胚胎在 9 DPF或 10DPF时期左 右 孵 化 最 佳(胚 胎 在 7DPF~ 12 DPF期 间 孵 化 均 符 合 试 验 开 展要求) 。

　　f) 试验所需胚胎为 0 DPH 时期胚胎 ,但允许 0 DPH 时期胚胎的受精天数不同 。在单次重复试验中 ,所有试验胚胎的受精天数差异不超过 1 d。不同暴露组随机选用胚胎 。

　　g) 在胚胎发育至孵化期间 ,胚胎培养基至少更换 1 次 。

　　18

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 D

　　(资料性)

　　日本青鳉胚胎孵化所需的培养基化学特性

　　适合青鳉胚胎孵化的培养基参数见表 D. 1。

　　表 D. 1 适合青鳉胚胎孵化的培养基参数要求

　　指标

　　推荐范围

　　允许范围

　　脱氯

　　—

　　必要的

　　颗粒过滤

　　25 μm

　　推荐

　　活性炭过滤

　　—

　　推荐

　　电导率

　　230 μS~ 290 μS

　　温度

　　26 ℃

　　26 ℃ ~ 30 ℃

　　亚甲基蓝

　　每升培养基添加 1 mL 1 g/L的储备液

　　推荐

　　pH

　　7. 2~ 8. 2

　　必要的

　　注 1: 如果使用人工培养基 ,采用经 OECD 国际实验室间验证的 人 工 培 养 基 ,用 反 渗 透 水 稀 释 10倍 培 养 基 储 备液以获得 1倍的工作溶液 ,并用 1 mol/L的 NaOH 溶液将 pH 调节至 7. 2~ 8. 0 之间 。其中 10倍培养基储备液成分包括 :5 g/L NaCl、0. 151g/LCaCl2 、0. 098g/LMgSO4、0. 15 g/LKCl。

　　注 2: 除了人工培养基 ,采用玻璃瓶装矿泉水 、泉水 、井水 、木炭过滤的 自来水或任何支持青鳉正常生长和发育的培养基都适合培养青鳉胚胎 。

　　19

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 E

　　(资料性)

　　鉴别正常与异常游离胚胎的拍摄方法

　　图 E. 1 列出了正常和异常胚胎的代表性图像 ,用于参考鉴别正常与异常游离胚胎的拍摄方法 。

　　标引序号说明 :

　　A— 为正常游离胚胎 ;

　　B— 异常胚胎 。胚胎较小 ,长度明显比同批次的其他胚胎短 ;

　　C— 异常胚胎 。部分孵化 ,胚胎尚未完全从卵中孵出 ;

　　D— 异常胚胎 。发育不良 ,孵化的青鳉胚胎都观察到非常大的卵黄囊 ,但仍呈球形 ;

　　E— 异常胚胎 。发育不良 ,孵化的青鳉胚胎也观察到相对较大的卵黄囊 ,但仍呈球形 ; F— 异常胚胎 。 畸形 ,尾部向下弯曲 。放大倍数为 20倍 。

　　图 E. 1 识别正常和异常胚胎的拍摄方法

　　20

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 F (资料性)胚胎定位

　　如果胚胎的位置可对背侧区域(包括肾脏的位置)进行成像 ,则该定位是正确的 ,拍摄图像见图 F. 1。图中为两个 spg1-gfp青鳉胚胎背侧图像 ,胚胎肾脏中显示 GFP信号 。胚胎朝向图像的右侧 。放大倍数为 20倍 。

　　图 F. 1 用于成像的胚胎的预期定位

　　21

　　GB/T 46249—2025

　　附 录 G

　　(资料性)

　　试验数据的统计分析方法

　　采用的统计方法首先进行 D'Agostino-Pearson正态检验以确定每个暴露组的数据是否呈正态分布 。为确定方差是否均匀 ,应进行方差齐性检验(如 Levene’s检验) 。 比较两组及以上的试验结果统计分析流程见图 G. 1。

　　如果数据呈正态分布且不违反方差齐性假设 ,则对未加标模式下的受试物处理组和空白对照(如未使用溶剂 ,则为试验介质对照 ;如使用溶剂 ,则为溶剂对照)进行 ANOVA检验 ,然后进行 Dunnett’s 事后检验 。 同样 ,应对加标模式下的 受 试 物 处 理 组 和 17MT 3 μg/L对 照 进 行 ANOVA 检 验 , 然 后 进 行Dunnett’s 事后检验 。

　　如果数据符合正态分布但方差非齐次 ,则应执行 Kruskal-Wallis检验 ,再执行 Dunnett’s 事后检验或 Welchsl多对一比较检验 。

　　如果数据不符合正态分布 ,则应对未加标模式下的受试物处理组和空白对照(若未使用溶剂 ,则为溶剂对照或试验介质对照)进行 Kruskal-Wallis检验 ,再进行 Dunnett’s 事后检验 。 同样 ,对加标模式下的受试物处理组和 17MT 3 μg/L对照进行 Kruskal-Wallis检验 ,再进行 Dunnett’s 事后检验 。

　　图 G. 1 比较两组及以上的试验结果统计分析流程

　　另外 ,如果在试验期间记录了孔信息 ,也可以使用嵌套 ANOVA 检验(也称为混合 ANOVA) 来分析这类数据 ,其中的随机效应项应考虑到试验或孔带来的可变性 。 随后进行事后检验如 Dunnett’s检验 , 以确定差异的大小和显著性 。

　　如果仅比较两组数据 ,例如 3 μg/L17MT激动剂对照组和 3 μg/L 17MT+500 μg/L氟酰胺拮抗

　　22

　　GB/T 46249—2025

　　剂对照组 ,则首先通过 D'Agostino-Pearson正态检验 , 以确定每个暴露组的数据是否为正态分布 。 如果每个暴露组的数据均为正态分布 ,则应进行 Welch 校正的 t检验 。如果一个或两个暴露组的数据不符合正态分布 ,进行 Mann-Whitney检验 。

　　23

　　GB/T 46249—2025

　　参 考 文 献

　　[1] Borg, B. , Antonopoulou, E. , Andersson, E. , Carlberg, T. , Mayer, I. (1993) . Effectiveness of several androgens in stimulating kidney hypertrophy, a secondary sexual character, in castrated male three spined sticklebacks,Gasterosteusaculeatus. Can.J. Zool.7,2327-2329.

　　[2] Cui, J. , Shen, X. , Yan, Z. , Zhao, H. , and Nagahama, Y. (2009) . Homology-modeled ligand- binding domains of medaka estrogen receptors and androgen receptors: a model system for the study of reproduction. Biochem. Biophys.Res.Commun. 380,115-121.

　　[3] Hahlbeck, E. , Katsiadaki, I. , Mayer, I. , Adolfsson-Erici, M. ,James,J. , and Bengtsson, B.-E. (2004) . Thejuvenile three-spined stickleback (GasterosteusaculeatusL. ) asa modelorganism for en- docrine disruption Ⅱ-kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction. Aquat. Toxicol. 70, 311-326.

　　[4] Horie, Y. , Watanabe, H. , Takanobu, H. , Yagi, A. , Yamagishi, T. , Iguchi, T. , and Tatarazako, N. (2017) . Development of an in vivo anti-androgenic activity detection assay using fenitrothion in Japanese medaka (Oryziaslatipes) .J. Appl.Toxicol.37,339-346.

　　[5] Hornung M. W. , Cook P. M. , Fitzsimmons P. N. , KuehlD. W. , Nichols J. W. (2007) . Tissue distribution and metabolism of benzo[a] pyrene in embryonic and larval medaka (Oryziaslatipes) . Toxicol.Sci.100,393-405.

　　[6] Hutchinson,T. H. ,Shillabeer,N. ,Winter,M.J.,and Pickford,D. B. (2006) . Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A criticalreview. Aquat.Toxicol.76,69-92.

　　[7] Iwamatsu, T. (2004) . Stages of normal development in the medaka Oryziaslatipes. Mech. Dev. 121,605-618. Iwamatsu,T. ,Kobayashi, H.,and Yamashita,M. (20