GB/T 45350-2025 实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法

　　ICS 65. 020.30 CCS B 44

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 45350—2025

　　实验动物 近交系小鼠、大鼠 SNP

　　标记检测法

　　Laboratory animal—Singlenucleotidepolymorphismsmarkermethodsfor

　　inbred miceand rats

　　2025-02-28发布 2025-02-28实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 45350—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国食品药品检定研究院 、上海实验动物研究中心 、陕西省中医药研究院 、山西医科大学 、广东省实验动物监测所 。

　　本文件主要起草人 :魏杰 、王洪 、岳秉飞 、赵莹 、李欢 、周佳琪 、赵丽亚 、汤建平 、姚养正 、宋国华 、王静 、范春 、陈国强 。

　　Ⅰ

　　GB/T 45350—2025

　　引 言

　　0. 1 本文件的发布机构提请注意 ,声明符合本文件时 ,可能涉及到 6. 2 近交系大鼠检测(LDR法) 与大鼠 SNP位点检测近交系大鼠相关的专利的使用 。

　　本文件的发布机构对于该专利的真实性 、有效性和范围无任何立场 。

　　该专利持有人已向本文件的发布机构承诺 ,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下就专利授权许可进行谈判 。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 。相关信息可以通过以下联系方式获得 :

　　专利持有人姓名 :赵莹 、汤建平 、赵丽亚 、聂艳艳 、姜珊 、范春 、陈国强 、顾晓雪 、沈淼 、冯艳 。

　　地址:上海市浦东新区金科路 3577号 。

　　请注意除上述专利外 ,本文件的某些内容仍可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　0.2 遗传背景明确是近交系小鼠 、大鼠能够应用于生产 、检定 、研发等各领域的先决条件 。 为了提升实验小鼠 、大鼠的遗传质量与标准化水平 ,我国已发布实施了 GB/T 14927. 1《实验动物 近交系小鼠 、大鼠生化标记检测法》和 GB/T 14927. 2《实验动物 近交系小鼠 、大鼠免疫标记检测法》,这两项标准的检测方法限于蛋白水平 ,难以实现近交 系 小 鼠 、大 鼠 多 品 系 尤 其 是 亚 系 的 鉴 别 评 价 。 GB 14923《实 验 动物 遗传质量控制》推荐了使用分子生物学方法进行遗传质量监测 ,但没有相应的技术方法 。 因此 ,本文件通过相关 SNP标记的测定进行近交系小鼠 、大鼠的遗传质量评价 ,能够更好地提升近交系小鼠 、大鼠的遗传质量 ,促进其标准化水平和应用价值的提升 。

　　Ⅱ

　　GB/T 45350—2025

　　实验动物 近交系小鼠、大鼠 SNP

　　标记检测法

　　1 范围

　　本文件描述了实验动物近交系小鼠 、大鼠单核苷酸多态性(SNP)标记检测方法及判断标准 。

　　本文件适用于实验动物近交系小鼠 、大鼠遗传组成分析 、品系鉴别和质量控制 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14923—2022 实验动物 遗传质量控制

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphisms;SNP

　　在基因组水平上由单个核苷酸在位置上发生转换 、颠换 、插入或缺失等引起的 DNA序列多态性 。 3.2

　　连接酶检测反应 ligasedetectivereaction;LDR

　　利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别的方法 。

　　注 : 高温连接酶一旦检测到 DNA与互补的两条寡聚核 苷 酸 接 头 对 应 处 存 在 着 基 因 点 突 变 类 型 的 碱 基 错 配 ,则 连接反应就不能进行 。

　　3.3

　　纯合性 homozygosity

　　同源染色体的相对位置上具有相同等位基因的状态 。

　　注 : 近交系动物通过连续的近亲交配绝大部分的位点都具有纯合性 。一个品系内任何个体间进行交配产生的后代也具有纯合性 。

　　4 试剂与仪器

　　4. 1 试剂

　　DNA提取试剂盒 、PCR反应及产物纯化试剂盒 、测序反应试剂盒 、琼脂糖 。

　　4.2 实验设备和器材

　　4.2. 1 仪器设备 : 电 泳 仪 、离 心 机 、PCR 仪 、紫 外 凝 胶 成 像 系 统 、遗 传 分 析 仪 、水 浴 锅 、微 波 炉 、混 匀 振荡器 。

　　1

　　GB/T 45350—2025

　　4.2.2 器材 :剪刀 、镊子 、采血管 、移液器 、离心管 、PCR管 、琼脂糖制胶板 。

　　5 方法原理

　　小鼠和大鼠基因 组 内 均 存 在 数 量 极 为 丰 富 的 SNP 位 点 。 通 过 筛 选 品 系 特 异 性 的 SNP 标 记 位点,并在该位点上下游设计引物 , 通过 PCR 扩增 、连接酶反应 、测序 、毛细管电泳等分子生物学方法分析 ,得到各近交系的遗传概貌 ,定期进行遗传质量监测 。

　　6 位点选择

　　6. 1 近交系小鼠检测(直接测序法)

　　常规近交系小鼠选取表 1 中前 27个 SNP标记进行 PCR扩增 ,使用直接测序法进行检测 。

　　除表 1前 27个标记外 ,C57BL/6亚系需要加测表 1 中 28号 ~ 32号 SNP标记 ,BALB/c亚系需要加测表 1 中 33号 ~ 35号 SNP标记 。

　　各实验室可根据自身条件设计或选择引物 。表 2 中引物和退火温度可供参考 。

　　表 1 近交系小鼠 35个 SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　1

　　rs3022796

　　10

　　rs3023177

　　19

　　rs3023382

　　28

　　rs3709624

　　2

　　rs3022825

　　11

　　rs3023203

　　20

　　rs3091048

　　29

　　rs3659787

　　3

　　rs3022883

　　12

　　rs3023226

　　21

　　rs3091174

　　30

　　rs3722313

　　4

　　rs3022953

　　13

　　rs3089984

　　22

　　rs3023436

　　31

　　rs3702158

　　5

　　rs3022977

　　14

　　rs3089109

　　23

　　rs3023442

　　32

　　rs3724876

　　6

　　rs3023034

　　15

　　rs3088673

　　24

　　rs3023450

　　33

　　rs3712692

　　7

　　rs3023039

　　16

　　rs3023251

　　25

　　rs3089349

　　34

　　rs3706082

　　8

　　rs3023064

　　17

　　rs3023342

　　26

　　rs3023481

　　35

　　rs3656801

　　9

　　rs3023162

　　18

　　rs3023381

　　27

　　rs3089604

　　—

　　—

　　表 2 近交系小鼠 35个 SNP 引物及退火温度

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　1

　　rs3022796-F

　　GTATGGTGGGGAGAGCACAC

　　344

　　61

　　1

　　rs3022796-R

　　GAGTCAGGTCCAACCAACCC

　　2

　　rs3022825-F

　　GGCACTGCAGTATTAGCCGA

　　299

　　60

　　1

　　rs3022825-R

　　CCTGGCATGTACTGTGAGGC

　　3

　　rs3022883-F

　　AGTTTGGGGGAGGAACCCTG

　　209

　　60

　　2

　　rs3022883-R

　　AGGCAGGCATCATACATTGGA

　　2

　　GB/T 45350—2025

　　表 2 近交系小鼠 35个 SNP 引物及退火温度 (续)

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　4

　　rs3022953-F

　　CATTTGACAAGGTATGCAGGGC

　　198

　　59

　　3

　　rs3022953-R

　　GTATTTTGTAGGGGCACCAGA

　　5

　　rs3022977-F

　　ATGAGAGGAACAACAAGCACGT

　　385

　　59

　　4

　　rs3022977-R

　　CCCCAAGATTTCTACACCAAAG

　　6

　　rs3023034-F

　　TGAGTTTTCACTCTTGCTGGC

　　249

　　60

　　5

　　rs3023034-R

　　AGCCCTTCTGATAGTTGAACGAC

　　7

　　rs3023039-F

　　CAGCCATACCACTCTGCTCC

　　459

　　61

　　5

　　rs3023039-R

　　GGTCAGAACCCATGTCCAGG

　　8

　　rs3023064-F

　　GCCCAGCCAGTGGGTC

　　153

　　58

　　6

　　rs3023064-R

　　TGGCAATAATTGTATCTTGTGCCC

　　9

　　rs3023162-F

　　TTTTCACTGTGTTCCCGTGAC

　　262

　　60

　　7

　　rs3023162-R

　　AGACCTAACAGGGAACAGGCA

　　10

　　rs3023177-F

　　TTTGAGTTGCAGGGTTTTCCTG

　　200

　　59

　　8

　　rs3023177-R

　　GCCTTTACAGCCAAAGACTTATCA

　　11

　　rs3023203-F

　　GGTCTCTTGGCATCTGGCAT

　　183

　　58

　　9

　　rs3023203-R

　　GAGCTTGTAGAGAGAACCCCT

　　12

　　rs3023226-F

　　GTGACAACCCTCCTGGTGTA

　　185

　　59

　　9

　　rs3023226-R

　　AACTCCGTGTGGGGTAGTGA

　　13

　　rs3089984-F

　　GCCTAACATCACTTTTTGGGAGC

　　199

　　60

　　10

　　rs3089984-R

　　GGAGCAATTAGAATCCCAGGTG

　　14

　　rs3089109-F

　　TAACAAAGCTCTTCACTCCTCAAG

　　191

　　59

　　10

　　rs3089109-R

　　AATGGGTCTGTCAGAGTTTTCTCA

　　15

　　rs3088673-F

　　ACCATTCTTCTCAACTAAGTCTGCT

　　190

　　59

　　11

　　rs3088673-R

　　TGGTGATAGTGATGGGCTCT

　　16

　　rs3023251-F

　　TCAGCATCTCCCTTAACCTTCTT

　　186

　　60

　　11

　　rs3023251-R

　　ACCAGCTCCTAGTGATGACA

　　17

　　rs3023342-F

　　TGACTGGACCGTAACGAGAG

　　198

　　60

　　12

　　rs3023342-R

　　CAGGCCAGACCGTGCTAATG

　　18

　　rs3023381-F

　　GAGGTAGAGATGCAGCAGGG

　　169

　　59

　　13

　　rs3023381-R

　　GGAGGGATGGATGGTGGAGA

　　19

　　rs3023382-F

　　AGGAGCCGCTGGTTCTGATA

　　189

　　59

　　13

　　rs3023382-R

　　ATGTACACATGAGACTCCGGC

　　3

　　GB/T 45350—2025

　　表 2 近交系小鼠 35个 SNP 引物及退火温度 (续)

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　20

　　rs3091048-F

　　GCTATAGACCAGGAGTTGCCTTT

　　185

　　60

　　14

　　rs3091048-R

　　TGGACAAGCACCCTCACAATA

　　21

　　rs3091174-F

　　TAAAATGGTCCTGCATTTTGCCA

　　198

　　59

　　15

　　rs3091174-R

　　TACTCACATACAACTGAACAAGGCA

　　22

　　rs3023436-F

　　AACTTACGATGTGGGGTGCAA

　　198

　　60

　　16

　　rs3023436-R

　　AGATGCACGTTCACACTGAT

　　23

　　rs3023442-F

　　AGCGGAGGTGCTTGTTACAT

　　297

　　60

　　17

　　rs3023442-R

　　AACACCCAAATGCCAGCCTA

　　24

　　rs3023450-F

　　ATGGATCAGGGAAGAGCACC

　　216

　　60

　　17

　　rs3023450-R

　　CTGCCTGCATCCCCTAACTC

　　25

　　rs3089349-F

　　CCCTGTGCTCATGGTGTAGAAA

　　299

　　61

　　18

　　rs3089349-R

　　TCAGGGTGGATGATGTCCAAAG

　　26

　　rs3023481-F

　　TCTGGGCCACTACTTTCACTTC

　　250

　　60

　　19

　　rs3023481-R

　　CAGCACTTTCCACAGTTGGG

　　27

　　rs3089604-F

　　TTTTCAGGGCCAAAGCAGACT

　　290

　　60

　　X

　　rs3089604-R

　　TCCTCCTAACTAAGTCCCCCTTTT

　　28

　　rs3709624-F

　　ACAGTGCTGGCTTGTGGTAGAG

　　673

　　61

　　8

　　rs3709624-R

　　CGAATTATGACCGAGAAGTTGA

　　29

　　rs3659787-F

　　CCACAACAAAGAGCCAGACCAA

　　277

　　59

　　11

　　rs3659787-R

　　TAGGCTTGGCCTTCATCTAAGC

　　30

　　rs3722313-F

　　GTGTCTCTCACCAGGACAGC

　　272

　　60

　　13

　　rs3722313-R

　　AACGGGTCGTAGAACTTGGC

　　31

　　rs3702158-F

　　ACTCTCCAAAGAGGAACAGCTT

　　236

　　59

　　15

　　rs3702158-R

　　TACAGAGTACCCTAGCACGCC

　　32

　　rs3724876-F

　　AAGTGTCAGTTTTATTGTTTCCAGT

　　177

　　58

　　19

　　rs3724876-R

　　CAAGTTCCCTTTTGGCTGGC

　　33

　　rs3712692-F

　　AGGGCCCGATTGTAGTGTTTA

　　197

　　59

　　1

　　rs3712692-R

　　CCTGTGAAGTGAATGAGCTTGC

　　34

　　rs3706082-F

　　ACAGCGGGAATTGGATGGTAT

　　241

　　60

　　4

　　rs3706082-R

　　GTGATCACCACACTCTTCCGT

　　35

　　rs3656801-F

　　ACCCACGAGAACAATGAGGC

　　163

　　59

　　18

　　rs3656801-R

　　GGTAGGGTCAGCACTGGAAC

　　4

　　GB/T 45350—2025

　　6.2 近交系大鼠检测(LDR法)

　　21个 SNP位点共 分 为 2 组 进 行 PCR-LDR 反 应 , 表 3、表 4 分 别 为 21个 SNP 位 点 的 引 物 和 探针 ,覆盖大鼠的 20条常染色体和 X染色体 。每个位点的通用 modify探针需 3'荧光标记 ,5'磷酸化 。

　　表 3 21个近交系大鼠 SNP位点引物染色体分布

　　组别

　　SNP位点

　　引物序列

　　染色体

　　MgCl2

　　mmol/L

　　退火温度℃

　　1

　　rs65970293

　　TGCACATTGGGACTGCTTTA

　　1

　　3

　　59

　　ATCTGGCATGGACAGAGCTT

　　rs106996961

　　ATAGGGCCAAGGTCCCATTC

　　2

　　GAAAAGAACGCTAATCACAGGACA

　　rs63860341

　　CAATGAATCAAAGGCAACCA

　　3

　　CCACGGTCCCTATGTGAACT

　　rs64750237

　　CAGGTATGGCTTTGGAGGAA

　　4

　　GTTTTCAGCTGGAGCTGTCC

　　rs107261116

　　CAGCATTGGCAAGTCTTCCT

　　5

　　TGATAAAAGGAGCAGCAGCA

　　rs64102787

　　CGGGGATCAAAGAGACAAAA

　　6

　　ATAGTGCCAAAGCCCAACAC

　　rs105187832

　　AGACTACTGGGCTGCTCACC

　　7

　　CATGGCACACCTTTCTTTCA

　　rs106114574

　　GGCCCCCTAATTTCCATAAA

　　8

　　TCCAAACATCTCTGGTGTGC

　　rs64682441

　　GCTGGAAGTCTCTGGAGTGG

　　9

　　ACAAGTGGACTGGCTCAGGT

　　rs65067166

　　ATCCCTCTCTTTGCCAGGAT

　　10

　　GTAGGGTGAGGCTGCTTCTG

　　rs8167985

　　ACCCCCTCTTGCTTTCTGTT

　　11

　　CTGCTCTTGGATGAAAACCA

　　2

　　rs106672258

　　GCCCTTCCCAAGGTCATACT

　　12

　　3

　　61

　　AAAGCACAAAAATGCCATCC

　　rs65921305

　　AACCTGGTGATTTGTCAGAGC

　　13

　　GGCAGACTCCAGGAAGATTG

　　rs106335590

　　ATTAGCCACGGATGAAGTGG

　　14

　　TTTGCTGTCTGGCTGATGAC

　　rs106458396

　　AGAGCAGCTGCCAAAATAGC

　　15

　　AAACCTGGCTTTAGCAAGCA

　　5

　　GB/T 45350—2025

　　表 3 21个近交系大鼠 SNP位点引物染色体分布 (续)

　　组别

　　SNP位点

　　引物序列

　　染色体

　　MgCl2

　　mmol/L

　　退火温度℃

　　2

　　rs106888236

　　TGTGAAGAACACAGGCTCTCC

　　16

　　3

　　61

　　TGCCAAACACCATGTAATGAA

　　rs63814610

　　TAGGACAGGGGGAACAACTG

　　17

　　CCCAAGCATCCTTGACTGTT

　　rs8152541

　　CGTGTCATTCCTGACTGTGG

　　18

　　ACAGGAGCTGGCACTGAATC

　　rs105824121

　　TTCTGCAATCAAGGGTGGAT

　　19

　　GGCCACCAAAGATACACAGG

　　rs13453252

　　TACGCCATTTTGCGACATTA

　　20

　　GGTTCCCTACGAGGAACGAC

　　rs65108991

　　CATCCCAGAAGCCCTGTTTA

　　X

　　GAAGTCAGTGCTGTGCCTCA

　　表 4 21个近交系大鼠 SNP位点探针的序列

　　组 别

　　位点名称

　　探针序列

　　1

　　rs65970293_modify

　　GAAAGCACACATATAAGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs65970293_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTAGAAGCTATCCCAGTGTTATGGACA

　　rs65970293_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAGCTATCCCAGTGTTATGGACG

　　rs106996961_modify

　　ACTATTTACAGAATGGGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106996961_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAAATTTATTCACAAAATAAAC

　　rs106996961_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAAATTTATTCACAAAATAAAA

　　rs63860341_modify

　　TGACTGTTGTTCCGAATTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs63860341_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTGGCGACTCAAGCCCTTCACCG

　　rs63860341_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTGGCGACTCAAGCCCTTCACCA

　　rs64750237_modify

　　GATAAAACACACTGGGAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs64750237_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGGCTTAAAGAGGATAAAGGA

　　rs64750237_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGGCTTAAAGAGGATAAAGGG

　　rs107261116_modify

　　TAAACCCTTGCTGTTCCACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs107261116_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTAAGAAAAAAAAAACTGTTCTC

　　rs107261116_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTAAGAAAAAAAAAACTGTTCTG

　　rs64102787_modify

　　CAGTCTAGACCTCTGCCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs64102787_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTACCCCGCCTGTCAGCTCCCAG

　　6

　　GB/T 45350—2025

　　表 4 21个近交系大鼠 SNP位点探针的序列 (续)

　　组 别

　　位点名称

　　探针序列

　　1

　　rs64102787_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTACCCCGCCTGTCAGCTCCCAT

　　rs105187832_modify

　　CCCAAGCGGTGAGCAGCCCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs105187832_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCTACTTCCGTTTATGAATAAACC

　　rs105187832_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCTACTTCCGTTTATGAATAAACA

　　rs106114574_modify

　　AAGCAGTATACAGTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106114574_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCACTTCCTTACTATTTGACTCA

　　rs106114574_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCACTTCCTTACTATTTGACTCT

　　rs64682441_modify

　　ATTAGCAGAGAGTAAGACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs64682441_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATATCCCAAATAGCAAGGCTCAGA

　　rs64682441_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATATCCCAAATAGCAAGGCTCAGG

　　rs65067166_modify

　　CAAGTCATCTATGCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs65067166_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAGCTACCTCCTTCACATCCAGC

　　rs65067166_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAGCTACCTCCTTCACATCCAGG

　　rs8167985_modify

　　CACAAATTCCAGAATTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs8167985_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAAAGGAATAATTGGAGGTTACA

　　rs8167985_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAAAGGAATAATTGGAGGTTACC

　　2

　　rs106672258_modify

　　TGGGGGTAGGATATTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106672258_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTAGCCATGCCCCCAGACACCTCGATA

　　rs106672258_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCCATGCCCCCAGACACCTCGATG

　　rs65921305_modify

　　GGGAAAAATAGATTTGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs65921305_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTCATTGAATGTTGAATTTACA

　　rs65921305_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTCATTGAATGTTGAATTTACC

　　rs106335590_modify

　　TGTTAATAAAACAAACATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106335590_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGAACAGACTCACTCAATTCC

　　rs106335590_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGAACAGACTCACTCAATTCA

　　rs106458396_modify

　　TCCATTTTTATCCCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106458396_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCTGGCTTTAGCAAGCAATGTA

　　rs106458396_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCTGGCTTTAGCAAGCAATGTG

　　rs106888236_modify

　　GGGATGCTAAAGGTTTCTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs106888236_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTCTGTACAACAGTATCAACGAAG

　　rs106888236_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTCTGTACAACAGTATCAACGAAT

　　rs63814610_modify

　　GTGCTGGGCCTTGTGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs63814610_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGCACTGAGGTAGGTACCAGGCG

　　7

　　GB/T 45350—2025

　　表 4 21个近交系大鼠 SNP位点探针的序列 (续)

　　组 别

　　位点名称

　　探针序列

　　2

　　rs63814610_T

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGCACTGAGGTAGGTACCAGGCA

　　rs8152541_modify

　　GTTAGAGGTGACAGGAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs8152541_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAGGACATCTGCATCACACTC

　　rs8152541_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAGGACATCTGCATCACACTT

　　rs105824121_modify

　　GTGCCTCCCCACCCCTAACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs105824121_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCAGTTTGATTAGTTAAGAACCTT

　　rs105824121_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCAGTTTGATTAGTTAAGAACCTC

　　rs13453252_modify

　　GTAGTGTACCTGGTAGAAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs13453252_G

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCCCTACGAGGAACGACGCTGC

　　rs13453252_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCCCTACGAGGAACGACGCTGG

　　rs65108991_modify

　　TATATAAACAAAGCTTGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　rs65108991_A

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGTCAGTGCTGTGCCTCAGTCTAT

　　rs65108991_C

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGTCAGTGCTGTGCCTCAGTCTAG

　　6.3 近交系大鼠检测(直接测序法)

　　常规近交系大鼠选取表 5 中前 31个 SNP标记进行 PCR扩增 ,使用直接测序法进行检测 。研究大鼠免疫遗传标记 ,可加测表 5 中 32号 ~ 38号 SNP标记 。

　　各实验室可根据自身条件设计或选择引物 。表 6 中引物和退火温度可供参考 。

　　表 5 近交系大鼠 38个 SNP标记检测位点

　　序号

　　SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　序号

　　SNP位点

　　1

　　rs64750237

　　14

　　rs106610489

　　27

　　rs13453252

　　2

　　rs106888236

　　15

　　rs13453115

　　28

　　rs64102787

　　3

　　rs106458396

　　16

　　rs105753760

　　29

　　rs106647405

　　4

　　rs107038347

　　17

　　rs8173311

　　30

　　rs65545562

　　5

　　rs106672258

　　18

　　rs66190198

　　31

　　rs105694545

　　6

　　rs105466309

　　19

　　rs106506161

　　32

　　rs13458024

　　7

　　rs65921305

　　20

　　rs106996961

　　33

　　rs8166089

　　8

　　rs106795993

　　21

　　rs65729677

　　34

　　rs8158177

　　9

　　rs106891788

　　22

　　rs65970293

　　35

　　rs13457316

　　10

　　rs65801920

　　23

　　rs8170947

　　36

　　rs13448591

　　11

　　rs8164880

　　24

　　rs107097763

　　37

　　rs13456231

　　12

　　rs105008665

　　25

　　rs8173257

　　38

　　rs8149053

　　13

　　rs8152541

　　26

　　rs105187832

　　—

　　—

　　8

　　GB/T 45350—2025

　　表 6 近交系大鼠 38个 SNP 引物及退火温度

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　1

　　rs64750237

　　CAGTGTAGCTCAGGCAGAT

　　159

　　58

　　4

　　CCAGGCACCATCAAGGAA

　　2

　　rs106888236

　　TGTGAAGAACACAGGCTCTCC

　　203

　　58

　　16

　　TGCCAAACACCATGTAATGAA

　　3

　　rs106458396

　　GAGAATGAGAAGGCCACACT

　　266

　　58

　　15

　　CACCAAAGAGATAGCGAAGC

　　4

　　rs107038347

　　TAGTCACCTAGTCCTTCAGA

　　303

　　58

　　3

　　TTACAAGTCAGTGGCAGAA

　　5

　　rs106672258

　　TCTGGCTGTGATCGGAACTA

　　378

　　58

　　12

　　CAACGAATGAGCAAGAGAAGAC

　　6

　　rs105466309

　　AGCAGAGCACCTCACAGAAT

　　468

　　58

　　5

　　CCTTGTGTTGCCTATGGATGA

　　7

　　rs65921305

　　GCTGTGCTTGGCATAATATC

　　555

　　58

　　13

　　CCAGGTGATTATAGATTGTGTC

　　8

　　rs106795993

　　AACAGCAGCCGCTTCTTAG

　　702

　　58

　　11

　　CAGTGTCAGATGTGGTGGTATA

　　9

　　rs106891788

　　GGTGCCTTCCTGACAAAGT

　　156

　　58

　　1

　　GGGTTTCCATTGCTATTTGACA

　　10

　　rs65801920

　　TGGCTCTTGGTCATCATCTGT

　　196

　　58

　　9

　　TCTGTTCTTGGTCTGCTGAGT

　　11

　　rs8164880

　　CGTCTGTGTTAGTAGGTGATGC

　　261

　　58

　　14

　　CCTCTGATGCTGTTGGTATGC

　　12

　　rs105008665

　　CATCTGCCTGCTACAACTGTT

　　355

　　58

　　2

　　TCTTGTATTGGTCAGCACTCTC

　　13

　　rs8152541

　　CAGGTGGTGATGGTGTAAGC

　　430

　　58

　　18

　　CCTCATGCAGTAGCGAGTAAC

　　14

　　rs106610489

　　CGCTGTCCAATCTCCTGAAG

　　499

　　58

　　2

　　CTAGAAGCCATTGTCTGGTCAA

　　15

　　rs13453115

　　CTGACTTGACAGAACGGTAGG

　　597

　　58

　　15

　　AGAGCAGTGAAGGTGAGGAG

　　16

　　rs105753760

　　AGCAGCATCACAATAGCAAGG

　　788

　　58

　　14

　　CTTCCCTAACACATCCCTACCA

　　9

　　GB/T 45350—2025

　　表 6 近交系大鼠 38个 SNP 引物及退火温度 (续)

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　17

　　rs8173311

　　CCACCGCATTTGACCAGTTT

　　359

　　58

　　19

　　GCCCTGTGTTTGATGGAGTAG

　　18

　　rs66190198

　　GAGTTCCTGAGTGCTTGATTGT

　　214

　　58

　　11

　　ATGGGAGTTAAGGCGGTTTCT

　　19

　　rs106506161

　　GCAGCAGGACACAAGGAAG

　　268

　　58

　　10

　　TCTTAGGAGACCAGAGGAGTG

　　20

　　rs106996961

　　TGTGTCTCTGTAGTTGGTGTTG

　　366

　　58

　　2

　　GGATATGGTGCAGTCGTCATT

　　21

　　rs65729677

　　AACCTCAATTCAACAGCCAGAA

　　480

　　58

　　5

　　CCACGACTCACCTACATTCAC

　　22

　　rs65970293

　　CTCTGGTTGGTCTGGTTGGTT

　　539

　　58

　　1

　　AGATGCGGATGCCATTAAGTCT

　　23

　　rs8170947

　　GACACAGTCAGCATGTAAGCC

　　679

　　58

　　2

　　AGACAGTCACTCACAACTCAGA

　　24

　　rs107097763

　　TGTACGAAGGAATCATTCTGGA

　　191

　　58

　　2

　　CAGTCTCCTCCTGAATGTGAAT

　　25

　　rs8173257

　　AGTGTGACTGACCGAAGAAG

　　331

　　58

　　17

　　AACTCCTGCCTCTACTTACCTA

　　26

　　rs105187832

　　GGCTTTCCCTTCTCCATACTTG

　　300

　　58

　　7

　　TTACCTGTGACTCCTGCTTGT

　　27

　　rs13453252

　　CCTGTAATCAAGATACGCCATT

　　349

　　58

　　20

　　GCTAGGACCTTAACCACCATA

　　28

　　rs64102787

　　GCTGGGCTGTGGTTAGACT

　　406

　　58

　　6

　　AGCATGGCTGGCAGTTCA

　　29

　　rs106647405

　　CCTTCTTCTGGAACCTGCTCTG

　　469

　　58

　　4

　　GACCCTGTAATTGGCACCTGTT

　　30

　　rs65545562

　　TGCTGCTCTAACGATGAGTACA

　　585

　　58

　　21

　　GATGTAGGCACCAGGCTTGT

　　31

　　rs105694545

　　CCTCCTATCCGTGAGTCCTGAG

　　678

　　58

　　8

　　TTCTGGTGCCGTCCTGTCTT

　　32

　　rs13458024

　　GGAGTAACTCTAATGGCGGAAG

　　172

　　58

　　20

　　CCTCACAGGAACCAGTAATGC

　　10

　　GB/T 45350—2025

　　表 6 近交系大鼠 38个 SNP 引物及退火温度 (续)

　　序号

　　引物

　　引物序列

　　产物bp

　　退火温度℃

　　染色体位置

　　33

　　rs8166089

　　TAGGCGAGAGACGGAAGGA

　　225

　　58

　　20

　　CAAGGTGCTGAGTGCTGTT

　　34

　　rs8158177

　　CCATCACCAGCAGCTTAGTTC

　　483

　　58

　　20

　　GCGTTGGCTCAGCAATCAA

　　35

　　rs13457316

　　GAACCAGAAGCAGGATTCAACA

　　403

　　58

　　20

　　CCGACACCAGCAATAACAGG

　　36

　　rs13448591

　　CCTTGTCACGGTTCCTCCAA

　　474

　　58

　　20

　　GCAGAGTCCAGCCACTGTT

　　37

　　rs13456231

　　TTGGAGCATTGGCAGGCA

　　576

　　58

　　20

　　CCATCACTAACCAGTTCAGAGG

　　38

　　rs8149053

　　CGCTCCTCCTCCATGATTGA

　　775

　　58

　　20

　　GGCTGGCTCTTGTCACTCA

　　7 操作步骤

　　7. 1 采样

　　近交系采样原则按照 GB 14923—2022中 5. 2. 1. 1,具体操作如下 :

　　a) 观察动物外观 ,核对编号 ;

　　b) 经眼底静脉采血 200 μL,或取 0. 5 cm 尾尖 , -20 ℃低温保存 ;

　　c) 提取基 因 组 DNA: 用 苯 酚 氯 仿 法 或 试 剂 盒 提 取 基 因 组 DNA。 紫 外 分 光 光 度 计 测 浓 度 在OD260/280在 1. 8~ 2. 0 之间 ,质量浓度调整为 30 ng/μL~40 ng/μL。

　　7.2 小鼠 SNP直接 PCR测序分型法

　　7.2. 1 PCR扩增体系

　　PCR 总反应体积为 30 μL, 其中 10× PCR buffer(Mg2+ ) 为 3 μL, 上 下 游 引 物(10 pmol/μL) 各1 μL, dNTP 2. 5 mmol/L为 3 μL,Taq酶 5 U/μL为 0. 2 μL,30ng/μL基因组 DNA 为 1 μL,纯水补齐体积 。本体系推荐使用普通 Taq酶 。

　　7.2.2 PCR反应程序

　　95 ℃预变性 , 3 min; 94 ℃变 性 , 1 min;退 火 温 度(各 位 点 退 火 温 度 见 表 2) , 1 min; 72 ℃延 伸 ,

　　1 min;35个循环;72 ℃继续延伸 8 min;扩增产物 4 ℃保存 。

　　7.2.3 电泳检测与产物纯化

　　制备 1×TAE制备 1. 5%琼脂糖凝胶 ,取 PCR 扩增结果 5 μL,用移液器在凝胶上点样 。凝胶成像系统记录检测结果 。

　　11

　　GB/T 45350—2025

　　使用 PCR产物纯化回收试剂盒对目的产物进行纯化回收 。

　　7.2.4 产物测序

　　7.2.4. 1 测序扩增体系及反应程序

　　纯化 PCR产物可送交有资质的测序公司进行测序分析 ,或参照如下步骤进行测序 。

　　总反应体 积 为 5 μL, 其 中 5 × buffer 为 0. 8 μL, Bigdye为 0. 4 μL, 单 向 引 物 (3. 2 pmol/μL) 为1 μL, 纯化 PCR产物(质量 浓 度 不 低 于 20 ng/μL) 为 1 μL, 纯 水 补 齐 体 积 。 测 序 扩 增 反 应 置 于 冰 上操作 。

　　测序扩增程序 :96 ℃预变性 , 2 min;96℃变性 ,10 s;55 ℃ ,5 s;60 ℃ ,90 s;25个循环;4℃保存 。使用配套 HIDI变性纯化试剂盒将测序扩增产物进行纯化及变性解链处理 。

　　7.2.4.2 上机测序与结果输出

　　按照遗传分析仪操作手册建立并启动测序程序 ,获得峰图后对其进行命名和分析 ,判断突变的有无及类别 ,使用软件分析 ,得到检测个体的 SNP位点碱基类型 。

　　7.3 大鼠 SNP采用 PCR-LDR分型法

　　7.3. 1 PCR扩增体系

　　PCR 总反 应 体 积 为 20 μL, 其 中 10× PCR buffer 为 2 μL, GC 溶 液 为 2 μL, 上 下 游 引物(0. 5 pmol/μL) 各 2 μL, dNTP(各 2. 5 mmol/L) 为 1. 6 μL, 镁 离 子 (25 mmol/L) 为 2. 4 μL,Taq 酶(5U/μL)为 0. 1 μL,50 ng~ 100 ng基因组 DNA 为 2 μL,纯水补足 20 μL。

　　7.3.2 PCR 反应程序

　　反应程序 :95 ℃预变性 15 min;94℃变性 30 s,退火温度(各位点退火温度见表 3)90 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃继续延伸 10 min;4 ℃ 保存 。

　　7.3.3 LDR反应体系

　　LDR 总反应体积为 20 μL,其中 10× buffer为 2 μL,位点特异探针(0. 5 pmol/μL) 各 2 μL,模 板(PCR产物)为 8 μL,Taq DNA链接酶(40U/μL)为 0. 2 μL,加水补足 20 μL。

　　7.3.4 LDR反应程序

　　反应程序 :95 ℃预变性 2 min;94℃变性 30 s,50 ℃连接 2 min,30个循环;4℃保存 。

　　7.3.5 产物检测

　　7.3.5. 1 产物变性

　　总体积为 10 μL,PCR-LDR产物为 1 μL,去离子甲酰胺 HIDI为 8 μL, 内参 ROX为 1 μL。

　　7.3.5.2 变性程序

　　95 ℃变性 5 min,迅速放在冰水浴中 。5 min后 ,可上机检测 。

　　7.3.5.3 产物检测

　　将变性后的产物放入 一 代 自 动 测 序 仪 中 进 行 分 析 , 按 照 一 代 测 序 仪 操 作 手 册 建 立 并 启 动 检 测 程

　　12

　　GB/T 45350—2025

　　序 ,获得峰图后对其进行命名和分析 ,判断突变的有无及类别 ,使用仪器配套的分型软件 ,得到检测个体的 SNP位点碱基类型 。

　　7.4 大鼠 SNP直接 PCR测序分型法

　　7.4. 1 PCR扩增体系

　　PCR 总反应体积 为 40 μL, 其 中 10× PCR buffer(Mg2+ ) 为 4 μL, 上 下 游 引 物 (10 pmol/μL) 各1 μL, dNTP 2. 5 mmol/L为 3. 2 μL,Taq酶 5 U/μL为 0. 2 μL,30ng/μL基因组 DNA 为 1 μL,纯水补齐体积 。本体系推荐使用普通 Taq酶 。

　　7.4.2 PCR 反应程序

　　95 ℃预变性 , 5 min;96℃变性 30 s, 58 ℃退 火 30 s, 72 ℃延 伸 30 s, 35个 循 环 ; 72 ℃继 续 延 伸

　　8 min;扩增产物 4 ℃保存 。

　　7.4.3 电泳检测与产物纯化

　　制备 1×TAE制备 1. 5%琼脂糖凝胶 ,取 PCR 扩增结果 5 μL,用移液器在凝胶上点样 。凝胶成像系统记录检测结果 。

　　使用 PCR产物纯化回收试剂盒对目的产物进行纯化回收 。

　　7.4.4 产物测序

　　7.4.4. 1 测序扩增体系及反应程序

　　纯化 PCR产物可送交有资质的测序公司进行测序分析 ,或按照如下步骤进行测序 。

　　总反应体 积 为 5 μL, 其 中 5 × buffer 为 0. 8 μL, Bigdye为 0. 4 μL, 单 向 引 物 (3. 2 pmol/μL) 为1 μL, 纯化 PCR产物(质量 浓 度 不 低 于 20 ng/μL) 为 1 μL, 纯 水 补 齐 体 积 。 测 序 扩 增 反 应 置 于 冰 上操作 。

　　测序扩增程序 :96 ℃预变性 , 2 min;96℃变性 ,10 s;55 ℃ ,5 s;60 ℃ ,90 s;25个循环;4℃保存 。使用配套 HIDI变性纯化试剂盒将测序扩增产物进行纯化及变性解链处理 。

　　7.4.4.2 上机测序与结果输出

　　按照遗传分析仪操作手册建立并启动测序程序 ,获得峰图后对其进行命名和分析 ,判断突变的有无及类别 ,使用软件分析 ,得到检测个体的 SNP位点碱基类型 。

　　8 结果判定

　　经检测获得的 SNP遗传概貌应与原品系的 SNP遗传概貌相符 ,没有新的等位基因出现 ,则判定为合格品系 。否则 ,判为不合格品系 。

　　结果判定基于与种源数据比对给出结论 。 当出现群体的稳定纯合遗传变异 ,可判为亚系 。如为个体的纯合或杂合变异 ,需要扩大样本量和检测位点,结果仍为个体纯合或杂合变异 ,判为不合格 。具体品系评价按照 GB 14923—2022附录 E执行 。

　　13