GB/T 27530-2025 牛出血性败血症诊断技术

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27530—2025代替 GB/T 27530—2011

　　牛出血性败血症诊断技术

　　Diagnostic techniques for bovine haemorrhagic septicaemia

　　2025⁃01⁃ 24 发布 2025⁃08⁃01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27530—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 临床诊断 1

　　6 样品采集、运输与保存 2

　　7 细菌分离与镜检 3

　　8 细菌鉴定 4

　　9 多重聚合酶链式反应 8

　　10 综合判定 10

　　附录 A(规范性) 培养基的配制 11

　　附录 B(规范性) 试剂溶液及电泳介质的配制 13

　　附录 C(规范性) 多杀性巴氏杆菌分型抗原 、抗血清及绵羊红细胞的制备方法 16

　　附录 D(资料性) 琼脂凝胶免疫扩散试验打孔及结果判定示意图 17

　　附录 E(资料性) PCR 阳性对照的制备 18

　　附录 F(资料性) 多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息 19

　　附录 G(资料性) 多杀性巴氏杆菌多重 PCR 阳性扩增参照图 21

　　参考文献 22

　　Ⅰ

　　GB/T 27530—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 27530—2011《牛出血性败血病诊断技术》，与 GB/T 27530—2011 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

　　——更改了适用范围(见第 1 章，2011 年版的第 1 章);

　　——增加了缩略语(见第 4 章);

　　——更改了临床诊断特点，并增加了临床诊断的结果判定(见第 5 章，2011 年版的第 4 章);

　　——更改了细菌分离 、镜检 、鉴定的操作步骤(见第 7 章 、第 8 章，2011 年版的第 5 章);

　　——增加了细菌的分离培养所用培养基(见 7.1、附录 A);

　　——更改了细菌的涂片染色镜检(见 7.2、附录 B，2011 年版的 5.2、附录 A);

　　—— 删 除 了 MR、VP 试 验 ，β - 半 乳 糖 苷 酶 试 验 ，柠 檬 酸 盐 利 用 试 验(见 2011 年 版 的 5.3.2.3.2、 5.3.2.3.4、5.3.2.3.5);

　　——更改了细菌的生化特性鉴定方法，并规定了不同生化试验的培养基制备(见 8.1、附录 A 、附录

　　B，2011 年版的 5.3.2.3);

　　——更改了间接血凝试验的荚膜抗原与抗血清制备方法(见 8.2，2011 年版的 5.3.2.4.1);

　　——增加了荚膜型鉴定的判定标准和多杀性巴氏杆菌的多重 PCR 鉴定技术(见第 9 章);

　　——更改了综合判定标准(见第 10 章，2011 年版的第 6 章)。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本文件起草单位：北京市农林科学院 、中国动物卫生与流行病学中心 、甘肃农业大学 、福建省农业科学院畜牧兽医研究所 。

　　本文件主要起草人 ：李永清 、宋翠平 、刘文晓 、胡永浩 、秦立得 、赵思俊 、王玉东 、傅光华 、黄瑜 、曹旭敏 、李木子 、程龙飞 、隋金钰 、江波 、程晶 、徐福洲 、周林宜 、王晓茵 、孙晓亮 、王淑婷 、刘坤 、张柏铭 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

　　——2011 年首次发布为 GB/T 27530—2011;

　　——本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 27530—2025

　　引 言

　　牛出血性败血症(Bovine haemorrhagic septicaemia)是黄牛 、水牛 、牦牛 、奶牛和野牛的一种主要疫病 ，由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)某些血清型引起 ，典型症状为高致死性急性败血症和纤维素性化脓性肺炎等 。本病以散发为主 ，偶尔呈小区域地方流行 ，危害较大 。世界动物卫生组织(WOAH)将牛出血性败血症列为法定名录疫病，我国将其列为三类动物疫病 。

　　多杀性巴氏杆菌分为 5 个荚膜血清型(A 、B、D 、E、F)，各荚膜血清型之间的交叉免疫保护作用弱，制订针对性防控措施时须首先进行血清型鉴定 。

　　本文件的修订参考了 WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2022)，并结合了我国相关技术研究新成果 。

　　Ⅳ

　　GB/T 27530—2025

　　牛出血性败血症诊断技术

　　1 范围

　　本文件描述了牛出血性败血症的临床诊断 、样品采集 、运输与保存，以及多杀性巴氏杆菌的分离培养 、染色镜检 、生化试验 、聚合酶链式反应等实验室诊断方法 。

　　本文件适用于牛出血性败血症的诊断 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　NY/T 541 兽医诊断样本采集 、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件：

　　AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immune diffusion test)

　　CIEP：对流免疫电泳试验(counter immunoelectrophoresis test)

　　CSY：酪蛋白⁃蔗糖⁃酵母琼脂(casein/ sucrose/ yeast agar)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　IHA：间接血凝试验(indirect haemagglutination test)

　　LPS：脂多糖(lipopolysaccharide)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　Pm：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)

　　RBCs：红细胞(red blood cells)

　　SPF：无特定病原体(specific pathogen free)

　　TAE：三羟甲基氨基甲烷⁃乙酸⁃乙二胺四乙酸(Tris⁃acetic acid⁃EDTA buffer)

　　TSA：大豆酪蛋白琼脂(tryptic soy agar)

　　TSB：大豆酪蛋白液体(tryptic soy broth)

　　5 临床诊断

　　5.1 流行病学

　　5.1.1 患病动物 、带菌动物为传染源 。黄牛 、水牛 、牦牛 、奶牛和野牛均可感染发病 。

　　1

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　　5.1.2 可通过消化道 、呼吸道 、皮肤或黏膜 、吸血昆虫叮咬传播 。

　　5.1.3 本病的发生一般无明显的季节性 ，以散发为主 ，偶尔呈小区域地方性流行 ，病程长短不 一 。寒冷 、闷热 、潮湿 、拥挤 、气候剧变 、阴雨连绵 、圈舍通风不良 、营养缺乏 、饲料骤变 、过度疲劳 、长途运输以及其他疾病 、感染等是诱发因素 。

　　5.2 临床症状

　　5.2.1 败血型

　　患牛病初体温高达 41 ℃~42 ℃ , 呼吸及心跳加快 ，鼻镜干裂 ，皮温不整 ，食欲减退甚至废绝 ;病初便秘，后腹泻，粪便始呈粥样，后为液状并混有黏液 、黏膜片及血液，恶臭;有时出现鼻漏和血尿，腹泻开始后体温下降，不久即死亡;病程极短，仅为 12 h~24h。

　　5.2.2 浮肿型

　　除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部 、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的炎性水肿，同时伴有舌及周围组织的高度肿胀 ，舌多伸出齿外 ，呈暗红色 。 呼吸高度困难 ，皮肤和黏膜发绀 ，常因窒息或下痢而死;病程较短，多为 12 h~36h。

　　5.2.3 肺炎型

　　除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为纤维素性胸膜肺炎的症状;体温升高，呼吸困难 ，干咳 ，流泡沫样鼻液 ，后鼻液呈脓性 ;胸部叩诊有痛感 ;病初便秘 ，后腹泻 ，粪便恶臭并混有血液 ;病程较长，一般为 3 d~7d 左右 。

　　5.3 病理变化

　　5.3.1 败血型

　　皮下 、各部位黏膜 、浆膜 、肌肉等均有出血点，胸腹腔有大量渗出液 。真胃 、小肠及大肠常见出血性炎症，肠内容物稀薄且多混有血液 。淋巴结显著水肿，脾脏点状出血但不肿大 。肺脏淤血 、水肿 。

　　5.3.2 浮肿型

　　咽喉部 、颈部及肢体部皮下水肿 ，切开水肿部位流出深黄色透明液体 ，有出血 ，口咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀 。上呼吸道黏膜卡他性炎症 。

　　5.3.3 肺炎型

　　胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液 ，肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜 ，肺脏切面呈大理石状 。后期，肺内有干酪样坏死灶及脓肿 。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物 。淋巴结肿大，呈紫色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵隔淋巴结最为明显 。 胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症 。

　　5.4 结果判定

　　符合上述流行病学特征并且易感动物出现上述部分或全部临床症状和病理变化时，可初步判定为疑似牛出血性败血症 。确诊应进一步采样送实验室诊断 。

　　6 样品采集、运输与保存

　　6.1 样品采集

　　6.1.1 血 液 样 品 ：按 照 NY/T 541 的 规 定 采 集 濒 死 或 死 后 30 min 内 的 病 牛 血 液 ，每 份 样 品 不 少 于

　　2

　　GB/T 27530—2025

　　2 mL 。

　　6.1.2 组织样品：采集病死牛的肺脏 、肝脏 、淋巴结，取 25 g~50 g 样品装入样品保存袋后封口 。

　　6.1.3 鼻腔分泌物/体腔渗出液：采集出现体温升高 、呼吸困难 、流涎等典型症状的发病牛的鼻腔分泌物或病死牛的体腔渗出液，每份样品不少于 2 mL，加入样品保存管后加盖密封 。

　　6.2 样品的运输与保存

　　采集的样品均置冰上冷链运输，并于 24 h 内送达实验室 。如果在 24 h 内不能送达，应置-20 ℃冷冻保存运输 。

　　7 细菌分离与镜检

　　7.1 细菌分离

　　7.1.1 主要器材

　　7.1.1.1 培养箱(37 ℃)。

　　7.1.1.2 二级生物安全柜 。

　　7.1.1.3 接菌环 。

　　7.1.2 主要试剂

　　7.1.2.1 麦康凯琼脂培养基 。

　　7.1.2.2 含 5% 血清的 CSY 培养基，按照附录 A 中 A .1 配制 。

　　7.1.2.3 TSA 培养基，按照 A .2 配制 。

　　7.1.2.4 鲜血琼脂培养基，按照 A .3 配制 。

　　7.1.2.5 含 5% 血清的 TSB 培养基，按照 A .4 配制 。

　　7.1.3 操作方法

　　7.1.3.1 将 6.1 中采集到的样品分别接种麦康凯琼脂培养基 、含 5% 血清的 CSY 培养基或 TSA 培养基和鲜血琼脂培养基，置 37 ℃条件下培养 18 h~24 h 后，挑选可疑菌落进行鉴定 。

　　7.1.3.2 当采集的样品中细菌含量少时 ，将样品用灭菌 0.85% NaCl 溶液制成 1 ∶10 悬液(体腔渗出液可直接用于接种)，或用含 5% 血清的 TSB 培养基的 24 h 培养液 ，经皮下或腹腔接种 18 g~22 g 健康的 SPF 级 Balb/c 小鼠 4 只~8 只 ，每只 0.2 mL 。 同时取 4 只~8 只清洁级小鼠注射等量 0.85% NaCl无菌溶液作为对照 ，隔离饲养观察 。接种后 48 h 内死亡的小鼠立即采集实质脏器(包括肺脏 、肝脏 、脾脏);接种后 48 h 仍存活的小鼠采集心血或实质脏器，进行划线分离培养 。

　　7.1.4 培养特性

　　7.1.4.1 巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长，在血液琼脂培养基上经 18 h~24 h 后可长成圆形 、光滑 、湿润 、有灰白色光泽的半透明菌落，直径约 1 mm，菌落周围无溶血现象 。

　　7.1.4.2 在 CSY 培养基上生成的菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落 ，在无血培养基上的老龄培养物生成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落 。

　　7.2 染色镜检

　　7.2.1 主要器材

　　7.2.1.1 显微镜 。

　　3

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　　7.2.1.2 酒精灯 。

　　7.2.1.3 载玻片(75 mm×25 mm)。

　　7.2.1.4 接菌环 。

　　7.2.2 主要试剂

　　7.2.2.1 1% 结晶紫染色液，按照附录 B 中 B .1 配制 。

　　7.2.2.2 革兰氏碘液，按照 B .2 配制 。

　　7.2.2.3 瑞氏染色液，按照 B .3 配制 。

　　7.2.2.4 印度墨汁染色液，按照 B .4 配制 。

　　7.2.3 操作方法

　　7.2.3.1 革兰氏染色

　　采集的组织样品或分离得到的菌落进行涂片 ，在火焰上固定 ，滴加结晶紫染色液 ，染色 1 min，水洗 ;滴加革兰氏碘液 ，作用 1 min，水洗 ;滴加 95%(体积分数)乙醇脱色 ，约 30 s;或将 95%(体积分数)乙醇滴满整个涂片 ，立即倾去 ，再用 95%(体积分数)乙醇滴满整个涂片 ，脱色 10 s;水洗 ，滴加复染液 ，复染 1 min，水洗，待干 。镜检，待检菌为革兰氏阴性的短杆菌，菌体大小为(0 .2 μm~0.4 μm)×(0 .6 μm~ 2.5 μm)。

　　7.2.3.2 瑞氏染色

　　采集的组织样品或分离得到的菌落涂片自然干燥后 ，滴加瑞氏染色液 ，固定 1 min;加入等量蒸馏水，染色 3 min~5min 。用蒸馏水冲洗，待干 。镜检，待检菌经瑞氏染色时菌体呈两极浓染 。

　　7.2.3.3 印度墨汁染色

　　接菌环挑取新鲜菌落涂片固定 ，滴加印度墨汁染色液 1 滴 ，覆盖盖玻片 ，轻轻按压 ，使菌体与染色液混合均匀 。镜检，待检菌经印度墨汁染色可见明显的荚膜 。

　　7.2.4 结果判定

　　慢性病例或腐败样品常不易发现典型细菌 ，应分离培养后再染色镜检 。镜检观察到典型菌体 ，结合流行特点 、症状和病变，可初步确定为巴氏杆菌感染 。

　　8 细菌鉴定

　　8.1 生化试验

　　8.1.1 主要器材

　　8.1.1.1 糖发酵管，按照 A .5 配制 。

　　8.1.1.2 细菌微量生化鉴定管 。

　　8.1.2 主要试剂

　　8.1.2.1 尿素琼脂，按照 A .6 配制 。

　　8.1.2.2 蛋白胨水，按照 A .7 配制 。

　　8.1.2.3 硝酸盐培养基，按照 A .8 配制 。

　　4

　　GB/T 27530—2025

　　8.1.2.4 柯凡克试剂，按照 B .5 配制 。

　　8.1.2.5 欧-波试剂，按照 B .6 配制 。

　　8.1.2.6 氧化酶试验试剂，按照 B .7 配制 。

　　8.1.2.7 硝酸盐还原试剂，按照 B .8 配制 。

　　8.1.3 操作方法

　　取纯培养的待检菌，应用微生物全自动鉴定系统或接种于分别添加葡萄糖 、乳糖 、麦芽糖 、蔗糖 、甘露醇 、山梨醇的糖发酵管 ，以及添加尿素 、吲哚 、氧化酶 、硝酸盐(还原)、硫化氢等的细菌微量生化鉴定管，置于 37 ℃培养 48 h，按细菌微量生化鉴定管说明书操作，进行相关生理生化指标测定 。

　　8.1.4 结果判定

　　依据生化试验结果，能够分解葡萄糖 、甘露醇 、蔗糖 、木糖 、山梨醇产酸不产气，不能分解乳糖产酸，吲哚试验 、氧化酶试验 、硝酸盐还原试验与硫化氢试验阳性，脲酶试验阴性的待检菌判为多杀性巴氏杆菌阳性，生化反应结果按照表 1。

　　表 1 多杀性巴氏杆菌生化反应结果

　　菌名

　　脲酶

　　吲哚

　　氧化酶

　　硝酸盐还原

　　硫化氢

　　发酵产酸

　　葡萄糖

　　乳糖

　　甘露醇

　　蔗糖

　　木糖

　　山梨醇

　　多杀性巴氏杆菌

　　-

　　+

　　+

　　+

　　+

　　+

　　-

　　+

　　+

　　+

　　+

　　8.2 间接血凝试验

　　8.2.1 主要器材

　　8.2.1.1 血凝反应板(大孔板)。

　　8.2.1.2 微 量 可 调 移 液 器(0 .1 μL~2 .5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~ 1 000 μL)及配套滤芯吸咀 。

　　8.2.2 主要试剂

　　8.2.2.1 阿氏液(Alsever ’s 液)，按照 B .9 配制 。

　　8.2.2.2 0.85% NaCl 溶液，按照 B .10 配制 。

　　8.2.2.3 标准菌及待检菌荚膜抗原，按照附录 C 中 C .1 制备 。

　　8.2.2.4 荚膜型特异性抗血清，按照 C .2 制备 。

　　8.2.2.5 1% 新鲜绵羊红细胞，按照 C .3 制备 。

　　8.2.2.6 1% 致敏绵羊红细胞，按照 C .4 制备 。

　　8.2.3 操作程序

　　8.2.3.1 反应板每排第 1 孔加入 0.85% NaCl 溶液 0.72 mL，自第 2 孔起各孔分别加入 0.85% NaCl 溶液 0.4 mL 。

　　8.2.3.2 各荚膜型特异性抗血清各自单独一排稀释 ，第 1 孔加入血清 0.08 mL，混匀 ，吸取 0.4 mL 至下一孔，同样方法稀释至第 7 孔，按图 1 所示 。

　　5

　　GB/T 27530—2025

　　图 1 间接血凝试验血凝反应板加样稀释图

　　8.2.3.3 每孔加入 0.4 mL 1% 致敏绵羊红细胞 。

　　8.2.3.4 同时设如下对照：

　　——血清对照：血清(10 倍稀释)0 .4 mL+1% 新鲜绵羊红细胞 0.4 mL;

　　——绵羊红细胞对照：1% 新鲜绵羊红细胞 0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液 0.4 mL;

　　——抗原对照：1% 致敏绵羊红细胞 0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液 0.4 mL 。

　　8.2.3.5 加样后，轻微振荡，置(24±1)℃ , 于 2 h~l8 h 内判读并记录结果 。

　　8.2.4 结果判定

　　绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为巴氏杆菌阳性在孔中央形成纽扣状为巴氏杆菌阴性 。根据抗血清的种类，可鉴定待检菌的荚膜型 。依据凝集范围的大小判定凝集程度为以下几级：

　　a) “ ++++ ”凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底，示 100% 凝集，判为强阳性;

　　b) “ +++ ”凝集的红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示 75% 凝集，判为阳性;

　　c) “ ++ ”红细胞呈薄层凝集，面积小，示 50% 凝集，判为弱阳性;

　　d) “ + ”红细胞不完全沉于孔底，周围有散在少量凝集，示 25% 凝集，判为阴性;

　　e)“- ”红细胞沉积在孔中央，如小圆盘或纽扣状，示无凝集，判为阴性 。

　　8.3 琼脂凝胶免疫扩散试验

　　8.3.1 主要器材

　　8.3.1.1 打孔器 。

　　8.3.2 主要试剂

　　8.3.2.1 菌体抗原，按照 C .5 制备 。

　　8.3.2.2 多杀性巴氏杆菌菌体分型抗血清，1 个~16 个血清型，按照 C .6 制备 。

　　8.3.3 操作程序

　　8.3.3.1 琼脂凝胶平板冷凝后打孔 ，孔径 4 mm，孔距 6 mm，每组 7 孔 ，见附录 D 中图 D .1 。孔内琼脂小心用针头挑出，以防破坏周围琼脂，随后用酒精灯加热封底 。

　　8.3.3.2 中央孔加待检抗原，不同菌体型特异的抗血清加入周边孔内(以加满不溢出为度)。

　　8.3.3.3 加样完毕后，静置 10 min，然后置带盖湿盒中，在 37 ℃恒温培养箱中反应 24 h~72 h，72 h 内观察并判定结果 。

　　6

　　GB/T 27530—2025

　　8.3.4 结果判定

　　将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察，抗原孔与抗血清孔之间出现清晰沉淀线者为多杀性巴氏杆菌阳性 ，未出现沉淀线者为多杀性巴氏杆菌阴性 。根据所用抗原或抗体不同 ，可对待检菌进行荚膜分型或菌体抗原分型 。所有能引起出血性败血症的血清型菌株均能与 2 型抗血清反应，与5 型抗血清也可能发生交叉反应 。沉淀线结果判定见图 D .2。

　　8.4 对流免疫电泳

　　8.4.1 主要器材

　　8.4.1.1 电泳仪 。

　　8.4.2 主要试剂

　　8.4.2.1 对流免疫电泳介质，按照 B .11 配制 。

　　8.4.2.2 巴比妥缓冲液，按照 B .12 配制 。

　　8.4.2.3 琼脂凝胶平板，按照 B .13 制备 。

　　8.4.3 操作程序

　　8.4.3.1 将 12 mL 电泳介质倾注玻板(57 mm×70 mm)，制成琼脂凝胶平板，冷却后使用 。

　　8.4.3.2 按照图 2 所示打孔 ，一排 7 孔 ，孔径 4 mm，孔间距 7 mm，挑去孔内琼脂 ，封底 。另外设一排平行组 。

　　图 2 对流免疫电泳试验抗原、抗体加样孔位置图

　　8.4.3.3 同一组加样孔中 ，阴极端的孔中加入 20 µL 荚膜抗原 ，同时在阳极端的孔中加入等量的抗血清 。对照组分别用 0.85% NaCl 溶液与阳性抗血清配对;荚膜抗原与阴性兔血清配对 。

　　8.4.3.4 电泳槽装满巴比妥缓冲液 ，150 V(25 V/cm)电泳 30 min，观察抗原和抗血清孔之间出现的沉淀线 。

　　8.4.4 结果判定

　　抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为多杀性巴氏杆菌阳性，不出现沉淀线者判为多杀性巴氏杆菌阴性 。根据抗血清的种类，可对待检菌进行多杀性巴氏杆菌的血清型鉴定 。

　　7

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　　9 多重聚合酶链式反应

　　9.1 主要器材

　　9.1.1 PCR 扩增仪 。

　　9.1.2 高速微型离心机 。

　　9.1.3 微量可调移液器(0 .1 μL~2 .5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL)及配套滤芯吸咀 。

　　9.1.4 稳压稳流电泳仪 。

　　9.1.5 水平电泳槽 。

　　9.1.6 凝胶成像仪 。

　　9.2 主要试剂

　　9.2.1 PCR 试剂：TaqDNA 聚合酶 、2.5 mmol/L 的 dNTPs 预混液 、10×PCR 缓冲液 。也可采用商品化的 PCR 扩增试剂盒用于 PCR 反应体系的制备 。

　　9.2.2 TAE 电泳缓冲液：50×TAE，按照 B .14 配制，使用前加蒸馏水配成 1×TAE 缓冲液 。

　　9.2.3 溴酚蓝缓冲液(商品化试剂)。

　　9.2.4 2% 琼脂糖凝胶，按照 B .15 配制 。

　　9.2.5 DNA 分子质量标准(DNA Marker)。

　　9.2.6 阳性对照质粒，参照附录 E 制备 。

　　9.3 引物

　　多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息见附录 F，检测多杀性巴氏杆菌的引物序列按照表 2。

　　表 2 鉴定多杀性巴氏杆菌种、荚膜型 PCR 所用引物信息

　　引物特异性

　　引物名

　　引物序列(5′-3′)

　　扩增片段大小

　　所有 Pm

　　KMT1T7

　　ATCCGCTATTTACCCAGTGG

　　457 bp

　　KMT1SP6

　　GCTGTAAACGAACTCGCCAC

　　荚膜 A 型 Pm

　　RGPMA5

　　AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGA

　　564 bp

　　RGPMA6

　　ATTTGGCGCCATATCACAGTC

　　荚膜 B 型 Pm

　　CapB-F

　　CATTTATCCAAGCTCCACC

　　760 bp

　　CapB-R

　　GCCCGAGAGTTTCAATCC

　　荚膜 D 型 Pm

　　CapD-F

　　TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC

　　657 bp

　　CapD-R

　　CATCTACCCACTCAACCATATCAG

　　荚膜 E 型 Pm

　　CapE-F

　　TCCGCAGAAAATTATTGACTC

　　511 bp

　　CapE-R

　　GCTTGCTGCTTGATTTTGTC

　　荚膜 F 型 Pm

　　CapF-F

　　AATCGGAGAACGCAGAAATCAG

　　851 bp

　　CapF-R

　　TTCCGCCGTCAATTACTCTG

　　8

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　　9.4 操作程序

　　9.4.1 样品 DNA 制备

　　从平板上选择单个菌落，用灭菌接种环，接种至 200 μL 生理盐水中，煮沸 10 min，冰上冷却 3 min~ 5 min，12 000 r/min 离心 30 s，取 2 µL 上清液作为 DNA 模板用于 PCR 扩增(约 0.1 µg/µL)，或使用商品 化 的 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 DNA 作 为 模 板 。 提 取 的 基 因 组 DNA，应 立 即 进 行 PCR 反 应 或 置-20 ℃保存备用 。

　　9.4.2 Pm 种和荚膜分型多重 PCR

　　9.4.2.1 配制 25 μL 反应体系所需试剂如下：

　　——2.5 μL 的 10×PCR Buffer;

　　——5 μL 的 dNTPs(2 .5 mmol/L);

　　——0.25 μL 的 TaqDNA 聚合酶(5 U/μL);

　　——1 μL 的 Pm 荚膜 A 型/B 型/D 型/E 型/F 型的分型特异性引物 F(20 μmol/L);

　　——1 μL 的 Pm 荚膜 A 型/B 型/D 型/E 型/F 型的分型特异性引物 R(20 μmol/L);

　　——1 μL 的 KMT1T7(20 μmol/L);

　　——1 μL 的 KMT1SP6(20 μmol/L);

　　——100 ng 的提取样本的 DNA 模板;

　　——补足双蒸水至 25 μL 。

　　4 000 r/min 离心 20 s 后，置 PCR 扩增仪内进行扩增 。

　　9.4.2.2 设立对照 。进行巴氏杆菌种属鉴定时，阳性对照以携带巴氏杆菌属鉴定靶基因质粒作为模板;进行分型鉴定时 ，分别以携带 5 种多杀性巴氏杆菌靶基因质粒作为模板 ，制备方法见附录 E 。 阴性对照均为不含 DNA 的反应体系 。

　　9.4.2.3 PCR 反 应 程 序 。 94 ℃ 3 min 预 变 性 ;94 ℃ 变 性 30 s，54 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸 1 min，进 行35 个 循 环 的 扩 增 ;72 ℃ 再 延 伸 10 min，4 ℃ 保 存 。 在 退 火 温 度 不 改 变 的 情 况 下 ，也 可 根 据 商 品 化 的PCR 扩增试剂盒中建议的反应程序进行扩增 。

　　9.5 电泳

　　取 PCR 产 物 10 μL 与 适 量 溴 酚 蓝 缓 冲 液 混 合 ，加 样 2% 琼 脂 糖 凝 胶 ，7 μL/孔 ，同 时 ，设 定 2 kb DNA ladder 标准分子质量标准，120 V 稳压电泳 40 min 。置于凝胶成像仪上，观察条带 。

　　9.6 结果判定

　　9.6.1 试验成立条件

　　阳性对照出现约 457 bp 扩增条带且阴性对照不出现条带，试验成立，见附录 G 中图 G .1。

　　9.6.2 判定

　　9.6.2.1 出现 457 bp 左右的目的片段(与阳性对照大小相符)，判为多杀性巴氏杆菌核酸阳性 ;未出现目的片段，判为多杀性巴氏杆菌核酸阴性 。

　　9.6.2.2 同时出现约 457 bp、564 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 A 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性 。

　　9.6.2.3 同时出现约 457 bp、760 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 B 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性 。

　　9.6.2.4 同时出现约 457 bp、657 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 D 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性 。

　　9.6.2.5 同时出现约 457 bp、511 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 E 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性 。

　　9.6.2.6 同时出现约 457 bp、851 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 F 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性 。

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　　GB/T 27530—2025

　　10 综合判定

　　10.1 符合第 5 章，可判为牛出血性败血症疑似病例 。

　　10.2 疑似牛出血性败血症病例经第 7 章分离的多杀性巴氏杆菌 ，经第 8 章任一项或第 9 章 PCR 扩增出 457 bp 的基因片段，可判定为牛出血性败血症 。

　　10.3 经 10.2 判定为牛出血性败血症确诊病例 ，再经 8.2 或 8.3 或 8.4 进行血清型鉴定或经第 9 章进行荚膜分型鉴定 ，可判定为某血清型或荚膜型多杀性巴氏杆菌感染 ;如同时出现几种血清型或荚膜型阳性，可能为混合感染 。

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 A (规范性)

　　培养基的配制

　　A.1 含 5% 血清的 CSY 培养基

　　配制含 5% 血清的 CSY 培养基所需试剂如下：

　　——3 g 水解酪蛋白;

　　——3 g 蔗糖;

　　——5 g 酵母浸膏;

　　——5 g 氯化钠(NaCl);

　　——3 g 无水磷酸氢二钾(K₂HPO₄)。

　　加蒸馏水至 1 000 mL，完全溶解后调节 pH 至 7.3~7.4 后加入琼脂至其终浓度为 1.5%，115 ℃高压灭菌 15 min，冷却至 45 ℃~50 ℃时加入 50 mL 犊牛血清并倾注平皿制成平板培养基 。

　　A.2 TSA 培养基

　　向 8.0 g TSA 中加入 200 mL 蒸馏水 ，搅拌溶解 ，121 ℃高压 20 min，冷却至 50 ℃时加入无菌牛血清混匀后倾注平皿，4 ℃保存备用 。

　　A.3 鲜血琼脂培养基

　　配制鲜血琼脂培养基所需试剂如下：

　　——5 g 牛肉膏;

　　——10 g 蛋白胨;

　　——5 g 氯化钠(NaCl);

　　——1 g 磷酸氢二钾(K₂HPO₄);

　　——25 g 琼脂粉 。

　　先将牛肉膏 、蛋白胨 、氯化钠和磷酸氢二钾溶于蒸馏水 ，调节 pH 至 7.4~7.6，再加入琼脂粉 ，加入蒸馏水定容至 1 000 mL，混匀并高压灭菌后 ，冷却至 50 ℃时加入 50 mL 无菌脱纤家兔鲜血 ，充分混合后倾注平皿制成平板培养基 。

　　A.4 含 5% 血清的 TSB 培养基

　　向 6.0 g TSB 中加入 200 mL 蒸馏水 ，搅拌溶解 ，121 ℃ 高压 20 min，待冷却到 50 ℃ ~60 ℃ , 加入10 mL 无菌牛血清，混匀后分装至无菌试管中使用或 4 ℃保存备用 。

　　A.5 糖发酵管

　　配制糖发酵管所需试剂如下：

　　——10 g 蛋白胨;

　　——5.0 g 牛肉膏;

　　——3 g 氯化钠(NaCl);

　　——2.0 g 十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ ·12H₂O);

　　——12.0 mL 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 。

　　各成分加热溶于 1 000 mL 水中并调节 pH 至 7.4，按 0.5% 的比例加入各种糖，分装于试管，112 ℃高压灭菌 15 min。

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　　GB/T 27530—2025

　　A.6 尿素琼脂

　　配制尿素琼脂所需试剂如下：

　　——10 g 蛋白胨;

　　——5 g 氯化钠(NaCl);

　　——1 g 葡萄糖(C6H12O6);

　　——2 g 磷酸氢二钾(K2HPO4);

　　——0.012 g 酚红;

　　——20 g 琼脂;

　　——100 mL 20% 尿素 。

　　将除尿素以外的成分配好，并调节 pH 至 7.2，定容至 1 000 mL，加热溶化，121 ℃高压灭菌 15 min。冷却至 50 ℃~55 ℃ , 加入经除菌过滤的尿素溶液，混匀，制备成平板或斜面培养基 。

　　A.7 蛋白胨水

　　配制蛋白胨水所需试剂如下：

　　——20 g 蛋白胨(或胰蛋白胨);

　　——5 g 氯化钠(NaCl)。

　　向试剂中加入 1 000 mL 蒸馏水充分溶解，分装小试管，121 ℃高压灭菌 20 min。

　　A.8 硝酸盐培养基

　　配制硝酸盐培养基所需试剂如下：

　　——20 g 蛋白胨;

　　——0.2 g 硝酸钾(KNO3)。

　　向试剂中加入 1 000 mL 蒸馏水充分溶解 ，调节 pH 至 7.4，分装试管 ，每管约 5 mL，121 ℃ 高压灭菌 15 min。

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 B

　　(规范性)

　　试剂溶液及电泳介质的配制

　　B.1 1% 结晶紫染色液

　　配制 1% 结晶紫染色液所需试剂如下：

　　——1 g 结晶紫;

　　——20 mL 95%(体积分数)乙醇(C2H5OH);

　　——80 mL 1% 草酸铵水溶液[(NH4)2C2O4]。

　　将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合 。

　　B.2 革兰氏碘液

　　配制革兰氏碘液所需如下试剂：

　　——1 g 碘(I);

　　——2 g 碘化钾(KI)。

　　将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水定容至 300 mL。

　　B.3 瑞氏染色液

　　配制瑞氏染色液所需如下试剂：

　　——0.1 g 瑞氏色素;

　　——60 mL 甲醇(CH3OH)。

　　向甲醇中加入瑞氏色素，用乳钵研磨溶解 。

　　B.4 印度墨汁染色液

　　配制印度墨汁染色液所需如下试剂：

　　——5 mL 印度墨汁;

　　——20 mL 蒸馏水 。

　　将蒸馏水加入印度墨汁，振荡混匀 。

　　B.5 柯凡克试剂

　　配制柯凡克试剂所需如下试剂：

　　——5 g 对二甲氨基甲醛(C9H11NO);

　　——75 mL 戊醇(C5H12O);

　　——25 mL 浓盐酸(HCl)。

　　将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇，然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。

　　B.6 欧-波试剂

　　配制欧-波试剂所需如下试剂：

　　——1 g 对二甲氨基甲醛(C9H11NO);

　　——95 mL95%(体积分数)乙醇(CH3CH2OH);

　　——20 mL 浓盐酸(HCl)。

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　　GB/T 27530—2025

　　将 1 g 对二甲氨基甲醛溶解于 95 mL95%(体积分数)乙醇，然后缓慢加入浓盐酸 20 mL 。

　　B.7 氧化酶试验试剂

　　配制氧化酶试验试剂所需如下试剂：

　　——1 mL 蒸馏水(H2O);

　　——10 g N，N-二甲基-1，4-苯二胺草酸盐[2(C8H12N2)·C2H2O4]。

　　取 1 mL 蒸馏水于带密封盖离心管中 ，加入 N，N-二甲基-1，4-苯二胺草酸盐约 10 g，盖好密封盖 ，振荡混匀，配制成氧化酶试剂 。试验时现用现配 。

　　警示：N，N ⁃二甲基⁃1，4 ⁃苯二胺草酸盐具有毒性，有害健康。

　　B.8 硝酸盐还原试剂

　　配制硝酸盐还原试剂所需试剂如下：

　　——0.8 g 对氨基苯磺酸(C6H7NO3S);

　　——100 mL 2.5 mol/L 乙酸溶液(CH3COOH);

　　——0.5 g 甲萘胺(C10H9N)。

　　首先将对氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL，配制成甲液 ;然后将甲萘胺 0.5 g溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL，配制成乙液 。

　　B.9 阿氏液(Alsever ’s 液)

　　配制阿氏液所需试剂如下：

　　——2.05 g 葡萄糖(C6H12O6);

　　——0.80 g 柠檬酸钠(C6H5Na3O7);

　　——0.055 g 柠檬酸(C6H8O7);

　　——0.42 g 氯化钠(NaCl)。

　　试剂加蒸馏水至 100 mL，混合过滤，调节 pH 至 6.8，115 ℃灭菌 10 min，4 ℃保存备用 。

　　B.10 0.85% NaCl 溶液

　　将 0.85 g 氯 化 钠(NaCl)加 入 90 mL 去 离 子 水 中 ，充 分 溶 解 ，加 蒸 馏 水 将 溶 液 定 容 至 100 mL， 121 ℃灭菌 30 min，保存于 4 ℃ 。

　　B.11 对流免疫电泳介质

　　配制对流免疫电泳介质所需试剂如下：

　　——2.0 g 琼脂糖;

　　——2.06 g 巴比妥钠(C8H12N2O3);

　　——0.37 g 二乙基巴比妥酸(C8H12N2O3)。

　　用 180 mL 蒸馏水完全溶解上述混合物，然后加入 0.01% 硫柳汞 20 mL 。

　　B.12 巴比妥醋酸盐缓冲液(巴比妥缓冲液)

　　配制巴比妥醋酸盐缓冲液所需试剂如下：

　　——29.24 g 巴比妥钠(C8H12N2O3);

　　——11.70 g 无水醋酸钠(C2H3NaO2);

　　——180 mL 0.1 mol/L 盐酸(HCl)。

　　用蒸馏水充分溶解，调节 pH 至 8.8，加蒸馏水至 3 L 。

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　　GB/T 27530—2025

　　B.13 琼脂凝胶平板

　　取 0 .9 g 优质琼脂加入 90 mL 0.85% NaCl 溶液中，加热溶化后再加入 1% 硫柳汞溶液 1 mL，最后加入适量 0.85% NaCl 溶液定容至 100 mL 。冷却至 45 ℃~50 ℃ , 倾注水平放置的洁净载玻片 、玻璃片或平皿(凝胶厚度为 2.5 mm~ 3 mm)。

　　B.14 TAE 电泳缓冲液(50×TAE)

　　配制 TAE 电泳缓冲液(50×TAE)所需试剂如下：

　　——242 g 三羟甲基甲烷碱(Tris base);

　　——57.1 mL 冰乙酸(CH3COOH);

　　——100 mL 0 .5 mol/L(pH8 .0)乙二胺四乙酸(EDTA)。

　　将试剂完全溶解后 ，加蒸馏水至 1 000 mL，置 4 ℃冰箱中备用 。如配制 2% 的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液时，用蒸馏水稀释 50 倍即为 1×TAE 缓冲液 。

　　B.15 2% 琼脂糖凝胶

　　取 2 g 琼脂糖加入至 100 mL 1× TAE 缓冲液中 ，在微波炉中充分溶解后 ，冷却至 50 ℃~60 ℃ , 加入 5 μL(10 mg/mL)溴乙锭(或相当的其他核酸染料)，混匀后倒入凝胶板(凝胶的厚度为 4 mm);在距离底板 0.5 mm 的位置放置梳子 ，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔 ;待凝胶完全凝固后 ，小心移去梳子;将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约 1 mm 深的足量电泳缓冲液 。

　　B.16 1% 硫柳汞溶液

　　1 g 硫柳汞(C9H9HgNaO2S)溶解于 100 mL 蒸馏水后，置于 100 mL 瓶中盖塞，室温保存 。

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 C

　　(规范性)

　　多杀性巴氏杆菌分型抗原、抗血清及绵羊红细胞的制备方法

　　C.1 荚膜抗原制备

　　取培养 6 h~8h 的参考菌株(待检菌株)肉汤培养物 1 mL 均匀涂布至 CSY 血液琼脂平板上(直径90 mm)，37 ℃ 培 养 过 夜 。用 3 mL 0.85% NaCl 溶 液 洗 下 生 长 物 ，56 ℃ 加 热 30 min，4 ℃ 3 000 g 离 心15 min，收集上清液保存于-20 ℃备用 。若没有冷冻离心机 ，则 1 500 g 离心 30 min，取上清液作为抗原提取物 。

　　C.2 不同荚膜型特异性抗血清的制备和处理

　　C.2.1 制备

　　将 荚 膜 A、B、D、E、F 型 标 准 菌 株 分 别 接 种 于 CSY 血 液 琼 脂 平 板 上 ，37 ℃ 培 养 18 h~20 h，用3 mL 生理盐水洗下生长物 ，菌体悬液浊度调至与布朗氏比浊管的第 4 管相同 。每隔 3 d~4 d，家兔静脉接种悬液一次 ，注射量分别为 0.2 mL、0.5 mL、l.0 mL、1.5 mL 及 2.0 mL 。最后一次注射后 1 周 ，取0.5 mL 相同的活菌悬液 ，皮下或肌肉接种 。 10 d 后采血收集血清 ，保存于-20 ℃ , 而常用的少量血清可加入硫柳汞至 0.01%，4 ℃保存 。

　　C.2.2 处理

　　用 前 将 1 份 压 积 绵 羊 红 细 胞 加 入 3 份 型 特 异 性 抗 血 清 中 ，(24±1)℃ 作 用 30 min，500 g 离 心10 min，去除绵羊红细胞，处理的抗血清经 56 ℃灭活 30 min。

　　C.3 1% 新鲜绵羊红细胞的制备

　　按照 1 ∶1 的比例将阿氏液加入抗凝的绵羊血，经玻璃珠脱纤后加入 6 倍~8 倍体积的 0.85% NaCl溶 液 洗 涤 ，500 g 离 心 收 集 绵 羊 红 细 胞 ，重 复 3 次 ，最 后 一 次 收 集 的 绵 羊 红 细 胞 ，应 恢 复 到 原 血 量 的一半 。取 2 mL 绵羊红细胞，加入 98 mL 0.85% NaCl 溶液，即 1% 新鲜绵羊红细胞悬液 。4 ℃保存，2 d内使用 。

　　C.4 致敏绵羊红细胞的制备

　　取 3 mL 荚膜抗原加入 0.2 mL 新鲜制备的绵羊红细胞 ，充分混匀 ，37 ℃ 振荡 2 h，离心去上清液 ，用 10 mL 0.85% NaCl 溶 液 洗 涤 一 次 ，离 心 悬 浮 于 20 mL 0.85% NaCl 溶 液 ，即 1% 致 敏 绵 羊 红 细 胞悬液 。

　　C.5 菌体抗原制备

　　将细菌接种血液琼脂平板培养 24 h 后 ，用 1 mL 8.5% NaCl 溶液冲洗并收获生长物 。置悬浮液于100 ℃水浴中加热 1 h，离心弃沉淀，取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原 。

　　C.6 菌体分型抗血清的制备

　　12 周龄~16 周龄公鸡颈中部皮下接种 1 mL 油乳菌苗(油乳菌苗制苗菌株选用分离自牛的多杀性巴氏杆菌分离株 ，制备方法见《中华人民共和国兽药典》“禽多杀性巴氏杆菌病油乳剂灭活疫苗”，3 周后胸部肌肉内再接种 1 mL(在胸骨的两侧各接种 0.5 mL)。 1 周后采血，分血清，并加 0.01% 硫柳汞或0.06% 石炭酸防腐保存 。 出现交叉反应的血清应弃去 。

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 D

　　(资料性)

　　琼脂凝胶免疫扩散试验打孔及结果判定示意图

　　D.1 琼脂凝胶免疫扩散试验打孔示意图

　　琼脂凝胶免疫扩散试验使用的琼脂凝胶平板打孔见图 D .1。

　　图 D.1 琼脂凝胶免疫扩散试验打孔示意图

　　D.2 琼脂凝胶免疫扩散试验结果判定示意图

　　琼脂凝胶免疫扩散试验结果判定示意图见图 D .2。

　　图 D.2 琼脂凝胶免疫扩散试验结果示意图

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 E

　　(资料性)

　　PCR 阳性对照的制备

　　E.1 仪器

　　恒温摇床 、制冰机 、PCR 仪 、核酸电泳仪 、凝胶成像仪 。

　　E.2 试剂

　　5 对引物 ，浓度均为 20 μmol/L，包括多杀性巴氏杆菌属鉴定引物(KMT1T7/KMT1SP6)、A 型多杀性巴氏杆菌鉴定引物(RGPMA5/RGPMA6)、B 型多杀性巴氏杆菌鉴定引物(CapB-F/CapB-R)、D型多杀性巴氏杆菌鉴定引物(CapD-F/CapD-R)、E 型多杀性巴氏杆菌鉴定引物(CapE-F/CapE-R)、F

　　型多杀性巴氏杆菌鉴定引物(CapF-F/CapF-R)，商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒 、质粒提取试剂盒 、 pMD-19T 质粒 、大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 、10 mg/mL 氨苄青霉素和 LB 培养基 。

　　E.3 阳性质粒的构建和鉴定E.3.1 PCR 扩增和产物回收

　　以提取的多杀性巴氏杆菌 DNA 为模板 ，分别以多杀性巴氏杆菌种属鉴定引物以及各荚膜型的鉴定 引 物 作 为 扩 增 引 物 ，进 行 PCR 扩 增 ，反 应 体 系 ：DNA 模 板 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)5 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，特异性引物 R 1 μL，特异性引物 F 1 μL，补充蒸馏水至 50 μL 。扩增条件为：94 ℃ 3 min 预变性 ;然后进行 35 个循环的扩增(94 ℃变性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min);最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存 。取 5 μL PCR 产物于 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增获得目的基因片段 。

　　E.3.2 质粒构建及鉴定

　　用 商 品 化 胶 回 收 试 剂 盒 分 别 回 收 纯 化 E .3.1 获 得 的 PCR 产 物 ，将 纯 化 DNA 片 段 分 别 与 pMD- 19T 克隆载体连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂布于含 100 mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基平板上，37 ℃培养 12 h~16h。挑取单一的白色菌落至含有氨苄青霉素的液体培养基中，于 37 ℃、200 r/min振荡培养至 OD600 值(波长 600 nm 处的光密度值)1.0~1.2，取菌液 2 mL~5 mL，利用质粒提取试剂盒提取质粒 ，测序 。将序列测定正确的质粒分别命名为 pMD-19T-457、pMD-19T-564、pMD-19T-760、 pMD-19T-657、pMD-19T-511、pMD-19T-851，作为多杀性巴氏杆菌属以及 5 种多杀性巴氏杆菌荚膜型PCR 阳性对照 。质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20 ℃和-80 ℃ 。

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　　附 录 F

　　(资料性)

　　多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息

　　F.1 检测巴氏杆菌种通用引物扩增序列(457 bp)

　　ATCCGCTATTTACCCAGTGG GGCGGTGCGAATGAACCGATTGCCGCGAAATTGAGT TTTATGCCACTTGAAATGGGAAATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTGGGCTTG TCGGTAGTCTTTTATTTGGCTTGTGGCAAAGAAAAGCACAGTTTTGTTGGGCGGAGTT TGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTA TTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAAT ATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCG GTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAAC GGTTTAATCGTGTCAGTCCAAATGAAACAAAAA GTGGCGAGTTCGTTTACAGC

　　F.2 检测 A 型巴氏杆菌引物扩增序列(564 bp)

　　AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAA AAAAATTAGTACTTTCTGACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAATAAATGGAAATTGCT CACTGAGAAGAAATCTGAAAATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGAT TTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTACCTGATCATGTTAATGATTTTACATGGT ACAAAAAGCGAAAGAAAAGACTTGGCATAAAACCTGAACATCAACATGTTGGTCTTTC TATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCCTGTTTA GTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGG AAGATCTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAG ACAAAAAGATAACGGTTTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGATTACGCTTAGCA AAATATGACTTTATTGGCTTACTCGACTGTGATATGGCGCCAAAT

　　F.3 检测 B 型巴氏杆菌引物扩增序列(760 bp)

　　GCCCGAGAGTTTCAATCCAGTAACTGTTGTGGTAATACATTTTTTCAGAGTTACT CATTTTGTTATAAGGATACTCTTTGTGTCTTTTTAGATTAATCATTAAGGCGTTACAC CAATGTAGGTGTTTTGCCAAAAGCTGTTTAATTGACTCAGGAGAGTAAATTTCTGAAG TATATTTCGCAATTTCCTCATCAAATGTTGAAAAGTCATAAGTATCCTTATGCTCGAT CAGATGATCGCAAGTGTGTTTATCAAAAATACGATAAGCATTTTGCAGATTAAAGCGT GTATAACCTACATCTTCCCAACTACTTACATAGGCATCAATATCACCTAGTGGTGCAA

　　ATTTCTTTTCAAATCTAGGCACAGAATATTCAAAACCCCGTAGCTGGCCACAAATTAA TAGTGCAATTTTTAATGGTTTTTTCTGCAGTAAAGGTGTTGATGGACGTTGTAAAGAC TGAATACGTTTTTCTAAAAATTGGTACTCCGTACTACCTAATGTCAGATGGTGTAATG TTAAGAAGTTTTGGCAAATCTTTCTTTCTTCATCTGAGGACAGCTTTTTACTTTGAGT TAAAGCTTGTAGAAATGTAATGAAAAAAGCGATATCAATCTGCTTAAGATAATTGCTA TCTTTAATGAATAACGCAAATAAATAATTAACGATTTCTAGTTTTACCAAAATAAAGT TCAACTGTGTTTGAGAACACTTTTTTAAAATGAGTAGTATTTCCTCT GGTGGAGCTTG GATAAATG

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　　GB/T 27530—2025

　　F.4 检测 D 型巴氏杆菌引物扩增序列(657 bp)

　　CATCTACCCACTCAACCATATCAGAAAATAATGAATCTTCACGCATTGTGTTATAA TACAGTGGTAGAAATAAGTTATTTATCCTATTTTTACCATAGTATTTAATTATTCTAT GATAAAATTCATCATCCGATGCTTTGGTTGTGCAGTTAAAAAAACCAATTTCATTAAA TACTTTTCTATAAACGCCTAAAGTTATTAATCCTAATTTGTATTTATTATCATTAACT TTTATTATATTTTGTGTTTCTAGATTTATTCTAGAATATGCACATCTAACAGCTATAT TATCTTTATTCGATAATAATGCATTAACACATCTTTCGATTCTTTCATGGTGACATAC ATCATCGCTATCCTGAAAGAAAATAATATCTCCTTTAGACTTTAAAATTCCTGTATTT TTCGCAAAGTATGTCCCTAGATTTGAGTTTAATCGGAATGTTTTTACTTTACTTGTAG AGTTTGCTATTCTGGATGCGATCTGAAATGTTTTATCTGTGCTATAATCATCTACAAC GATAACTTCTAAGTTATTGTATGTTTGCAATAATAGTGAATTAATTGAGGCTTCAATG AATTTTTCTGTATTATGAGAAGTCATTATAATACTGACTAGAGGGGGGGCTCCTAGTC TTTCTTTTGTAA

　　F.5 检测 E 型巴氏杆菌引物扩增序列(511 bp)

　　TCCGCAGAAAATTATTGACTC TCTAGTATCAGGCGTACCTGTAATTTCTACAAGG AATACATATTTAGAAGAAAAATTTAAAGACATCATATTATTTATTGATTCCCCAACTC AACTTCATGAAATTGTAGAAAAATATGAAAATGATCGTTGGGCACATGCTCGCTTAGC GCACAAAGGATATCGATTTGTAATGAATAATTTTTCCACACATAGTCTCAAAGCTAAC TTACAAAGAGAAATATGTGGCAAAGCGATCAATTCAGATAATAATCCCTTGATATCGA TTATTATGGCATCAATGAGAGAATTCTATATAGACAGAATTATTACTAATATTTCTCG TCAAACATATAAAAATAAAGAGCTTATCATTGTTACTCAGAATTTTTCAGAAATAGGA TTAAAAAAACTACAAGAAAAATTAGAAAAAATAGATGACTTGGTTAATTTCAAAATC ATAGTAAATAACTCAGAAGACACTTTAGGAGAAA GACAAAATCAAGCAGCAAGC

　　F.6 检测 F 型巴氏杆菌引物扩增序列(851 bp)

　　AATCGGAGAACGCAGAAATCAGAAAGGTGGAACTAGTACCCAAAGATTTTCCTAA AGATCTTGTTCTTGCTCCATTGCCAGATCATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAT CGAAAAAAAAGCTTAGGTATAAAGCCTGTAAATAAGAATATCGGTCTTTCTATTATTA TTCCTACATTTAATCGTAGCCGTATTTTAGATATAACGTTAGCCTGTTTGGTCAATCA GAAAACAAACTACCCATTTGAAGTCGTTGTTGCAGATGATGGTAGTAAGGAAAACTTA CTTACCATTGTGCAAAAATACGAACAAAAACTTGACATAAAGTATGTAAGACAAAAAG ATTATGGATATCAATTGTGTGCAGTCAGAAACTTAGGTTTACGTACAGCAAAGTATGA TTTTGTCTCGATTCTAGACTGCGATATGGCACCACAACAATTATGGGTTCATTCTTAT CTTACAGAACTATTAGAAGACAATGATATTGTTTTAATTGGACCTAGAAAATATGTGG ATACTCATAATATTACCGCAGAACAATTCCTTAACGATCCATATTTAATAGAATCACT ACCTGAAACCGCTACAAATAACAATCCTTCGATTACATCAAAAGGAAATATATCGTTG GATTGGAGATTAGAACATTTCAAAAAAACCGATAATCTACGTCTATGTGATTCACCGT TTCGTTATTTTAGTTGCGGTAATGTTGCATTTTCTAAAGAATGGCTAAATAAAGTAGG TTGGTTCGATGAAGAATTTAATCATTGGGGGGGCGAAGATGTAGAATTTGGTTACAG

　　ATTATTTGCCAAAGGCTGTTTTTTCAGAGTAATTGACGGCGGAA

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　　GB/T 27530—2025

　　附 录 G

　　(资料性)

　　多杀性巴氏杆菌多重 PCR 阳性扩增参照图

　　多杀性巴氏杆菌多重 PCR 扩增结果见图 G .1。

　　标引序号说明：

　　Marker ——DNA 分子质量标准(DL 2 000 Marker);

　　A 型 ——荚膜 A 型多杀性巴氏杆菌;

　　B 型 ——荚膜 B 型多杀性巴氏杆菌;

　　D 型 ——荚膜 D 型多杀性巴氏杆菌;

　　E 型 ——荚膜 E 型多杀性巴氏杆菌;

　　F 型 ——荚膜 F 型多杀性巴氏杆菌 。

　　图 G.1 多杀性巴氏杆菌多重 PCR 阳性扩增参照图

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　　GB/T 27530—2025

　　参 考 文 献

　　[1] 陆生动物诊断试验和疫苗手册(2022) 世界动物卫生组织

　　[2] 中华人民共和国兽药典

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